Индукция культуры in vitro редкого вида Fritillaria meleagroides Patrin ex Schult. et Schult. fil. (Liliaceae) с использованием незрелых семян | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2018. № 44. DOI: 10.17223/19988591/44/10

Индукция культуры in vitro редкого вида Fritillaria meleagroides Patrin ex Schult. et Schult. fil. (Liliaceae) с использованием незрелых семян

Выявлена эффективность использования незрелых семян Fritillaria meleagroides в качестве первичных эксплантов для введения в культуру in vitro. Установлено, что данный подход позволяет избежать этапа длительной холодной стратификации и значительно повысить всхожесть семян. Предкультивирование при 23±2°С в темноте в течение 60 сут на безгормональной среде MS способствовало прорастанию 74% семян, тогда как в условиях стратификации всхожесть не превышала 27%. Индукцию регенерации наблюдали из тканей незрелых зиготических зародышей, изолированных после этапа предкультивирования, при этом базальные части проростков не проявляли морфогенной активности. Для эмбриокультуры F. meleagroides характерны процессы прямой и непрямой регенерации, при этом наибольший стимулирующий эффект отмечали при использовании 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации от 0,1 до 1,0 мкМ. Высокие концентрации (2,5 и 5,0 мкМ) используемых регуляторов роста оказались неэффективными и приводили к некрозу тканей экспланта. Более интенсивно процессы регенерации протекали в условиях 16-часового фотопериода в сравнении с культивированием в темноте.

In vitro culture initiation using immature seeds of a rare species Fritillaria meleagroides Patrin ex Schu.pdf Введение В последние годы при разработке новых стратегий сохранения биоразнообразия активно используются методы биотехнологии, служащие основой для создания коллекций редких и исчезающих видов in vitro [1]. Важность этих исследований определила интерес к разработке протоколов культивирования редких и эндемичных видов рода Fritillaria, востребованных не только как декоративные растения, но и как источники ценных лекарственных веществ [2-4]. Ключевым моментом для инициации культуры in vitro объекта исследования является подбор первичного экспланта. При создании систем регенерации для луковичных растений часто в качестве первичных экспланов выбирают сегменты луковичных чешуй [5, 6]. Однако изоляция подземных органов сопряжена с сильной контаминацией и полным разрушением материнского растения, поэтому кроме подземных органов для введения в культуру in vitro также используют листья, листочки околоцветника, части стебля и семена. Pабота с семенами дает возможность сохранить растение-донор неповрежденным, а также поддержать естественное генетическое разнообразие вида, что особенно важно для природных популяций редких растений [7]. Технология эмбриокультуры позволяет работать с незрелыми зародышами в качестве первичных эксплантов. В настоящее время, этот подход широко используется для изучения процессов дифференциации и физиологических аспектов эмбриогенеза, в работах по отдаленной гибридизации и получению гаплоидов, для индукции соматических эмбриоидов и преодоления покоя семян [8, 9]. Для семян рябчиков свойствен сложный глубокий морфофизиологиче-ский (БВ-В3) тип покоя семян [10, 11]. Такой тип покоя определяет недоразвитие зародыша и сильный физиологический механизм торможения прорастания. В литературе встречаются разнообразные методы, испытанные на семенах рябчиков и позволяющие преодолеть затрудненное прорастание и завершить процесс развития зародыша, такие как механическая и химическая скарификация, выщелачивание, обработка горячей водой, холодная и теплая стратификация, замораживание и обработка нитратом калия [12, 13]. Fritillaria meleagroides Patrin ex Schult. et Schult. fil. (рябчик малый или шахматовидный) - многолетнее травянистое растение, луковичный геоэфемероид. Pаспространен в Европе, Средней Азии, европейской части Pоссии и на Алтае, местообитания связаны с достаточным освещением и увлажнением. Вид занесен в ряд региональных Красных книг, в том числе в Красную книгу Новосибирской области (2008) в статусе уязвимого вида 2(V) [14]. Pазработка эффективных протоколов микроразмножения необходима для создания систем сохранения уязвимых и редких растений в коллекциях in vitro, являющихся банком гермоплазмы и резервным фондом для пополнения «живых» коллекций в условиях ex situ. Настоящее исследование направлено на выявление оптимальных условий культивирования незрелых семян в качестве источников первичных эксплантов и индукцию морфогенеза из тканей незрелых зиготических зародышей и проростков Fritillaria meleagroides. Материалы и методики исследования Незрелые плоды F. meleagroides с сочными зелеными стенками собраны с растений из природной популяции - НСО, Тогучинский район, пойма р. Изылы, заливной луг (55°10'21.8"N, 84°34'54.8''E). Введение в культуру in vitro. Поверхностную стерилизацию плодов проводили погружением в 15%-ный водный раствор «Domestos» («Юнилевер Русь», Россия) на 20 мин, затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. После стерилизации в асептических условиях с помощью пинцета и скальпеля извлекали семена из плодов. Эксперименты проводили согласно схеме, представленной на рис. 1. Предкультивирование незрелых семян проводили в темноте на 0,6%-ном водном растворе агара или питательной среде Мурасиге-Скуга (MS) [15] без регуляторов роста. Длительность этапа составляла 40 или 60 сут. На данном этапе использовали два температурных режима: 4°С (термостат «RuMed», Германия) и 23±2°С (свето-культуральная комната). Всего в исследовании использовано 480 семян F meleagroides. Рис. 1. Схема эксперимента [Fig. 1. Experiment scheme] Индукция морфогенеза в культуре незрелых зиготических зародышей. После предкультивирования незрелые зиготические зародыши изолировали (путем сжимания семени пинцетом) и высаживали на среды для индукции морфогенеза. Культивирование проводили в свето-культуральной комнате при 23±2°С, в условиях темноты или 16-часового фотопериода (интенсивность освещения 4,0-4,2 клк). При прорастании семян изолировали базаль-ную часть проростка и высаживали на питательные среды. Для индукции морфогенеза использовали минеральную основу по прописи среды MS, дополненную регуляторами роста: тидиазуроном (TDZ), 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислотой (2,4-D) в концентрациях от 0,1 до 5,0 мкМ. Контролем служила безгормональная среда MS. Длительность пассажа на данном этапе составила 60-75 сут. В ходе экспериментов оценивали всхожесть семян (%), частоту каллусо-генеза (%), частоту регенерации (%), количество выпячиваний или побегов (шт./экспл.). Морфологический анализ развития проводили с использованием сте-реомикроскопа SteREODiscovery. V 12 с камерой высокого разрешения AxioCamHRc и с программой AxioVision 4.8 («CarlZeiss», Германия) на базе Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ЦСБС СО РАН (г. Новосибирск). Статистическая обработка результатов. В каждый культуральный сосуд на этапе введения в культуру in vitro помещали по 10 семян, в экспериментах по индукции морфогенеза - по 5 эксплантов. Эксперименты проведены в 4-5 повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ Microsoft Office Excel 2007 и StatSoft STATISTICA 6.0. Значения в таблицах приведены в виде средних арифметических значений и стандартных ошибок (M ± SE). Для выявления статистически значимых различий проведен однофакторный дисперсионный анализ с тестом Дункана, многофакторный дисперсионный анализ применяли для оценки влияния состава питательной среды и условий культивирования. В работе обсуждали результаты статистически значимых различий средних (р

Ключевые слова

Fritillaria, незрелые зиготические зародыши, эмбриокультура, морфогенез, холодная стратификация, Fritillaria, immature zygotic embryos, embryo culture, morphogenesis, cold stratification

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Новикова Татьяна ИвановнаЦентральный Сибирский ботанический сад СО РАНд-р биол. наук, зав. лабораторией биотехнологииtin27@mail.ru
Мурасева Динара СерыкбаевнаЦентральный Сибирский ботанический сад СО РАНканд. биол. наук, м.н.с. лаборатории биотехнологииdsmuraseva@csbg.nsc.ru
Всего: 2

Ссылки

Plant conservation biotechnology. Benson E.E., ed. London; Philadelphia P. A. : Taylor &Francis, 1999. 309 p.
Paek K.Y., Murthy H.N. High frequency of bulblet regeneration from bulb scale sections of Fritillaria thunbergii // Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2002. Vol. 68. PP. 247-252.
Эрст А.А., Эрст А.С., Шауло Д.Н., Кульханова Д.С. Сохранение и размножение in vitro редких видов рода Fritillaria (Liliaceae) // Растительный мир Азиатской России. 2014. № 1 (13). С. 64-70.
Muraseva D.S., Novikova T.I. Efficient protocol for in vitro propagation from bulb scale explants of Fritillaria ruthenica Wikstr. (Liliaceae), a rare ornamental species // Rendiconti Lincei. Scienze Fisiche e Naturali. 2018. Vol. 29. PP. 491-497. doi: 10.1007/s12210-018-0693-8
Joshi S.K., Dhar U. In vitro propagation from axenic explants of Lilium oxypetalum (D. Don) Baker, an endemic bulbous plant of high altitude Himalaya // Acta Physiologiae Plantarum. 2009. Vol. 31. PR 833-838. doi: 10.1007/s11738-009-0299-y
Liu X.M., Yang G.C. Adventitious shoot regeneration of oriental lily (Lilium orientalis) and genetic stability evaluation based on ISSR marker variation // In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 2012. Vol. 48. PB 172-179. doi: 10.1007/s11627-012-9429-0
Benson E.E., Danaher J.E., Pimbley I.M., Anderson C.T., Wake J.E., Daley S., Adams L.K. In vitro micropropagation of Primula scotica: a rare Scotish plant // Biodiversity and Conservation. 2000. Vol. 9. PP. 711-726.
Bhojwani S.S., Dantu P.K. Plant tissue culture : An introductory text. New Delhi : Springer, 2013. 309 р. doi: 10.1007/978-81-322-1026-9
Железниченко Т.В., Новикова Т.И. Влияние аскорбиновой кислоты и глутатиона на индукцию соматического эмбриогенеза Picea pungens Engelmann // Turczaninowia. 2017. № 20 (3). С. 27-35. doi: 10.14258/turczaninowia.20.3.4
Поздова Л.М., Разумова М.В. Покой семян. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / под ред. Т.Б. Батыгиной. СПб. : Мир и семья, 1997. С. 656-667.
Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биология семян. СПб. : НИИ химии СПбГУ, 1999. 232 с.
Carasso V., Hay F.R., Probert R.J., Mucciarelli M. Temperature control of seed germination in Fritillaria tubiformis subsp. moggridgei (Liliaceae) a rare endemic of the South-West Alps // Seed Science Research. 2011. Vol. 21. PK 33-38. doi: 10.1017/S0960258510000310
Ветчинкина Е.М., Ширнина И.В., Ширнин С.Ю., Молканова О.И. Сохранение редких видов растений в генетических коллекциях in vitro // Вестник Балтийского федерального университета им. И. Канта. Естественные и медицинские науки. 2012. Вып. 7. С. 109-118.
Красная книга Новосибирской области / Департамент природных ресурсов и охраны окружающей среды Новосибирской области. 2-е изд. Новосибирск : Арта, 2008. 528 с.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15. PP. 473-497.
Mirici S., Parmaks I., Ozcan S., Sancak C., Uranbey S., Sarhan E.O., Gumuscu A., Gurbuz B., Arslan N. Efficient in vitro bulblet regeneration from immature embryos of endangered Sternbergia fischeriana // Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2005. Vol. 80. PP. 239-246.
Ozcan S., Parmaksiz I., Mirici S., Cocu S., Uranbey S., Ipek A., Sancak C., Sarihan E.O., Gurbuz B., Sevimay C.S., Arslan N. Efficient in vitro bulblet regeneration from immature embryos of endemic and endangered geophyte species in Sternbergia, Muscari and Fritillaria genera / Z. Xu, J. Li, Y. Xue, W. Yang, eds. Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond. Dordrecht, The Netherlands : Springer, 2007. PP. 381-383.
Carasso V., Mucciarelli M. In vitro bulblet production and plant regeneration from immature embryos of Fritillaria tubiformis Gren. &Godr. // Propagation of Ornamental Plants. 2014. Vol. 14 (3). PR 101-111.
Elhiti M., Stasolla C. The use of zygotic embryos as explants for in vitro propagation: an overview // Plant Embryo Culture. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). T.A. Thorpe, E.C. Yeung, eds. Vol. 710. New Delhi, India : Humana Press, 2011. PP. 229255. doi: 10.1007/978-1-61737-988-8_17
Круглова Н.Н., Катасонова А.А. Незрелый зародыш пшеницы как морфогенетически компетентный эксплант // Физиология и биохимия культурных растений. 2009. Т. 41, № 2. С. 124-131
 Индукция культуры <i>in vitro</i> редкого вида <i>Fritillaria meleagroides</i> Patrin ex Schult. et Schult. fil. (Liliaceae) с использованием незрелых семян | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2018. №  44. DOI: 10.17223/19988591/44/10

Индукция культуры in vitro редкого вида Fritillaria meleagroides Patrin ex Schult. et Schult. fil. (Liliaceae) с использованием незрелых семян | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2018. № 44. DOI: 10.17223/19988591/44/10