Оценка состояния популяционных генофондов виноградной улитки (Helix pomatia L.) урбанизированных территорий с помощью ISSR-маркеров ДНК | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 3 (27).

Оценка состояния популяционных генофондов виноградной улитки (Helix pomatia L.) урбанизированных территорий с помощью ISSR-маркеров ДНК

На основе метода полимеразной цепной реакции с использованием ISSR-маркеров ДНК проанализировано состояние генофондов пяти адвентивных популяций Helix pomatia L. (248 особей), обитающих в условиях урбанизированных территорий юго-восточной части современного ареала. Исследования были проведены в г. Белгороде и его окрестностях, а также в городах Харьков, Киев и Житомир. Согласно полученным данным, в большинстве изученных групп отмечается высокий уровень гетерозиготности (He = 0,273±0,150) и, несмотря на сильную изоляцию адвентивных популяций, степень генетической дифференциации между ними оказалась невысока. Согласно модели М. Неи (1975) индекс дифференциации Gt = 0,166, а средний поток генов Nm = 2,5 особи за поколение. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) также выявил большое сходство между популяциями H. pomatia: Фt = 0,210, Nm = 4,1. Такое генетическое сходство вызвано, вероятно, родственным происхождением или похожими микроклиматическими условиями в городской среде, обусловливающими аналогичные векторы естественного отбора. Это может быть также следствием эффекта «генетической революции», когда в условиях изоляции, т.е. в условиях, в которых сегодня находятся все изучаемые нами популяции H. pomatia, селективную ценность получили одни и те же гены, особенно жизнеспособные в гомозиготном состоянии и редкие в открытых популяциях.

Study of the population gene pool of the Roman snail (Helix pomatia L.) in urban areas using ISSR-DNA markers.pdf Введение Данная работа посвящена изучению популяционной структуры виноградной улитки (Helix pomatia Linnaeus, 1758), которая является одним из самых крупных наземных моллюсков Европы. Исходный ареал этого вида приходится на Среднюю и Юго-Восточную Европу, однако в настоящее время, благодаря интродукции, виноградная улитка успешно освоила западные районы Белоруссии, Украину, Прибалтику, включая г. Калининград [1, 2]. Кроме того, моллюск был отмечен в таких городах, как Санкт-Петербург, Курск, Москва, Харьков и др. [3-5]. Есть информация об интродукции H. po-matia на территории Финляндии [6] и США [7]. Такое искусственное расселение объясняется тем, что виноградная улитка издавна считалась ценным пищевым объектом, в связи с чем на территориях, ранее представлявших собой частные парки, поместья, усадьбы и т.п., проводились зачастую успешные попытки акклиматизации H. pomatia с целью введения вида в культуру. Возникшие изолированные адвентивные популяции в настоящее время стали хорошими моделями для изучения эволюционных процессов, происходящих в урбанизированных ландшафтах. В наших предыдущих исследованиях популяционная структура этого вида была изучена с помощью анализа конхиологических признаков и алло-зимов [8, 9]. Но использование этих маркеров генетической структуры имеет ряд ограничений. Во-первых, морфометрические параметры раковины у этого моллюска не дискретны и подвержены модификационной изменчивости, что не позволяет проследить за генетическими процессами, протекающими в исследуемых группах. Во-вторых, известно, что белковые маркеры отражают изменчивость только в кодирующей части генома, которая по разным оценкам составляет около 10% от общего количества ДНК, а остальная, так называемая «молчащая» ДНК, остается вне поля зрения. В связи с этим дальнейший анализ состояния популяционных генофондов H. pomatia был проведен нами на основе ISSR--маркеров ДНК, применение которых основано на использовании одного праймера, имеющего множественные комплементарные участки, разбросанные по всему геному. Цель работы: на основе межмикросателлитных маркеров ДНК (ISSR) оценить состояние генофондов адвентивных популяций H. pomatia, обитающих в условиях урбанизированных территорий юго-восточной части современного ареала. Материалы и методики исследования Материалом для исследования послужили образцы тканей особей H. pomatia, хранящиеся в криобанке, созданном при лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ «БелГУ». Выборки из популяций были сделаны во время экспедиций в период с 2010 по 2013 г. Моллюсков собирали вручную с поверхности почвы, со стеблей и листьев растений, иногда в подстилке. Чтобы избежать умерщвления особей, для анализа были взяты небольшие образцы ткани ноги животных. Всего было исследовано 248 особей из пяти популяций H. pomatia (табл. 1). Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции - методы ISSR (Inter simple sequence repeats) [10]. Для анализа использовали два праймера (табл. 2). Амплификацию осуществляли в тер-моциклерах MJ Mini и MyCycler (Bio-Rad, USA). Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ р-меркаптоэтанола, 7 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl2), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единицу Taq ДНК полимеразы (ингиби-рованной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин / 94°С, 40 циклов (денатурация - 30 с / 94°С, отжиг праймера - 30 с / 55°С, синтез - 2 мин / 72°С), дополнительный синтез - 10 мин / 72°С, охлаждение до 4°С. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле с использованием ТАЕ буфера (охлажденного до +4°С), 100 В - 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием. Т а б л и ц а 1 / T a b l e 1 Описание пунктов сбора / Description of collection points Пункт / Point Описание биотопа / Description of biotope Координаты / Coordinates 1. Белгород / Belgorod г. Белгород (Россия), ивовый лес в пойме р. Везёлка, вблизи от комплекса зданий НИУ БелГУ, вдоль ул. Левобережная / Belgorod city (Russia), willow forest in the floodplain of the river Vezelka, near Belgorod state university, along Levoberegnaia street 50°35'39.1" c. ш. / north 36°34'04.49" в. д. / east 2. Майский / Maisky Белгородский район, пос. Майский (Россия). Лесополоса между пшеничным полем и трассой Белгород - Харьков напротив Белгородской сельскохозяйственной академии / Belgorod region, settlement Maisky (Russia). Forest belt between the wheat field and Belgorod-Kharkov highway, opposite Belgorod Agricultural Academy 50°31'28.65" c. ш. / north 36°27'10.69'' в. д. / east 3. Харьков / Kharkov г. Харьков (Украина), городской парк им. Т.Г. Шевченко, пойма р. Лопань / Kharkov city (Ukraine), T.G. Shevchenko city park, the Lopan' river floodplain 50°00'15.72" c. ш. / north 36°13'31.31" в. д. / east 4. Киев / Kiev г. Киев (Украина), ботанический сад им. А.В. Фомина / Kiev city (Ukraine), A.V. Fomin Botanical Garden 50°24'52.38" c. ш. / north 30°33'29.29" в. д. / east 5. Житомир / Zhitomir г. Житомир (Украина), лесопарковая зона поймы реки Тетерев, на противоположной стороне реки городской парк культуры и отдыха им. Ю.А. Гагарина / Zhitomir city (Ukraine) Parks floodplain, on the opposite side of the Teterev river, Yuri Gagarin city recreation park 50°14'19.27" c. ш. / north 28°40'07.79" в. д. / east По электрофореграммам амплифицированных фрагментов составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие - «0» (аллель q). У данного вида в диапазоне от 3 тыс. п. о. до 200 п.о. нами обнаружено 18 локусов с использованием праймера SAS1 и 12 локусов с использованием праймеров и UBC 827. Обработка полученных данных проводилась с применением программ GenAlEx [11], POPGENE 32 [12], MEGA5 [13], StatSoft STATISTICA 6.0. Т а б л и ц а 2 / T a b l e 2 Характеристика используемых праймеров / Characteristics of used primers Обозначение праймера / Primer designation Нуклеотидная последовательность / Nucleotide sequence Количество локусов/ Number of loci UBC 827 54ACXG-3' 12 SAS 1 5'- (GTG)4GC-3' 18 Результаты исследования и обсуждение Одним из ключевых моментов в описании популяционной структуры вида является оценка уровня внутрипопуляционного и межпопуляционного генетического разнообразия, а также выяснение степени дифференциации популяций. На рис. 1 приведены данные об уровне ожидаемой гетерозиготности 30 выявленных локусов. Результаты демонстрируют, что наиболее изменчивыми являются локусы SAS1-4, -5, -6, а также UBS827-7. Самыми моно-морфными оказались низкомолекулярные локусы SAS1-18, UBS827-11, -12. При этом средние уровни ожидаемой гетерозиготности, вычисленные по отдельным праймерам, достоверно не отличаются друг от друга: по SAS1 Не = 0,269±0,016; по UBS827He = 0,279±0,043. Показатели генетической изменчивости, а также графические полигоны исследуемых популяций приведены в табл. 3 и на рис. 2. Согласно полученным данным в большинстве изученных популяций отмечается довольно высокий уровень гетерогенности. Из всех групп наиболее мономорфной оказалась популяция из пос. Майский. Это явление можно объяснить двумя причинами. С одной стороны, данная группа, находясь на границе агроланд-шафта и оживленной автомобильной трассы, систематически подвергается действию пестицидов и выхлопных газов. В результате она чаще других групп могла проходить через эффект так называемого «бутылочного горлышка», что в конечном итоге привело к потере генетического разнообразия [14]. С другой стороны, в таких жестких условиях, вероятно, действует стабилизирующий отбор, приводящий к гомозиготности по определенным локусам, обеспечивающим устойчивость организмов к действию токсинов. Подобное явление мы наблюдали ранее при изучении популяций кустарниковой улитки (Bradybaena fruticum), обитающих в условиях влияния горнообогатительных комбинатов [15]. Построенные полигоны Дебеца (рис. 2) и результаты кластерного анализа на основе генетических расстояний [16] невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA, рис. 3) демонстрируют, что популяция из пос. Майский (2) явно дистанцируется от остальных групп. 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Локусы Рис. 1. Уровни ожидаемой гетерозиготности ISSR локусов H. pomatia / Fig. 1. Levels of expected heterozygosity ISSR of loci H. pomatia Т а б л и ц а 3 / T a b l e 3 Усредненные по совокупности ДНК-локусов меры генетической гетерогенности Не в популяциях H. pomatia / Genetic heterogeneity measures in populations of H. pomatia averaged on the basis of DNA-loci Пункт / Point N P%0 A Ae Не 1. Белгород / Belgorod 61 96,67 1,967 ±0,183 1,485 ±0,273 0,465 ±0,180 0,303 ±0,136 2. Майский / Maisky 67 66,67 1,667 ±0,479 1,292 ±0,357 0,267 ±0,277 0,174 ±0,194 3. Харьков / Kharkov 59 96,67 1,967 ±0,183 1,528 ±0,267 0,490 ±0,176 0,324 ±0,133 4. Киев / Kiev 28 93,33 1,933 ±0,254 1,381 ±0,272 0,397 ±0,191 0,250 ±0,141 5. Житомир / Zhitomir 33 93,33 1,933 ±0,254 1,516 ±0,283 0,477 ±0,193 0,314 ±0,144 Среднее / Average 89,33 ±5,71 1,893 ±0,271 1,440 ±0,290 0,419 ±0,203 0,273 ±0,150 Примечание. N - количество проанализированных особей; P% - процент полиморфных локусов; А - среднее число аллелей на локус; Ae - эффективное число аллелей; Ih -индекс Шеннона; He - ожидаемая гетерозиготность. Note: N - number of analyzed individuals; P% - percentage of polymorphic loci; A - mean number of alleles per locus; Ae - effective number of alleles; Ish - Shannon index; He -expected heterozygosity. НЙ1ВИК Белгород Майский Харьков Киев Житомир Рис. 2. Полигоны Дебеца, построенные по совокупности частот д-аллеля 30 локусов ДНК в популяциях H. pomatia / Fig. 2. Debets site, built on the basis of q-allele frequencies of 30 DNA loci in populations of H. pomatia (Belgorod, Maisky, Kharkov, Kiev, Zhitomir) + + + 0.10 0.08 0.06 0.04 Генетическое расстояние D 0.02 0.00 Рис. 3. Дендрограмма генетических расстояний по Неи [14] (UPGMA) между популяциями H. pomatia / Fig. 3. Dendrogram of genetic distances according to Nei [14] (UPGMA) between populations of H. pomatia (on the abscissa axis - Genatic distance D) При этом другие популяции показывают определенное сходство генетической структуры в зависимости от географического расстояния. Так, группа «Харьков» оказалась наиболее близкой (генетически и географически) к группе «Белгород», а популяция «Житомир» - к группе «Киев». Тем не менее, несмотря на определенную оригинальность, все изучаемые группы демонстрируют высокую генетическую близость. Так, оценка степени дифференциации популяций H. pomatia на основе модели, предложенной М. Неем [17], показала низкую генетическую разобщенность изучаемых групп (G = 0,166, табл. 4). При этом средний поток генов оказался больше единицы (Nm = 2,519). Согласно «теории эволюции со смещающимся равновесием» [20] для поддержания панмиксии в метапопуляции требуется поток генов 1-2 особей за поколение. Известно, что средние величины Gst соответствуют уровню генетической дифференциации при селективно-нейтральном процессе. В таком случае локусы с большими значениями Gst вероятнее всего испытывают действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подраз-деленности подвержены влиянию стабилизирующего отбора [18]. Согласно полученным данным, наибольшая дифференциация между популяциями зафиксирована по локусам SAS1-12, -14, -17, а наименьшая - UBC 827-1, -9, -11. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) [19] также выявил большее сходство между популяциями H. pomatia (табл. 5). Только 21% изменчивости приходится на межпопуляционные различия, при этом индекс дифференциации Ф = 0,210, а средний поток генов Nm = 4,1 особи за поколение. Разумеется, подобное генетическое сходство вряд ли можно объяснить интенсивным обменом генетической информацией между изучаемыми популяциями. Причина кроется либо в сходном происхождении групп (т.е. улитки могли быть завезены человекам в эти населенные пункты из какого-то одного источника), либо, что более вероятно, сходными микроклиматическими факторами, характерными для городских условий юго-восточной части Европы. Эти факторы могли привести к отбору одних и тех же аллелей и их комбинаций в разных популяциях. Т а б л и ц а 4 / T a b l e 4 Показатели генетической дифференциации популяции H. pomatia (по Nei [15]) / Genetic differentiation of populations of H. pomatia (by Nei [15]) Праймер / Primer Локус/ Locus Ht Hs Gst Nm 1 0,187 0,178 0,048 10,035 2 0,270 0,252 0,068 6,888 3 0,303 0,287 0,055 8,664 4 0,375 0,357 0,048 9,929 5 0,449 0,339 0,244 1,547 6 0,409 0,341 0,166 2,520 7 0,290 0,273 0,056 8,359 8 0,444 0,311 0,299 1,174 SAS 1 9 0,304 0,283 0,070 6,641 10 0,271 0,242 0,105 4,271 11 0,472 0,311 0,340 0,970 12 0,496 0,295 0,405 0,733 13 0,435 0,323 0,257 1,447 14 0,488 0,288 0,410 0,721 15 0,201 0,172 0,145 2,960 16 0,449 0,276 0,385 0,798 17 0,434 0,242 0,443 0,630 18 0,081 0,079 0,026 18,935 1 0,141 0,139 0,009 52,685 2 0,331 0,303 0,083 5,521 3 0,365 0,348 0,047 10,064 4 0,386 0,379 0,019 25,258 5 0,403 0,388 0,036 13,457 UBC827 6 0,373 0,363 0,028 17,712 7 0,449 0,434 0,035 13,985 8 0,381 0,360 0,056 8,473 9 0,361 0,359 0,005 92,052 10 0,270 0,267 0,014 36,151 11 0,010 0,010 0,009 56,057 12 0,000 0,000 **** **** Среднее / Average 0,328±0,018 0,273±0,011 0,166 2,519 Примечание. Gst- доля межпопуляционного генного разнообразия в общем разнообразии; НТ - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов во всей популяции; Hs - среднее для всех субпопуляций значение внутрипопуляционного разнообразия; Nm - средний поток генов за поколение / Note: Gst - share of interpopulation genetic diversity in the total diversity; НТ- the expected proportion of heterozygous genotypes in the general population; Hs - the average value for all subpopulations of intra-population diversity, Nm - average gene flow per generation. Т а б л и ц а 5 / T a b l e 5 Значения молекулярной дисперсии (AMOVA) по ДНК-локусам в популяциях H. pomatia / Values of molecular variance (AMOVA) for DNA loci in populations of H. pomatia Число Источник изменчивости / степеней свободы / The number of degrees of freedom (df) Сумма квадратов / Sum of squares (SS) Средний квадрат / Mean square (MS) Дисперсия / Variance % Ф, st P Nm Variability source (V) Между популяциями / Between populations 4 278,437 69,609 1,337 21 Внутри популяций / Within populations 243 1218,631 5,015 5,015 79 0,210 0,010 4,100 Итого / In total 247 1497,069 74,624 6,352 Еще одно объяснение такой слабой генетической дифференциации между популяциями H. pomatia связано с тем, что все изученные группы являются адвентивными и существуют в изолированном состоянии. Это явление могло спровоцировать так называемый эффект «генетической революции», который описан для узколокальных изолированных групп [14]. Согласно данной гипотезе, в условиях изоляции, т.е. в условиях, в которых сегодня находятся все изучаемые нами популяции H. pomatia, селективную ценность получают гены, которые особенно жизнеспособны в гомозиготном состоянии и редки в открытых популяциях из-за доминирования в них так называемых «хорошо смешивающихся генов». Попав в условия иной генетической среды, так называемые «солисты» оказались в более выгодном положении. Причем, по мнению Майра, этот процесс мог затронуть одновременно большое количество локусов. Не исключено, что все вышеуказанные факторы могли действовать одновременно, что привело к определенному сходству между довольно удаленными друг от друга популяциями H. pomatia. Заключение Таким образом, полученные данные показывают высокую генетическую изменчивость изучаемых групп Helix pomatia и демонстрируют определенное сходство векторов естественного отбора, присутствующих в популяциях виноградной улитки урбанизированных территорий, что, вероятно, вызывает определенные сходные реакции популяционных генофондов. Тем не менее антропогенное воздействие может снизить уровень генетического разнообразия в адвентивных популяциях, что в конечном итоге может привести к вымиранию групп. Стоит отметить также, что представленные результаты можно считать отправной точкой для дальнейшего мониторинга этого вида в районе исследования с целью выяснения особенностей эволюционных процессов, происходящих в его популяциях.

Ключевые слова

the urbanized landscape, population gene pool, PCR, terrestrial mollusks, наземные моллюски, популяционный генофонд, урбанизированный ландшафт, ПЦР

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Снегин Эдуард АнатольевичБелгородский государственный Национальный исследовательский университетд-р биол. наук, доцент, зав. кафедрой биоценологии и экологической генетики биолого-химического факультетаsnegin@bsu.edu.ru
Артемчук Олеся ЮрьевнаБелгородский государственный Национальный исследовательский университетаспирант кафедры биоценологии и экологической генетики биолого-химического факультетаris-med@yandex.ru
Всего: 2

Ссылки

Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред. Ю.П. Алтухова. М. : Наука, 2004. 619 с.
Wright S. Random drift and shifting balance theory of evolution // Mathematical Topics in Population Genetics. Berlin: Springer Verlag, 1970. P. 1-31.
Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data // Genetics. 1992. № 131. Р. 479-491.
Nei M. Molecular population genetics and evolution. Amsterdam, 1975. 278 p.
Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. Vol. 89. P. 583-590.
Майр Э. Зоологический вид и эволюция. М. : Мир, 1968. 398 c.
Снегин Э.А. Оценка состояния популяционных генофондов наземных моллюсков в условиях влияния горно-обогатительных комбинатов на примере Bradybaena fruticum Mull (Gastropoda, Pulmonata) // Экологическая генетика. 2010. Т. VIII, № 2. С. 45-55.
Yeh F.C., Yang R., Boyle T.J., Ye Z., Xiyan J.M. POPGENE 32, Microsoft Window-based Freeware for Population Genetic Analysis, Version 1.32; Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta: Edmonton, Canada. 2000. URL: http://www.ualberta. ca/~fyeh/popgene_download.html
Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx V5: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and reseach. Australion National University, Canberra, Australia. 2001. URL: http://www.anu.edu.au./BoZo/GenAlEx
Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. 2011. URL: http://www. kumarlab.net/publications
Снегин Э.А. Анализ жизнеспособности популяций особо охраняемых видов на приме ре Helix pomatia L. (Mollusca, Gastropoda, Pulmonata) // Теоретическая и прикладная экология. 2010. № 2. С. 91-96.
Артемчук О.Ю., Снегин Э.А. Морфогенетический анализ популяций Helix pomatia L. в условиях лесостепи Среднерусской возвышенности // Структурные и функциональные изменения в популяциях и сообществах на территориях с разным уровнем антропогенной нагрузки : материалы XII научно-практической экологической конференции / под ред. А.В. Присного. Белгород : ИД «Белгород», 2012. С. 12-13.
Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. Vol. 20, № 2. P. 176-181.
DeesL.T. Edible land snails in the United States / U.S. Fish and Wildlife Service, Bureau of Sport Fisheries and Wildlife. Resource Publication 91. 1970. 8 p.
Белецкий П. Материалы к познанию фауны моллюсков России. Моллюски кл. Gastropoda Харьковской губернии // Труды Харьковского общества испытателей природы. 1918. № 49. С. 31-42.
Лихарев И.М., Раммельмейр Е.С. Наземные моллюски фауны СССР // Определители по фауне. М. ; Л., 1952. Вып. 43. 512 с.
Jarvinen O., Sisula H., Varvio-Aho S.-L., Salminen P. Genetic variation in isolated marginal populations of the Roman snail Helix pomatia L. // Hereditas. 1976. Vol. 82. P. 101-110.
Румянцева Е.Г., Дедков В.П. Биология размножения виноградной улитки Helix pomatia L. в Калининградской области // Ruthenica. 2005. Т. 15, № 2. С. 131-138.
Величковский В. Моллюски. Очерк фауны Валуйского уезда Воронежской губернии. Харьков, 1910. Вып. 6. 111 с.
Стародубцева Е.Г., Дедков В.П. Виноградная улитка Helix pomatia L.: распростране ние по территории Калининградской области, распределение по биотопам и оценка численности // Вестник Калининградского государственного университета. Серия Экология региона Балтийского моря. 2003. Вып. 1. С. 82-87.
 Оценка состояния популяционных генофондов виноградной улитки (<i>Helix pomatia</i> L.) урбанизированных территорий с помощью ISSR-маркеров ДНК | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 3 (27).

Оценка состояния популяционных генофондов виноградной улитки (Helix pomatia L.) урбанизированных территорий с помощью ISSR-маркеров ДНК | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 3 (27).