Морфофизиологические и биохимические характеристики растений картофеля, экспрессирующих ген SUC2 инвертазы Saccharomyces cerevisiae, при выращивании in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 4 (28).

Морфофизиологические и биохимические характеристики растений картофеля, экспрессирующих ген SUC2 инвертазы Saccharomyces cerevisiae, при выращивании in vitro

Исследовано влияние экспрессии целевого гена suc2, кодирующего внеклеточную инвертазу дрожжей Saccharomyces cerevisiae (апопластный вариант локализации фермента), на морфофизиологические и биохимические показатели трансформированных растений картофеля в процессе их роста и развития в условиях in vitro. По сравнению с контрольными (нетрансформированными) растениями картофеля (Solanum tuberosum L., cv. Desiree) трансформанты в период выращивания на среде Мурасиге и Скуга, содержавшей 2% сахарозы, более активно поглощали из питательной среды осмотически активные соединения (главным образом, сахарозу). Хроматографический анализ показал преобладание в листьях исследуемых растений метаболически активных форм сахаров: глюкозы и фруктозы, а также сахарозы. Повышенная активность кислой инвертазы у трансформантов, по сравнению с контролем, способствовала большему накоплению сахаров в апопласте (фруктозы), листьях (глюкозы, сахарозы) и особенно в корнях (глюкозы). Установлен ростингибирующий эффект сахаров - трансформанты обладали пониженными ростовыми и весовыми параметрами (длина побега, число междоузлий, свежая масса корней и листьев) и большей обводненностью тканей. Морфометрические и физиолого-биохимические различия между линиями обсуждаются с позиции физиологической роли сахаров и апопластной инвертазы в процессах роста и развития растений.

Morphological and biochemical characteristics of potato plants expressing the invertase gene SUC2 from Saccharomyces cer.pdf Введение Картофель (Solanum tuberosum subsp. tuberosum) является важнейшей пищевой и технической культурой не только в нашей стране, но и во всем мире. В настоящее время его выращивают более чем в 100 странах мира, однако примерно 40% мирового производства сосредоточено в Индии, Китае и Российской Федерации. В процессе вегетации картофель способен накапливать вирусную инфекцию, резко снижающую урожайность клубней. Однако в мире существует система безвирусного семеноводства, основанная на получении в условиях in vitro безвирусных растений и клубневого потомства [1-3]. Увеличение количества оздоровленного материала осуществляется через оптимизацию условий микроразмножения растений [4], в том числе углеводного состава среды выращивания [5]. При приготовлении питательных сред для микроклонального размножения растений в качестве углеводного компонента чаще всего применяют дисахарид сахарозу в концентрации 2-4%. Это связано с тем, что in vivo именно сахароза является преобладающей транспортной формой сахаров во флоэме. Однако в клетках растений сахароза не может быть использована непосредственно для обменных процессов. Предварительно молекула сахарозы должна вступить в необратимую реакцию гидролиза, которую катализирует, в частности, ключевой фермент углеводного метаболизма Р-Фруктофуранозидаза (инвертаза, К.Ф. 3.2.1.26) с образованием двух нефосфорилированных молекул гексоз -глюкозы и фруктозы. В растениях идентифицированы следующие формы фермента: 1) кислая растворимая инвертаза, локализованная в вакуоли (вакуолярная инвертаза); 2) кислая нерастворимая инвертаза, находящаяся в апопласте (апопластная инвертаза); 3) щелочная или нейтральная инвертаза, представленная растворимыми белками, локализованными в цитоплазме (в основном), а также в митохондриях и ядре (цитоплазматическая инвертаза) [6, 7]. Инвертаза задействована в модификации внутриклеточного состава и соотношения растворимых сахаров в различных компартментах клетки, обеспечении гексо-зами энергетических процессов роста и развития растений [6]. Принимая во внимание непосредственный контакт корневой системы пробирочных растений с питательной средой, можно сказать, что важное значение имеет апопластная инвертаза, катализирующая гидролиз сахарозы, находящейся в свободном пространстве клеток (апопласте) [3]. Полагают, что основными функциями апопластной инвертазы являются контроль уровня сахарозы в апопласте, транспорта сахарозы через плазмалемму, а также регуляция фло-эмной разгрузки [6]. Установлено, что в условиях in vivo изменение активности апопластной инвертазы и, как следствие, внутриклеточной концентрации растворимых сахаров у растений оказывает влияние на экспрессию генов, задействованных в усилении/ослаблении пути биосинтеза белков, липидов, органических кислот и других метаболитов [8]. В связи с этим научный интерес представляет линия растений картофеля с модифицированным углеводным метаболизмом, вызванным интеграцией в геном целевого гена suc2, кодирующего инвертазу Saccharomyces cerevisiae и находящегося под контролем промотора пататина В33 класса 1 (апопластный вариант локализации фермента). Использование гена suc2 в качестве целевого обусловлено тем, что инвертаза дрожжей чужеродна для картофеля, в связи с чем ее активность не подавляется растительными ингибиторами [9]. Кроме того, по сравнению с растительными инвертазами оптимум активности инвертазы S. cerevisiae находится в более широком диапазоне рН. Интересы ученых, работавших с этой линией картофеля, были направлены на изучение функциональной активности кодируемого геном suc2 белка инвертазы в условиях гетерологичной экспрессии и вызываемых им изменений в углеводном метаболизме и процессе клубнеобразования. Установлено, что растения, трансформированные геном инвертазы дрожжей, по сравнению с контрольными (нетрансформированными) растениями, имели сниженный порог концентрации (1-2%) сахарозы, необходимой для инициации клубнеобразования in vitro [10], повышенную активность кислых инвертаз и более высокое содержание сахаров (преимущественно глюкозы) в клубнях [11, 12]. Листья трансформантов характеризовались низкой скоростью фотосинтеза [13], высокой активностью кислых инвертаз, повышенным содержанием сахаров и пониженной чувствительностью к гипотермии [14-16] и окислительному стрессу, вызванному паракватом [17]. Мы предположили, что вызванные деятельностью дополнительной апопластной инвертазы дрожжей изменения состава внутриклеточных сахаров должны отразиться на росте и развитии трансформантов картофеля в условиях in vitro. В связи с этим цель данного исследования состояла в изучении влияния конститутивной экспрессии целевого гена suc2 инвертазы дрожжей S. cerevisiae (апопластный вариант локализации фермента) на некоторые морфофизиологические и биохимические показатели трансформированных растений картофеля, выращиваемых в условиях in vitro. Материалы и методики исследования Объектом исследования служили растения картофеля среднеспелого сорта Дезире (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) (далее обозначены как WT-растения) и созданная на их основе линия, трансформированная вектором, содержащим ген suc2, находящийся под контролем ЙЗЗ-промотора пататина класса 1 (далее обозначены как В33-шу-растения). При конструировании трансгена использовался фрагмент Asp718/SaH из PI-3-INV плазмиды, содержащий ген suc2 дрожжей S. cerevisiae, кодирующий зрелый белок инвертазы, соединенный с последовательностью сигнального пептида ингибитора протеиназы II картофеля, обеспечивающей апопластную локализацию фермента [9]. Поскольку пататин класса 1 - главный запасной белок в клубнях картофеля, то В33 промотор осуществлял преимущественно клубнеспеци-фичную экспрессию контролируемого им гена [18]. Определение активности В33-промотора в различных вегетативных органах трансформированных растений картофеля подтвердило его высокую тканеспецифичность, но также выявило ограниченную активность пататинового промотора в корнях и листьях [14, 19]. Растения-регенеранты были селектированы на среде Мурасиге и Скуга [20], содержащей канамицин, и проверены на экспрессию трансгена методом Northern блот-гибридизации в Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology (Potsdam-Golm, Германия) [12, 21]. Наши последующие эксперименты подтвердили активную экспрессию целевого гена suc2 в геноме В33-inv-растений и показали, что синтезируемый им белок инвертазы дрожжей S. cerevisiae, благодаря наличию лидерного пептида ингибитора протеиназы II картофеля, транспортируется в апопласт, присутствует в этом компар-тменте в растворимой форме, слабо адсорбируясь на клеточной стенке, и проявляет высокую ферментативную активность [13-16, 22]. Растения картофеля размножали микрочеренкованием на стеблевые черенки с одной пазушной почкой и листом и выращивали в жидкой питательной среде на фильтровальных мостиках в пробирках (диаметр 13 мм), уплотненных ватно-марлевыми пробками, в камере Фитотрона ИФР РАН при температуре 22°С и 16-часовом световом дне при освещённости 100 цмоль квантов/м2с (лампы L80W OSRAM, Россия) в течение 4-5 недель. Каждая пробирка содержала один стеблевой черенок и 9,0 мл питательной среды. Для размножения растений использовали безгормональную питательную среду на минеральной основе по прописи Мурасиге и Скуга (далее МС-среда), дополненную 2% сахарозы и витаминами Вр В6 (по 0,5 мг/л) и инозитом (60 мг/л), рН 5,8. Для скрининга питательных сред, оптимальных для роста и развития В33-шу-растений, также использовали МС-среду, дополненную 2% глюкозы или 2% фруктозы. Материалом для биохимических исследований служили жидкая питательная среда, корни растений и листья из среднего яруса побега. Осмоляльность питательной среды измеряли криоскопическим методом, используя осмометр Osmomat 030 «Gonotec» (Германия). Метод основан на понижении точки замерзания растворов по сравнению с точкой замерзания чистого растворителя. Объем одной пробы питательной среды составлял 50 мкл, биологическая повторность 4-кратная. Полученные значения переводили в осмотический потенциал (Y , МПа) согласно уравнению регрессии: Y = 0,0024 х x + 0,0105, где x - осмоляльность, мОсмоль/кг [23]. осм ' ' ' ' L J Выделение различных фракций инвертаз из корней и листьев проводили, как описано ранее [14]. Об активности фермента судили по количеству глюкозы, образовавшейся при гидролизе сахарозы в инкубационной среде, содержавшей 0,2 мл фракции фермента и 0,3 мл буфера с сахарозой (конечная концентрация сахарозы составляла 150 мМ). Для определения активности кислой (вакуолярной или апопластной) инвертазы инкубационная среда включала ацетатный буфер (pH 4,7), а для определения активности щелочной/нейтральной (цитоплазматической) инвертазы - фосфатно-цитратную буферную смесь (рН 7,5). Активность фермента выражали в мкмоль глюкозы, образовавшейся при гидролизе сахарозы в инкубационной среде за 1 час в расчете на объём навески, взятой для анализа. Апопластную жидкость из листьев получали по методу Hon et al. [24]. Для этого навеску листьев без черешков массой 0,8-1,0 г отделяли от 10-16 растений и помещали в пробирку с 30 мл 20 мМ фосфатного буфера (pH 4,94), дополненного 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитола и 0,1 мМ фенилметилсуль-фонил флуорида. С помощью вакуумного насоса проводили инфильтрацию. Под действием создаваемого насосом вакуума воздух удалялся из внутренних полостей листьев, а после выравнивания атмосферного давления межклетники заполнялись буферным раствором. После инфильтрации листья подсушивали, располагая между листами фильтровальной бумаги, и помещали в пробирку с отверстием на дне, которую, в свою очередь, размещали внутри цетрифужной пробирки большего диаметра. Центрифугирование проводили при 1500g в течение 15 мин. Режим центрифугирования был подобран в предварительных опытах и гарантировал отсутствие цитоплазма-тического загрязнения в апопластной жидкости. Качественный состав углеводов в листьях определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Кристалл 5000.1 фирмы «Хроматек» (Россия), получая из лиофильно высушенного экстракта триметилсилильные производные сахаров [25]. В качестве внутреннего стандарта использовали а-метил^-маннозид («Merck», Германия). В работе применяли капиллярную колонку ZB-5, 30 м, 0,32 мм, 0,25 мкм фирмы «Phenomenex» (США) и температурную программу от 130 до 270°С со скоростью 5-6 град/мин. В качестве метчиков использовали D-фруктозу, D-глюкозу, D-инозит, D-сахарозу, D-раффинозу фирмы «Sigma» (США). Содержание фруктозы определяли по методу Рое, основанному на реакции кетоз с резорцином, с последующим пересчётом содержания сахарозы [26]. Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом, используя набор реагентов «Агат-глюкоза» (ООО «Агат-Мед», Россия). Статистическую обработку данных проводили в программе T-tests («ISI», США) и визуализировали при помощи графического математического пакета Microcal Origin («Microcal Software Inc.», США). На рисунках и в таблицах представлены среднеарифметические значения типичного опыта и их стандартные ошибки. В работе обсуждаются различия, статистически значимые при 95%-ном уровне. Результаты исследования и обсуждение Культивируемые in vitro растения картофеля находятся в строго контролируемых по параметрам внешней среды условиях и представляют удобную модель для научных исследований, в силу возможности направленной модификации факторов выращивания. Установлено, что качественный и количественный состав компонентов, входящих в питательную среду, напрямую влияет на рост и развитие растений in vitro [27]. Учитывая у пробирочных растений лимитирование автотрофного типа питания из-за низкого уровня СО2 вследствие ограничения газообмена, заметим, что одним из главных лимитирующих факторов для их оптимального роста и развития становится качественный состав углеводов питательной среды. В связи с этим необходимо было выявить углеводный источник, оптимальный для роста и развития B33-inv-растений в условиях in vitro. Для этого стеблевые черенки были помещены на фильтровальные мостики с МС-средой либо без углеводов (ав-тотрофный тип питания), либо содержавшей 2% сахарозы, или глюкозы, или фруктозы (преимущественно гетеротрофный тип питания). Анализ длины побегов, проведенный на 28-е сутки культивирования, показал, что оптимальной для роста и развития обеих линий растений является МС-среда, дополненная 2% сахарозы (табл. 1). Средняя длина побега у WT-растений при выращивании на этой среде составила 10,6±0,6 см, а у B33-inv-растений 8,1±0,7 см. Использование питательных сред с другими углеводами (2% глюкозы или 2% фруктозы) или без сахаров приводило к визуальному снижению ростовых показателей, в большей мере у B33-inv-растений. У обеих линий торможение роста и развития наблюдали при использовании МС-среды без углеводов: длина побега у WT-растений составила 4,5±0,5 см, а у B33-inv растений 3,2±0,4 см. Таблица 1 / Table 1 Длина побега растений, выращенных in vitro на МС-среде с различным составом углеводов (на 28-е сутки после черенкования) / The length of the shoot of the plants grown in vitro in MS-medium of different composition of carbohydrates (on the 28-th day after cuttings) Состав питательной среды / Composition of culture medium Длина побега, см / The length of the shoot, cm WT-растения / WT-plants B33-inv-растения / B33-inv-plants МС-среда без углеводов / MS-medium without carbohydrates 4,5±0,5 3,2±0,4 МС-среда + 2% сахарозы / MS-medium + 2% sucrose 10,6±0,6 8,1±0,7 МС-среда + 2% глюкозы / MS-medium + 2% glucose 6,8±0,2 5,3±0,3 МС-среда + 2% фруктозы / MS-medium + 2% fructose 6,3±0,7 4,0±0,7 Примечание. Данные представлены в виде средней арифметической со стандартной ошибкой по 30 растениям. / Note. The mean values and their standard errors for 30 plants. Полученные результаты свидетельствовали, что в условиях in vitro ростовые процессы у трансформантов и WT-растений осуществляются преимущественно гетеротрофно, при этом сахароза в составе МС-среды являлась оптимальным источником углеводов для их роста и развития. Основываясь на этих данных, все последующие эксперименты были проведены с растениями, выросшими на МС-среде с 2% сахарозы. Учитывая, что объектом нашего исследования являются растения со встроенным геном дрожжевой инвертазы, а субстратом для инвертазы является сахароза, которая гидролизуется до глюкозы и фруктозы, необходимо было в период роста растений in vitro проведение анализа изменений в содержании осмотически активных соединений в среде выращивания. Для определения величины осмотического потенциала еженедельно на протяжении 5 недель выращивания растений брали пробы из питательной среды. Расчеты показали, что осмотический потенциал МС-среды, содержавшей 2% сахарозы, в процессе роста и развития растений снижался, свидетельствуя об активном потреблении минеральных и органических соединений, в том числе сахаров (рис. 1). Важно отметить, что на протяжении всего периода выращивания WT-растений величина осмотического потенциала питательной среды была ниже, чем у трансформантов. Можно предположить, что трансформанты, в отличие от WT-растений, поглощали из питательной среды больше осмотически активных соединений. Рис. 1. Динамика изменения значений осмотического потенциала жидкой МС-среды с 2% сахарозы при выращивании WT-растений и трансформантов, экспрессирующих ген suc2 инвертазы дрожжей (В33-гот-растения) / Fig. 1. Dynamics of changes in osmotic potential of the liquid MS-medium with 2% sucrose while growing WT-plants and transformants expressing the yeast invertase gene suc2 (B33-inv-plants) Для подтверждения данного предположения проведен сравнительный анализ величин осмотического потенциала МС-среды с 2% сахарозы и МС-среды без углеводов. Из данных табл. 2 можно видеть, что основной вклад в осмотическую составляющую питательной среды вносила сахароза, а не минеральные компоненты. Различия по величине осмотического потенциала МС-среды без сахарозы и МС-среды с 2% сахарозы составляли около 70%: -0,178 и -0,301 МПа соответственно. Можно заметить, что автоклави-рование приводило к частичному распаду сахарозы до глюкозы и фруктозы, однако это несущественно влияло на величину осмотического потенциала. Принимая во внимание, что основной вклад в изменение осмотического потенциала питательной среды принадлежит сахарам (см. табл. 2), был проведен их количественный анализ. Согласно полученным данным через 5 недель выращивания растений в питательной среде содержание фруктозы и глюкозы резко возросло, а сахарозы уменьшилось (рис. 2). По сравнению с данными табл. 2 (значения после автоклавирования) концентрация фруктозы в МС-среде возросла в 5-7 раз, глюкозы - в 10 раз по сравнению с исходной (до автоклавирования) величиной. Увеличение содержания моносахаров свидетельствовало об активной работе апопластной инвертазы, находящейся на клеточной стенке клеток корня растений. Важно, что питательная среда, на которой выращивали трансформанты, содержала почти на 30% меньше сахарозы по сравнению со средой выращивания WT-растений. Следовательно, в условиях in vitro растения не только поглощали сахарозу из питательной среды, но интенсивно ее гидролизовали с помощью апопласт-ной инвертазы. При этом B33-inv-растения, по сравнению с контрольными (нетрансформированными) растениями, более активно потребляли сахарозу из среды выращивания. В литературе имеются сведения [3], что при культивировании растений-регенерантов картофеля в биореакторе концентрация сахарозы в питательной среде к концу второй недели после индукции клуб-необразования снижалась почти до нуля, а концентрация глюкозы и фруктозы повышалась до 4%. Авторы считают, что большая часть сахарозы в питательной среде распадается на глюкозу и фруктозу с помощью апопласт-ной инвертазы растений. Следовательно, при культивировании растительных клеток, тканей и органов in vitro в жидкой питательной среде важным фактором (которым нельзя пренебречь!) в изменении углеводного состава питательной среды (наряду с автоклавированием, приводящим к частичному гидролизу сахарозы) является активность апопластной инвертазы. Полученные результаты, демонстрирующие различие в содержании сахаров в питательной среде при выращивании in vitro различных линий растений картофеля, обусловили необходимость определения качественного состава сахаров в их листьях. Хроматографический анализ показал преобладание в листьях обеих линий глюкозы, фруктозы, сахарозы и инозита (рис. 3). Наличие в листьях метаболически неактивного углевода - инозита, видимо, обусловлено его поступлением из питательной среды, обязательным компонентом которой он является. Таким образом, из растворимых форм сахаров в листьях преобладали сахароза, глюкоза и фруктоза, поэтому на изменение содержания именно этих форм растворимых сахаров было ориентировано наше дальнейшее внимание. Сравнительный анализ содержания глюкозы, фруктозы и сахарозы в вегетативных органах растений выявил большую их концентрацию в корнях, чем в листьях. Спустя 5 недель выращивания корни трансформантов содержали на 33% больше сахаров, чем у WT-растений (13,8 и 10,3 мг/г сырой массы соответственно) (рис. 4, a). Это превышение было связано с более высоким содержанием глюкозы, при этом содержание сахарозы в корнях было в 5 раз ниже, чем у контрольных растений. Листья B33-inv-растений, по сравнению с контролем, содержали сахарозы и глюкозы больше на 20% и 11%, соответственно (рис. 4, b). Важно отметить, что содержание фруктозы в органах обеих линий было минорным. Есть основания полагать, что низкому содержанию фруктозы способствует фруктокиназа (КФ. 2.7.1.4), высокая активность которой обеспечивает максимальное использование свободной фруктозы в гликолитическом пути [28]. Рис. 2. Изменения концентрации фруктозы (Фр), глюкозы (Гл), и сахарозы (Сах) в МС-среде с 2% сахарозы спустя 5 недель выращивания WT-растений (1) и трансформантов, экспрессирующих ген suc2 инвертазы дрожжей (2) / Fig. 2. Changes in the fructose (Fru), glucose (Glu) and sucrose (Suc) concentration in the MS-medium containing 2% sucrose after 5 week cultivation of WT-plants (1) and transformants expressing the gene of the yeast invertase suc2 (2) Т а б л и ц а 2 / T a b l e 2 Влияние режима (0,7- 0,8 ати, 15 мин) автоклавирования питательной среды на содержание сахаров и осмотический потенциал / Influence of (0,7 to 0,8 excess at, 15 min) autoclaving regime of the culture medium on sugar content and osmotic potential* Состав питательной среды / Composition of culture medium Содержание сахаров, г/л / Sugar contents, g/l Осмотический потенциал, МПа / сахароза/ sucrose фруктоза/ fructose глюкоза / glucose Osmotic potential, MPa МС-среда + 2% сахарозы / 20,0** 0,0 0,0 -0,301 MS-medium + 2% sucrose 18,7 0,6 0,6 -0,315 МС-среда без сахаров / MS-medium without 0 0 0 -0,178 -0,188 carbohydrates * Осмотический потенциал дистиллированной воды равен нулю / [osmotic potential of distilled water is equal to zero]. ** В числителе значения до автоклавирования, в знаменателе после автоклавирования / [in the numerator the values are before autoclaving, in the denominator they are after autoclaving]. Известно, что представители рода Solanum относятся к группе растений, использующих апопласт в качестве промежуточного накопителя ассимиля-тов, в частности сахаров [29]. & i- m Lllil--.-J.A-- -400 -350 -300 j 250 -200 -150 -100 -50 AjL WT-растения / WT-plants B33-inv-растения / B33-inv-plants irmJ-^. -800 -700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 h Г0 i 1 I . i-JLjiJfjJiiii^L. Рис. 3. Хроматограмма состава сахаров листьев WT-растений и трансформантов, экспрессирующих ген suc2 инвертазы дрожжей (B33-inv-растения), выращенных на МС-среде с 2% сахарозы. В качестве метчиков для газожидкостной хроматографии использовали сахарозу, фруктозу, глюкозу, инозит и раффинозу / Fig. 3. Chromatogram of sugars in leaf tissue of the WT-plants and transformants expressing the gene of the yeast invertase of suc2 (B33-inv-plants) grown in the MS-medium containing 2% sucrose. Sucrose, fructose, glucose, inositol and raffinose were used as markers for gas-liquid chromatography Учитывая апопластную локализацию инвертазы дрожжей у B33-inv-растений, а также тот факт, что условия среды (рН 4,5-4,7) в апопласте соответствуют максимальной активности внеклеточной инвертазы S. cerevisiae (оптимум pH 3,5-5,0) [30], у исследуемых линий был проведен анализ содержания сахаров в этом компартменте. Согласно полученным данным, в апопласте В33-т\-растений, в отличие от WT-растений, концентрации глюкозы и фруктозы - продуктов гидролиза сахарозы (субстрат апопластной инвертазы) - были выше на 55 и 40%, соответственно (рис. 4, c). Общее содержание сахаров в апопласте трансформантов также было больше на 40% по сравнению с WT-растениями. Таким образом, данные по содержанию глюкозы, фруктозы и сахарозы в различных органах свидетельствуют, что корни и листья, включая апопласт, у растений, трансформированных геном инвертазы дрожжей, более обогащены сахарами, чем у контроля. Накопление сахарозы в листьях Б33-1пу-растений, видимо, происходит вследствие того, что апопластная инвертаза гидролизует сахарозу, находящуюся во внеклеточном пространстве, а образующиеся свободные фруктоза и глюкоза, поступая в клетки мезофилла, фосфорилируются гексокиназами (К.Ф. 2.7.1.1) и фруктокиназами и включаются в метаболизм, в том числе в путь синтеза сахарозы. Рис. 4. Содержание фруктозы (Фр), глюкозы (Гл), сахарозы (Сах) и суммы сахаров в корнях (а), листьях (b) и апопласте (с) WT-растений (1) и трансформантов, экспрессирующих ген suc2 инвертазы дрожжей (2). Растения выращены на МС-среде с 2% сахарозы в течение 5 недель / Fig. 4. The content of fructose (Fru), glucose (Glu), sucrose (Suc) in the roots (а), leaves (b) and the apoplast (c) in the WT-plants (1) and transformants expressing the gene of the yeast invertase suc2 (2). Plants were grown in the MS-medium containg 2% sucrose for five weeks Изменение содержания сахаров в органах ВЗЗ-шу-растений, связанное с экспрессией встроенного целевого гена suc2 и, как следствие, активностью дополнительной инвертазы дрожжей апопластной локализации, обусловило необходимость проведения сравнительного анализа активности различных форм инвертаз в корнях и листьях линий растений. Данные показали, что активность инвертазы в корнях и листьях у трансформантов была, чем у WT-растений (рис. 5). В корнях трансформантов активность кислой нерастворимой инвертазы (апопластная инвертаза) была выше более чем в 1,5 раза, а кислой растворимой инвертазы (вакуолярная инвертаза) - более чем в 2 раза, чем у WT-растений. В листьях B33-inv растений активность кислой растворимой инвертазы почти в 1,5 раза превышала таковую у WT-растений. Наблюдаемое нами у трансформантов увеличение активности кислой растворимой инвертазы, наряду с увеличением активности кислой нерастворимой инвертазы, указывает на частичную адсорбцию чужеродной инвертазы дрожжей на клеточной стенке растений и свидетельствует об ее нахождении в апопласте B33-inv растений в растворимой форме, что было показано нами ранее [22]. Рис. 5. Активность кислой нерастворимой (а), кислой растворимой (b) и щелочной (с) форм инвертазы в листьях (Л) и корнях (К) WT-растений (1) и трансформантов, экспрессирующих ген suc2 инвертазы дрожжей (2), выращенных in vitro на МС-среде с 2% сахарозы в течение 5 недель / Fig. 5. Activities of various forms of invertase in leaves (L) and roots (R) in the WT-plants (1), and transformants expressing the gene of the yeast invertase sue2 (2) grown in vitro on MS-medium containg 2% sucrose for five weeks: acid insoluble invertase (a), acid soluble invertase (b), alkaline invertase (с) Анализ литературных данных свидетельствует о важной роли сахарозы и продуктов её гидролиза (глюкоза, фруктоза) в изменении гормонального баланса растений [31] и регуляции экспрессии генов, ответственных за рост и развитие растений [5, 8], что находит свое подтверждение в их ростин-гибирующем действии. Выращивание растений на МС-среде, содержавшей 2% сахарозы, выявило существенные морфометрические различия между линиями (табл. 3). Таблица 3 / Table 3 Морфофизиологические показатели растений картофеля (возраст растений 5 недель) / Morphometric parameters of the potato plants (5 weeks old) Показатель / Parameter WT-растения / WT-plants В33^от-растения / B33-inv-plants Высота побега, см / Shoot length, cm 13,8±0,3 10,6±0,3 Число междоузлий, n / The number of internodes, n 13,0±0,2 11,8±0,3 Свежая масса корней, мг/раст. / Fresh weight of roots, mg/plant 26,2±5,2 10,6±2,1 Свежая масса листьев, мг/раст. / Fresh weight of leaves, mg/plant 80,2±6,4 59,1±8,4 Содержание сухого вещества, % от свежей массы растений / Contents of dry weight, % of the fresh plants 9,61 8,98 Примечание. Данные представлены в виде средней арифметической со стандартной ошибкой по 30 растениям. / Note. the mean values and their standard errors for 30 plants. Средняя длина побега у трансформантов была меньше, чем у WT-растений. Определение числа междоузлий показало достоверное снижение этого показателя у трансформантов. Кроме того, БЗЗ-inv растения характеризовались менее развитой, по сравнению с контролем, корневой системой, имели меньшую массу надземной части и большую обводненность тканей. Учитывая, что рост является интегральным показателем, отражающим степень адаптации растения к окружающей среде, а также тот факт, что торможение роста сопровождается кардинальной перестройкой метаболизма, связанной с ингибированием энергоёмких анаболических процессов и неспецифическим повышением устойчивости организма к экологическим стрессорам [8], трансформанты, как свидетельствовали наши предыдущие исследования [13, 14], обладали более высоким уровнем конститутивной и индуцируемой пониженной температурой устойчивостью к гипотермии. Таким образом, управляя синтезом, транспортом и распадом сахарозы, растения регулировали свой рост, развитие и физиолого-биохимические процессы. Следовательно, установленные нами морфометрические и физи-олого-биохимические различия между линиями были связаны со встраиванием и экспрессией гена suc2 инвертазы дрожжей в Б33^^-растениях. Заключение Принципиально новые возможности для решения фундаментальных задач предоставляют генно-инженерные подходы, в частности, использование в работе трансформированных растений, экспрессирующих гены гетероло-гичных организмов, кодирующие функциональные гомологи растительных белков с известными функциями. Результаты исследования, проведенного с трансформантами картофеля, экспрессирующими ген sue2 инвертазы дрожжей (апопластный вариант локализации фермента), расширили наши представления о роли апопластной инвертазы и продуктов ее деятельности в процессах роста и развития растений. Установлено, что изменения в активности только одного фермента углеводного метаболизма - апопластной инвертазы - привели к существенной перестройке всего метаболизма растений. Трансформация картофеля геном sue2 инвертазы дрожжей модифицировало их углеводный метаболизм, что выразилось в увеличении активности кислой инвертазы и повышении содержания сахаров в корнях, листьях и межклеточном пространстве (апопласте). Исследования показали, что в условиях in vitro растения картофеля не только поглощали сахарозу из питательной среды, но также интенсивно её гидролизовали с помощью апопластной инвертазы. При этом трансформанты (В33-шу-растения), по сравнению с WT-растениями, более активно расходовали экзогенную сахарозу. На примере В33-шу-растений показан ростингибирующий эффект повышенной концентрации внутриклеточных сахаров, проявившийся в снижении у трансформантов величин морфофизиологических показателей, как линейных, так и весовых. Авторы выражают благодарность сотрудникам ka6opamopuu сигнальных систем контроля онтогенеза им. акад. МХ. Чайлахяна ИФР РАН и группе доктора Л. Вилль-митцера (Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm, Германия) за предоставленные для исследований растения картофеля.

Ключевые слова

gene suc2, Solanum tuberosum L, apoplastic fluid, Saccharomyces cerevisiae, invertase, culture in vitro, osmotic potential, sugars

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Дерябин Александр НиколаевичИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)канд. биол. наук, с.н.с. лаборатории зимостойкостиanderyabin@mail.ru
Трунова Тамара ИльиничнаИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)д-р биол. наук, профессор, зам. директораtrunova@ippras.ru
Всего: 2

Ссылки

Rook F., Bevan M.W. Genetic approaches to understanding sugar-response pathways // J. Exp. Bot. 2003. Vol. 54. P. 495-501.
Ryan C.A., Farmer E.E. Oligosaccharide signals in plants: a current assessment // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. Vol. 42. P. 651-674.
Andjelkovic U., Picuric S., Vujcic Z. Purification and characterisation of Saeeharomyees eerevisiae external invertase isoforms // Food Chem. 2010. Vol. 120. P. 799-804.
Гамалей Ю.В. Транспортная система сосудистых растений. Происхождение, структура, функции, развитие, анализ разнообразия типов по таксономическим и эколого-географическим группам растений, эволюция и экологическая специализация транспортной системы. СПб. : Изд-во СПбГУ, 2004. 424 с.
Соколова С.В., Бурмистрова Н.А., Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кузовкина И.Н., Красавина М.С. Внутриклеточная сахароза и активность некоторых ферментов её метаболизации // Доклады АН. 1999. Т. 368, № 1. С. 139-141.
Nguyen Q.Th., Kozai T. Environmental effects on the growth ofplantlets in micropropagation // Environ. Control in Biol. 1998. Vol. 36 (2). P. 59-75.
Бробст К.М.Газожидкостная хроматография триметилсилильных производных сахаров // Методы исследования углеводов. Под. ред. Ф.Я. Хорлина. М. : Мир, 1975. С. 9-13.
Туркина Н.В., Соколова С.В. Методы определения моносахаридов и олигосахаридов // Биохимические методы в физиологии растений. М. : Наука, 1971. С. 7-34.
Hon W.-Ch., Griffith M., Chong P., Yang D.S.C. Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter rye (Seeale eereale L.) leaves // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 971980.
Wyn Jones R.G., Gorham J. Osmoregulation. In: Encyclopaedia of plant physiology. N.S. Physiological plant ecology. Vol. 12C / eds. O.L. Lange, P.S. Nobel, C.B. Osmond, H. Zeigler. Springer Verlag, Heidelberg. 1983. P. 35-58.
Дерябин А.Н., Бердичевец И.Н., Бураханова Е.А., Трунова Т.И. Характеристика внеклеточной инвертазы Saccharomyces cerevisiae в условиях гетерологичной экспрессии гена suc2 в растениях Solanum tuberosum // Известия РАН. Серия биологическая. 2014. № 1. С. 22-29.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, № 3. P. 473-497.
Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W., Stratmann M., Schell J., Willmeitzer L. Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class 1 patatin gene // EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 23-29.
Наумкина Е.М., Болякина Ю.П., Романов Г.А. Органоспецифичность и индуцибельность функционирования промотора пататина класса I картофеля в трансгенном арабидопсисе // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 3. С. 397-408.
Mignery G.A., Pikaard C.S., Park W.D. Molecular characterization of the patatin multigene family of potato // Gene. 1988. Vol. 62. P. 27-41.
Синькевич М.С., Нарайкина Н.В., Трунова Т.И. Участие сахаров в системе антиоксидантной защиты от индуцированного паракватом окислительного стресса у картофеля, трансформированного геном инвертазы дрожжей // Доклады АН. 2010. Т. 34, № 4. С. 501-506.
Deryabin A.N., Dubinina I.M., Burakhanova E.A., Astakhova N.V., Sabelnikova E.P., Sinkevich M.S., Trunova T.I. Tolerance to low temperature of potato plants transformed with yeast invertase gene // Acta Agrobotanica. 2004. Vol. 57, № 1-2. P. 31-39.
Deryabin A.N., Dubinina I.M., Burakhanova E.A., Astakhova N.V., Sabelnikova E.P., Trunova T.I. Influence expressing yeast-derived invertase gene in potato plants on membranes lipid peroxidation at low temperature // J. Therm. Biol. 2005. Vol. 30, № 1. P. 73-77.
Дерябин А.Н., Трунова Т.И., Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Сабельникова Е.П., Крылова Е.М., Романов Г.А. Устойчивость к гипотермии растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, находящимся под контролем промотора пататина В33 // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 4. С. 505-510.
Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Климов С.В., Астахова Н.В., Трунова Т.И. Особенности СО<sub>2</sub>-газообмена и структурной организации хлоропластов растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, в условиях гипотермии // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 4. С. 511-516.
Sonnewald U., Hajlrezaei M.-R., Kossmann J., Heyer A., Thethewey R.N., Willmitzer L. Increased potato tuber size resulting from apoplastic expression of a yeast invertase // Nature Biotech. 1997. Vol. 15. P. 794-797.
Frommer W., Sonnewald U. Molecular analysis of carbon partitioning in solanaceous species // J. Exp. Bot. 1995. Vol. 46. P. 587-607.
Gupta A.K., Kaur N. Sugar signaling and gene expression in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants // J. BioSci. 2005. Vol. 30. P. 761-776.
Von Schaewen A., Stitt M., Schmidt R., Sonnewald U., Willmitzer L. Expression of a yeastderived invertase in the cell wall of tobacco and arabidopsis plants leads to accumulation of carbohydrate and inhibition of photosynthesis and strongly influences growth and phenotype of transgenic tobacco plants // EMBO J. 1990. Vol. 9. P. 3033-3044.
Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Голяновская С.А., Коссманн Й., Вилльмитцер Л., Романов Г.А. Генетические трансформанты картофеля как модель для изучения гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 420-430.
Vargas W.A., Salerno G.L. The Cinderella story of sucrose hydrolysis: alkaline/neutral invertases, from cyanobacteria to unforeseen roles in plant cytosol and organelles // Plant Science. 2010. Vol. 178, № 1. P. 1-8.
Smeekens S., Ma J., Hanson J., Rolland F. Sugar signals and molecular networks controlling plant growth // Current Opinion in Plant Biology. 2010. Vol. 3. P. 273-278.
Fotopoulos V. Plant invertases: structure, function and regulation of a diverse enzyme family // J. Biol. Res. 2005. Vol. 4. P. 127-137.
Трофимец Л.Н., Остапенко Д.П., Бойко В.В., Зейрук С.В., Донец Н.В. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля (Методические рекомендации). М. : ВАСХНИЛ, 1985. 35 с.
Tovar P., Estrada R., Schilde-Rentschler L., Dodds J.H. Induction and use of in vitro potato tuber // CIP Circular. 1985. Vol. 13, № 4. P. 1-5.
Yu W.-C., Joyce P.J., Cameron D.C., Mc Cown B.H. Sucrose utilization during potato microtuber growth in bioreactors // Plant Cell Rep. 2000. Vol. 19. P. 407-413.
Головацкая И.Ф., Дорофеев В.Ю., Медведева Ю.В., Никифоров П.Е., Карначук Р.А. Оптимизация условий освещения при культивировании микроклонов Solanum tuberosum L. сорта Луговской // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 133-144.
 Морфофизиологические и биохимические характеристики растений картофеля, экспрессирующих ген SUC2 инвертазы <i>Saccharomyces cerevisiae</i>, при выращивании <i>in vitro</i> | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 4 (28).

Морфофизиологические и биохимические характеристики растений картофеля, экспрессирующих ген SUC2 инвертазы Saccharomyces cerevisiae, при выращивании in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2014. № 4 (28).