Diversity of the honeybee Apis mellifera L. in Tomsk region according to morphometric and molecular genetic marke.pdf Введение Генетическое разнообразие, характерное для природных популяций медоносной пчелы, является одним из наиболее важных условий, необходимых для существования и устойчивого развития пчеловодства [1-3]. В настоящее время во всем мире наблюдается глобальная потеря разнообразия и численности пчел [4-9], поэтому одной из основных задач пчеловодства является сохранение аборигенных подвидов и популяций медоносной пчелы [3, 10-14]. Нативные подвиды наиболее приспособлены к местным природно-климатическим условиям, и их исчезновение означает потерю уникальных генетических комбинаций (и признаков), сформированных путем естественного отбора в течение длительного периода времени. Основными причинами потери генетического разнообразия медоносной пчелы Apis Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. 143 mellifera L. рассматриваются замещение естественных популяций более миролюбивыми и продуктивными коммерческими (неместными) подвидами, распространение паразитов и патогенов медоносной пчелы, а также бессистемное использование пестицидов и ядохимикатов [10, 11, 13-19]. Мониторинг местного подвида (экотипа) медоносной пчелы и ограничение интродукции коммерческих пчелиных семей позволят снизить уровень межпородной гибридизации пчел и сохранить генетическое разнообразие и уникальный генофонд аборигенных пчел [11]. В Сибири первоначально культивировалась среднерусская пчела (темная лесная) Apis mellifera mellifera L., которая была завезена 230 лет назад, как наиболее адаптированная к суровым природно-климатическим условиям региона, таким как низкие температуры, продолжительная зима и короткий летний взяток. C конца XX в. отмечен массовый завоз пчел южного происхождения, преимущественно карпатской пчелы Apis mellifera carpaIhica [20], в результате чего на территории Сибири изменились представленность подвидов медоносной пчелы и их генотипический состав. Однако изученность медоносных пчел в Сибири недостаточна, а имеющиеся данные фрагментарны и не дают целостного представления о породном составе, текущем состоянии популяций и их генофонда, что является препятствием для более полного понимания путей развития популяций A. mellifera, реальной оценки процесса гибридизации пчел и его последствий, а также решения задач практического пчеловодства. Кроме того, в отличие от других регионов России и Европы, где отмечены такие негативные процессы в популяциях медоносной пчелы, как коллапс пчелиных семей [4-9, 21, 22], на территории Томской области зарегистрированы только единичные случаи массовой гибели семей, поэтому значительный интерес представляет оценка биологического разнообразия и адаптационного потенциала медоносной пчелы в условиях Сибири. Систематические исследования медоносной пчелы на территории Сибири, включая Томскую область, были начаты в 2004 г. сотрудниками научно-практического центра «Апис» Томского государственного университета. Первоначально породный состав медоносных пчел на территории Томской области изучался с использованием классического морфологического метода, включающего исследование окраски тела, крыловых показателей и других морфометрических признаков [23]. Начиная с 2009 г. для исследования медоносных пчел стали применяться молекулярно-генетические методы с использованием ДНК-маркеров митохондриального (мтДНК) и ядерного геномов и выполнены пилотные исследования с целью первичной характеристики генетического разнообразия пчел, а также поиска высокополиморфных информативных ДНК-маркеров [24-30]. Однако следует указать, что классические морфометрические признаки и маркеры митохондриального и ядерного геномов, широко применяемые для исследования породного состава медоносных пчел, обладают разной 144 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. информативностью [31-35]. Так, анализ полиморфизма мтДНК позволяет определить происхождение пчелиных семей только по материнской линии; исследования изменчивости ядерного генома (в том числе и микросател-литных локусов) все еще не получили широкого распространения (мало информации по породной и территориальной специфичности генофондов), а морфометрические признаки, с учетом широкого распространения межпородной гибридизации, не всегда позволяют корректно определить породный состав медоносных пчел [31, 36, 37]. В связи с этим только использование комплекса разных методов исследования обеспечит четкую и полную идентификацию подвидов медоносной пчелы. В данной статье представлены результаты 10-летнего комплексного исследования медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, с использованием морфометрического и молекулярно-генетических методов (проведен анализ вариабельности локуса COI-COII мтДНК и микросател-литных локусов ядерного генома). Цель работы - выявить биологическое разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera, обитающей на территории Томской области, по морфометрическим и молекулярно-генетическим маркерам. Материалы и методики исследования Материалом для исследования послужили образцы рабочих особей, полученных с 65 пасек 47 населенных пунктов 13 районов Томской области (рис. 1). Исследование медоносных пчел проведено с использованием морфометрического и молекулярно-генетических методов. Для исследования породного состава медоносных пчел первоначально проведен анализ мтДНК (изучена вариабельность локуса COI-COII), чтобы определить происхождение пчелиной семьи по материнской линии. Анализировалось 3-5 особей от семьи. Затем для более полной характеристики пчелиной семьи и ее соответствия стандарту породы выполнен морфометрический анализ (20-30 особей от семьи). Всего исследовано 337 пчелиных семей. Для оценки генетического разнообразия медоносных пчел проведен анализ изменчивости 9 микросателлитных локусов; изучено 5-15 особей от семьи. Анализ ядерного генома выполнен для медоносных пчел, полученных от 106 семей; всего 893 особи. Морфометрический метод Изучены основные породоопределяющие морфометрические показатели крыла: кубитальный и гантельный индексы, дискоидальное смещение [17, 26]. Полученные результаты морфометрического исследования сравнивали со стандартами значений, принятыми для рабочих особей разных пород пчел [10, 27, 28]. Рис. 1. Карта локализации исследованных пасек Томской области (здесь и на рис. 2, 3): 1 - с. Парабель; 2 - окр. г. Колпашево; 3 - д. Новоабрамкино; 4 - с. Чалково; 5 - с. Леботер; 6 - с. Подгорное; 7 - д. Стрельниково; 8 - с. Гореловка; 9 - с. Высокий Яр, д. Крыловка; 10 - с. Парбиг; 11 - с. Бакчар; 12 - д. Сарафановка; 13 - с. Могочино; 14 - с. Соколовка; 15 - с. Кривошеино; 16 - с. Монастырка; 17 - с. Каргала, с. Старая Шегарка; 18 - с. Баткат; 19 - д. Тихомировка; 20 - урочище Кужербак; 21 - с. Новиковка; 22 - д. Цветковка; 23 - д. Крутоложное; 24 - с. Тегульдет; 25 - с. Дубровка; 26 - с. Зырянское; 27 - с. Окунеево; 28 - д. Губино; 29 - с. Рыбалово, д. Кудринский участок; 30 - окр. г. Томска, д. Просекино, с. Коларово; 31 - п. Синий Утес; 32 - д. Кандинка; 33 - с. Курлек; 34 - с. Яр; 35 - д. Кусково; 36 - п. Заречный (Малиновское сельское поселение); 37 - с. Семилужки; 38 - д. Бодажково; 39 - с. Межениновка; 40 - д. Большое Протопопово; 41 - п. Заречный (Межениновское сельское поселение); 42 - д. Еловка. Пасеки, расположенные на расстоянии менее 20 км друг от друга, отмечены одной точкой. Примечание. В северных районах Томской области (Александровском, Каргасокском, Верхнекетском) пчеловодство отсутствует из-за суровых природно-климатических условий [Fig. 1. Map of sample locations in Tomsk region. Here and in Fig. 2 and 3, the numbers indicate the studied settlements: 1 - v. Parabel; 2 - vicinity of Kolpashevo; 3 - v. Novoabramkino; 4 - v. Chalkovo; 5 - v. Leboter; 6 - v. Podgornoe; 7 - v. Strelnikovo; 8 - v. Gorelovka; 9 - v. Vysoky Yar, v. Krylovka; 10 - v. Parbig; 11 - v. Bakchar; 12 - v. Saraphanovka; 13 - v. Mogochino; 14 - v. Sokolovka; 15 - v. Krivosheino; 16 - v. Monastyrka; 17 - v. Kargala, v. Staraya Shegarka; 18 - v. Batkat; 19 - v. Tichomirovka; 20 - v. Kuzherbak; 21 - v. Novikovka; 22 - v. Tsvetkovka; 23 - v. Krutolozhnoe; 24 - v. Teguldet; 25 - v. Dubrovka; 26 - v. Zyryanskoe; 27 - v. Okuneevo; 28 - v. Gubino; 29 - v. Rybalovo, v. Kudrinsky uchastok; 30 - vicinity of Tomsk, v. Prosekino, v. Kolarovo; 31 - v. Sinii Utes; 32 - v. Kandinka; 33 - v. Kurlek; 34 - v. Yar; 35 - v. Kuskovo; 36 - v. Zarechnyi (Malinovskoe rural settlement); 37 - v. Semiluzhki; 38 - v. Bodazhkovo; 39 - v. Mezheninovka; 40 - v. Bol'shoe Protopopovo; 41 - v. Zarechnyi (Mezheninovskoe rural settlement); 42 - v. Elovka. Apiaries located at a distance less than 20 km from each other are marked as a single point. Note. In the northern districts of Tomsk region (Aleksandrovsky, Kargasoksky, Verkhneketsky), there is no beekeeping due to harsh climatic conditions] 146 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. Молекулярно-генетические методы Для проведения молекулярно-генетического исследования использованы образцы пчел, которые хранились в 96%-ном спирте при температуре 4°С. Выделение ДНК из индивидуальных особей проведено модифицированным методом экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ [18, 29]. Выделенная ДНК анализировалась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, маркирующих межгенный локус COI-COII митохондриального генома. Использованы следующие последовательности праймеров: F-5'-CACATTTAGAAATTCCATTA, R-5'-Ataaatatgaatgatgtgga [29]. Продукты амплификации фракционировали в 1,5%-ном агарозном геле, окрашивали в бромистом этидии, визуализировали в ультрафиолетовом свете и документировали с использованием специальной программы для визуализации гель-электрофореза. Изучен полиморфизм 9 микросателлитных локусов: А008, Ap049, А043, AC117, Ap243, H110, A024, A113, SV185. ПЦР проводили согласно описанной ранее методике с применением специфических праймеров [30]. Использовали один меченный флуоресцентной меткой праймер из каждой пары. Генотипирование выполнено на базе Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» (НИИ медицинской генетики ТНИМЦ РАН, г. Томск) на генетическом анализаторе ABI Prism 3730 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) с применением стандартов длины молекул ДНК GeneScan500-ROX в условиях, рекомендуемых производителем. Размер фрагментов проанализирован с помощью программного обеспечения GeneMapper Software. Для статистической обработки данных (расчет частот аллелей со стандартной ошибкой, показателей наблюдаемой (Ho) и ожидаемой (He) гетерозиготности) использованы стандартные методы, применяемые при изучении генетического разнообразия популяций [31, 32]. Оценка статистически значимых различий между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью проведена с использованием t-критерия Стьюдента. Морфометрические данные представлены в виде среднего арифметического значения со стандартной ошибкой. Для оценки дифференциации различных подвидов медоносной пчелы и определения уровня генетической гетерогенности выборок пчел из популяций различной географической локализации использован метод главных координат (Principal Coordinates Analysis, PCoA), основанный на расчете генетических дистанций между выборками пчел. Расчеты проведены в программах Microsoft Office Excel 2010, StatSoft STATISTICA 8.0 for Windows, GENALEX 6 [32]. Результаты исследования и обсуждение Распространение пород медоносной пчелы в Томской области Для выявления породного состава медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, проведено комплексное исследование, включающее Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. 147 морфометрический и молекулярно-генетический анализ (полиморфизм локуса COI-COII мтДНК) медоносных пчел. Генетическое разнообразие медоносных пчел по митохондриальной ДНК Согласно данным анализа полиморфизма мтДНК (вариабельность локуса COI-COII) у медоносных пчел Томской области зарегистрировано три варианта локуса COI-COII мтДНК: PQQ, PQQQ (характерны для A. m. mel-lifera, эволюционная линия М) и Q (свойствен породам южного происхождения, эволюционная линия С). Из исследованных 337 пчелиных семей 62,9% семей имели происхождение по материнской линии от среднерусской породы, 29,1% семей - от пород южного происхождения и 8,0% составляли смешанные семьи, которые формируются пчеловодами путем объединения нескольких семей, в том числе семей разного происхождения, с целью их усиления (в этих семьях регистрировались особи с вариантами локуса COI-COII, характерными как для среднерусской, так и для «южных» пород медоносной пчелы) (рис. 2). Для пчелиных семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (всего идентифицировано 212 семей), характерна генетическая гетерогенность по локусу COI-COII: в 85,3% семей регистрировался вариант PQQ, у 10,7% - вариант PQQQ, а у 4,0% семей выявлены как особи с вариантом PQQ, так и пчелы с вариантом PQQQ (от общего числа семей среднерусской породы). Среди пчелиных семей смешанного породного состава (выявлено 27 семей) наиболее часто регистрировались семьи с вариантами PQQ и Q (85,2% семей от общего числа смешанных семей), реже - с вариантами PQQQ и Q (11,1%), а в одной семье (3,7%) в с. Курлек Томского района были выявлены пчелы со всеми зарегистрированными вариантами локуса COI-COII - PQQ, PQQQ и Q. В различных районах Томской области пчелиные семьи отличались между собой по частоте регистрации вариантов локуса COI-COII мтДНК. На северных территориях области (Парабельский, Колпашевский, Чаинский, Бакчарский, Молчановский, Кривошеинский и Тегульдетский районы) выявлено 95,9% пчелиных семей (всего исследовано 194 пчелосемьи), однородных по варианту локуса мтДНК: 67,0% семей имели происхождение от среднерусской породы (зарегистрировано два варианта локуса мтДНК -PQQ и PQQQ); 28,9% семей происходили от пород южного происхождения. Остальные пчелосемьи (4,1%) имели смешанное происхождение (выявлены разные аллели локуса COI-COII в одной семье - PQQ и Q). Так, в Па-рабельском и Кривошеинском районах выявлены пчелиные семьи только с вариантом PQQ, в Тегульдетском - только с вариантом PQQQ. На пасеках Колпашевского, Чаинского, Молчановского и Бакчарского районов выявлены семьи разного происхождения (зарегистрированы варианты PQQ и Q). При этом на пасеках Чаинского и Молчановского районов преобладали пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы (86 и 95% соответственно), тогда как на пасеках Колпашевского и Бакчарского райо- 148 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. нов, наоборот, преобладали семьи южного происхождения (93 и 65% соответственно). В Бакчарском и Чаинском районах также выявлено несколько смешанных пчелиных семей, особи которых имели варианты PQQ и Q (рис. 2). '^⅞2}∙^^Tomsty Рис. 2. Распространенность вариантов локуса COI-COII мтДНК (PQQ, PQQQ и Q) у медоносных пчел на территории Томской области [Fig. 2. Distribution of the COI-COII mtDNA locus variants (PQQ, PQQQ, and Q) in honeybees in Tomsk region] В южных районах области (Асиновском, Первомайском, Зырянском, Томском, Шегарском и Кожевниковском) однородные по вариантам локуса COI-COII мтДНК пчелиные семьи (всего изучено 143 семьи) составили 80,4%, тогда как смешанные семьи - 19,6%. Среди смешанных семей выявлено 6,3% семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (у особей зарегистрированы варианты PQQ или PQQQ), и 13,3% семей разного породного происхождения (у особей зарегистрированы варианты PQQ/PQQQ или Q). Всего в южных районах выявлено 57,3% пчелиных семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (зарегистрированы варианты PQQ или PQQQ), 29,4% - семьи южного происхождения, 13,3% - смешанные семьи, пчелы которых имели разное породное происхождение. Пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы, были зарегистрированы на пасеках всех южных районов области. При этом Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. 149 преобладали пчелы с вариантом PQQ (65,9% от общего числа семей среднерусской породы), реже встречались семьи с пчелами, имеющими вариант PQQQ (23,1%), и смешанные семьи с пчелами, имеющими варианты PQQ или PQQQ (11,0%). Например, в Кожевниковском районе во всех исследованных семьях у пчел выявлен только вариант PQQ; в Первомайском районе половина исследованных семей имела происхождение от среднерусской породы (зарегистрирован вариант PQQ) и половина семей - южного происхождения (выявлен вариант Q); в остальных районах - у пчел выявлены все варианты локуса COI-COII (PQQ, PQQQ и Q). Семьи смешанного состава были выявлены на пасеках Шегарского и Томского районов, причем зарегистрированы сочетания вариантов локуса мтДНК - PQQ и Q (67%), PQQQ и Q (33%). Таким образом, на основе анализа полиморфизма локуса COI-COII мтДНК установлено различное происхождение медоносных пчел на пасеках Томской области, хотя и преобладали пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы. Тот факт, что на одной и той же территории обитают пчелы разных пород, позволяет предположить высокий уровень гибридизации. Поскольку анализ мтДНК позволяет установить происхождение медоносной пчелы (семьи) только по линии матки без оценки вклада «отцовских» генов, пчелы с пасек Томской области были изучены с использованием морфометрического анализа. Характеристика морфометрической изменчивости медоносных пчел Изучена изменчивость трех породоопределяющих морфометрических показателей (кубитального и гантельного индексов, дискоидального смещения) у медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области (табл. 1). Для всех изученных морфометрических показателей выявлен значительный уровень вариабельности. Так, для пчел, обитающих на пасеках Томской области, значения кубитального и гантельного индексов зарегистрированы в пределах 1,00-5,56 и 0,643-1,250 отн. ед. соответственно (среднее значение кубитального индекса изменялось в пределах - 1,45-3,41 отн. ед.; среднее значение гантельного индекса - 0,789-1,125 отн. ед.). Что касается качественного показателя «дискоидальное смещение», то у изученных пчел отмечены все три варианта признака (отрицательное, нейтральное и положительное). При сравнении полученных данных значений экстерьерных признаков со стандартными показателями, принятыми для рабочих особей разных пород медоносной пчелы [10, 27, 28], установлено, что среди всех исследованных пчелиных семей 13,5% семей демонстрировали полное соответствие крыловых параметров стандарту среднерусской породы, 5,3% - стандарту карпатской породы, 2,2% - серой горной кавказской породы. Например, по всем исследованным крыловым показателям стандарту среднерусской породы соответствовали пчелиные семьи с пасек с. Чалково (Чаинский район) и с. Тегульдет (Тегульдетский район), а также семья № 2 с пасеки с. Могочино 150 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. (Молчановский район) и семья № 2 с пасеки с. Дубровка (Зырянский район); стандарту карпатской породы - пчелиная семья с пасеки в д. Цветковка (Асиновский район) и семья № 1 с пасеки в окр. г. Томска (см. табл. 1). Около 56% исследованных семей соответствовали стандарту среднерусских пчел по большинству морфометрических показателей, но по отдельным признакам (преимущественно показателю «дискоидальное смещение») регистрировалось отклонение от принятых для этой породы значений. Так, отклонение только одного показателя «дискоидальное смещение» от стандарта среднерусской породы показано для семьи № 1 с пасеки с. Дубровка (Зырянский район), для двух семей с пасеки с. Заречный (Томский район), для семьи с пасеки с. Еловка (Кожевниковский район), что может указывать на следы гибридизации с породами южного происхождения. Отклонение нескольких морфометрических показателей у особей пчелосемьи от стандарта среднерусской породы, например кубитального индекса и дискоидально-го смещения, позволяет нам рассматривать эти семьи как гибриды на основе среднерусской породы (например, пчелосемьи с пасек с. Гореловка и д. Стрельниково Чаинского района, семья с пасеки с. Рыбалово Томского района и др.). Наблюдалась также противоположная картина, когда пчелиные семьи по исследованным параметрам крыла более соответствовали стандартам пород южного происхождения, но также имели отдельные признаки, характерные для среднерусской породы (гибриды на основе «южных» пород пчел). Так, выявлено 23,6% семей (от общего числа исследованных), пчелы которых имели большинство морфометрических показателей, характерных для карпатской породы, например, семьи № 1 и № 3 с пасеки с. Подгорное (Чаин-ский район), семья с пасеки п. Синий Утес (Томский район). Наконец, при использовании сравнительного анализа изменчивости морфометрических признаков и вариабельности локуса COI-COII мтДНК были идентифицированы пчелиные семьи (так называемые «семьи-перевертыши»), которые по морфометрическим показателям соответствовали среднерусской породе, тогда как мтДНК (выявлен вариант Q) указывала на происхождение семьи по материнской линии от породы южного происхождения (например, семья № 2 с пасеки п. Курлек Томского района) или, наоборот, по морфометрическим показателям семья более соответствовала «южной» породе, тогда как по мтДНК (вариант PQQQ) - среднерусской (например, семья № 1 с пасеки п. Курлек). Таким образом, исследование породного состава медоносных пчел Томской области с использованием морфометрического и мтДНК-анализа показало, что большинство пчелиных семей представлено гибридами между местным подвидом (среднерусской пчелой A. m. mellifera) и завезенными коммерческими линиями южного происхождения (преимущественно карпатской пчелой A. m. carpathica), что характерно для многих регионов России и Европы. Так, в Европе выявлен высокий уровень интрогрессии между Таблица 1 [Table 1] Значения морфометрических показателей у рабочих особей некоторых пчелиных семей с пасек Томской области [Values of morphometric indicators in workers of some bee colonies from apiaries of Tomsk region] Географическая локализация: район, населенный пункт [Geographical locality: district, place] Географические координаты точек сбора материала [Geo-Coordinates of the sampling sites] S -Z А ≡ о C о _о с®| "о 2□ Вариант локуса COI-COII мтДНК [Variant of the COI-COII mtDNA locus] Кубитальный индекс, относительные единицы [Cubital Index, relative units] Гантельный индекс, относительные единицы [Hantel Index, relative units] Дискоидальное смещение [Discoidal shift], % Широта, с.ш. [Latitude, N] Долгота, в.д. [Longitude, Е] Lim: min-max M±m Lim: min-max M±m - 0 + СЕВЕРНЫЕ РАЙОНЫ [Northern districts] Парабельский [Parabelskyl с. Парабель [v. Parabel] 58°41'52" 81=29'57" 1 38 PQQ 1,31-2,31 l,83±0,05 0,714-1,00 0,870±0,020 19,44 2,78 Чаинский [Chainsky] с. Подгорное [v. Podgornoe] 57°47'00" 82=39'00" 1 35 Q 1,68-3,21 2,56±0,07 0,879-1,122 0,998±0,010 17,14 51,43 31,42 т. 35 Q 1,35-2,87 2,19±0,10 0,797-1,100 0,910±0,010 34,30 45,70 20,00 3 35 Q 1,72-3,01 2,53±0,06 0,852-1,178 0,977±0,011 51,40 14,30 34,30 4 30 PQQ 1,50-2,00 l,75±0,05 0,700-1,000 0,858±0,013 Нет данных [No data] с. Чалково [v. Chalkovo] 57°55'45" 83=21'73" 1 30 PQQ 1,30-2,00 l,75±0,04 0,720-0,871 0,811±0,010 100,00 0,00 0,00 2 30 PQQ 1,32-2,00 l,57±0,04 0,712-0,851 0,789±0,010 100,00 0,00 0,00 3 30 PQQ 1,17-1,81 l,51±0,03 0,693-0,923 0,808±0,010 100,00 0,00 0,00 4 30 PQQ 1,32-1,82 l,53±0,03 0,722-0,903 0,802±0,010 97,00 3,00 0,00 с. Леботер [v. Leboter] 57°52'50" 83=11'50" Σ 50 PQQ∕Q 1,14-2,89 l,91±0,05 0,643-1,030 0,864±0,012 64,52 19,36 16,13 д. Стрельниково [v. Strelnikovo] 57°42'45" 82=26'48" 1 30 PQQ 1,60-2,36 2,00±0,06 0,686-0,938 0,883±0,013 56,00 44,00 0,00 с. Гореловка [v. Gorelovka] 57°28'00" 82=12'00" 1 30 PQQ 1,33-2,65 l,98±0,06 0,708-0,969 0,40±0,012 66,7 33,3 0,00 Молчановский Molchanovsky] с. Могочино [v. Mogochino] 57°42'42" 83=34'30" 1 30 PQQ 1,26-2,56 l,92±0,05 0,806-1,000 0,879±0,010 70,00 30,0 0,00 2 43 PQQ 1,36-2,00 l,73±0,02 0,693-0,923 0,821±0,006 100,0 0,00 0,00 3 30 PQQ 1,57-2,82 l,88±0,04 0,770-1,000 0,855±0,015 92,00 8,00 0,00 Кривошеинский [Krivosheinskyl с. Кривошеино [v. Krivosheino] 57°20'63" 83=55'80" Σ 55 PQQ 1,00-2,67 0,707-1,000 0,884±0,018 27,27 18,18 54,55 Тегульдетский [Teguldetskyl с. Тегульдет [v. Teguldet] 57°18'00" 88=10'00" 1 30 PQQQ 1,44-2,10 l,75±0,03 0,692-1,000 0,854±0,011 100,0 0,00 0,00 т. 30 PQQQ 1,28-1,90 l,50±0,05 0,707-0,923 0,823±0,012 93,30 6,70 0,00 3 30 PQQQ 1,26-2,22 l,74±0,04 0,701-0,914 0,825±0,010 100,0 0,00 0,00 табл. 1 [Table 1 (cont.)] Г еографическая локализация: район, населенный пункт [Geographical locality: district, place] Географические координаты точек сбора материала [Geo-Coordinates of the sampling sites] S ⅛ S о C -2 ⅛! "о Вариант локуса COI-COII мтДНК [Variant of the COl-COll mtDNA locus] Кубитальный индекс, относительные единицы [Cubital index, relative units] Гантельный индекс, относительные единицы [Hantel index, relative units] Диско ИДаЛЬ но е смепіение, % [Discoidal shift, %] широта [Latitude, N] Долгота, в.д. [Longitude, Е] Lim: min-max M±m Lim: min-max M±m - 0 + ЮЖНЫЕ РАЙОНЫ [Southern districts] Асиновский [Asinovsky] д. Цветковка [v. Tsvetkovka] 56°48'21" 85°50'10" 1 30 Q 1,68-3,64 2,51±0,06 0,867-1,210 l,050±0,010 4,00 20,00 76,00 д. Тихомировка [v. Tichomirovka] 56°55'50" 86°04'35" 1 30 PQQ∕Q 1,41-2,82 l,90±0,06 0,656-1,176 0,880±0,018 54,60 35,50 9,90 5^. Кужербак [v. Kuzherbak] 57°00'00" 86°09'00" Σ 50 PQQ∕PQQQ 1,45-2,91 2,20±0,05 0,733-1,000 0,858±0,012 66,00 32,00 2,00 Первомайский [Pervomaisky] д. Крутоложное [v. Krutolozhnoe] 57°04'38" 86° 14'20" 1 30 PQQ 1,50-2,72 l,78±0,04 0,800-1,053 0,911±0,031 16,70 76,70 6,60 Зырянский Zyryansky] с. Зырянское [v. Zyryanskoe] 56°49'50" 86°37'38" 1 30 PQQ 1,28-2,80 l,73±0,06 0,707-1,000 0,834±0,016 66,7 33,3 0,00 2 30 PQQ∕Q 1,43-2,35 l,86±0,04 0,733-1,057 0,885±0,011 10,00 46,70 43,30 с. Дубровка [v. Dubrovka] 56°43'45" 86°26'33" 1 30 PQQ 1,43-2,47 l,69±0,05 0,672-0,933 0,849±0,011 73,33 26,67 0,00 т. 30 PQQQ 1,36-2,22 l,68±0,05 0,733-1,000 0,842±0,010 93,30 6,70 0,00 Томский [Tomskvl п. Заречный [v. Zarechnyy] 56°39'03" 85° 18'57" 1 30 PQQQ 1,39-2,33 l,65±0,04 0,712-0,932 0,825±0,009 73,50 26,50 0,00 2 30 PQQQ 1,19-2,05 l,64±0,06 0,679-1,000 0,865±0,012 73,10 26,90 0,00 с. Семилужки [v. Semiluzhki] 56°37'05" 85°21'20" 1 26 PQQ 1,35-2,06 l,64±0,05 0,696-1,000 0,817±0,017 90,00 10,00 0,00 п. Ку^лек [V. Kurlek] 56° 13'02" 84°51'43" 1 28 PQQQ 1,74-3,29 2,14±0,07 0,857-1,053 0,937±0,100 32,14 57,14 10,72 т. 29 Q 1,30-2,29 l,66±0,04 0,735-0,965 0,878±0,011 72,40 27,60 0,00 с. Коларово [v. Kolarovo] 56°20'll" 84°56'35" 1 30 PQQ 1,25-2,11 l,70±0,03 0,667-0,917 0,804±0,011 79,40 20,60 0,00 т. 30 PQQ 1,45-2,80 l,78±0,06 0,754-1,000 0,846±0,013 58,30 33,30 8,40 п. Синий Утес [v. SiniiUtes] 56°20'07" 84°55'11" 1 30 Q 1,83-2,87 2,37±0,06 0,815-1,053 0,931±0,012 6,70 76,70 16,60 с. Рыбалово [v. Rybalovo] 56°30'14" 84°30'47" 1 30 PQQ 1,13-3,00 l,89±0,05 0,667-1,074 0,864±0,012 63,04 21,74 15,22 с. Бодажково [v. Bodazhkovo] 56°30'35" 85° 14'70" 1 30 PQQ 1,40-2,50 l,79±0,05 0,691-0,905 0,790±0,009 94,30 5,70 0,00 V. Губино [d. Gubino] 56°34'60" 84°37'60" 1 24 PQQ 1,15-2,53 0,714-0,917 0,819±0,012 29,17 20,83 50,00 Γ еографическая локализация: район, населенный пункт Географические координаты точек сбора материала [Geo-Coordinates of the sampling sites] S -Z л ≡ о C о о N Вариант локуса COI-COII мтДНК [Variant of the COI-COII mtDNA locus] Кубитальный индекс, относительные единицы [Cubital index, relative units] Гантельный индекс, относительные единицы [Hantel index, relative units] Дискоидальное смещение, % [Discoidal shift, %] [Geographical locality: district, place] Широта, с.ш. [Latitude, N] Долгота, в.д. [Longitude, Е] о Lim: min-max M±m Lim: min-max M±m - 0 + C. Яр [v.Yar] 56° 15'56" 84°93'82" 1 10 Q 1,76-4,09 2,58±0,28 0,800-1,000 0,924±0,025 30,00 10,00 60,00 oιφ. г. Томска 1 30 Q 1,95-3,73 2,53±0,07 0,964-1,250 l,069±0,021 6,61 10,00 83,33 [vicinity of Tomsk] 56°29'51" 84° 5 8'27" 2 30 Q 1,64-2,69 2,12±0,05 0,722-0,946 0,895±0,011 90,00 6,70 3,30 3 33 Q 2,0-5,56 3,41±0,02 0,905-1,310 l,125±0,016 0,00 3,00 97,00 Д. Кудринский участок [v. Kudrinsky uchastok] 56°32'80" 84° 40'16" 1 16 PQQ/ PQQQ 1,13-2,06 l,71±0,05 0,630-0,945 0,801±0,013 76,00 24,00 0,00 д. Просекино [v. Prosekino] 56°23'00" 85°04'00" 1 30 Q 1,33-3,25 l,98±0,07 0,750-1,100 0,911±0,120 26,67 50,00 23,33 Кожев H иковски й [Kozhevni ко VS к 11 д. Еловка [v. Elovka] 55°57'00" 83°43'60" 1 30 PQQ 1,36-2,67 l,67±0,05 0,714-0,964 0,845±0,090 63,30 36,60 0,00 СТАНДАРТЫ ПОРОД [Breed standards] Apis mellifera mellifera* 1,30-2,10 1,70 0,600-0,923 - - - - Apis mellifera mellifera** PQQ/PQQQ 1,30-1,90 1,5-1,7 0,600-0,923 - 91- 95,100 5-10 0,00 Apis mellfera carpathica* Q 2,30-3,00 2,65 - ≥ 0,925 0-5 0-20 80- 100 Apis mellfera caucasica* Q 1,70-2,30 2,00 - Не установлен [Not installed] 60-70 20- 30 3-5 Примечание. N - число исследованных образцов; Lim - пределы значения признака; M÷m - среднее значение признака (±стандартная ошибка); Σ - суммарная проба с пасеки (минимум 10 пчелиных семей). * - Европейский стандарт подвидов пчел, основанный на значениях кубитального и гантельного индексов [28]; ** - стандарты пород пчел, принятые в России. [7√6>fe. N - Number of samples examined; Lim - Limits of the value of the sign; M±m - Mean value of the sign = the standard error of the mean; Σ - Total sample from the apiary (minimum 10 bee colonies). * - European breed standard based on values of cubital and hantel indexes [28]; - Russian breed standard]. LA 154 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. подвидами разных эволюционных линий - М (A. m. mellifera и A. m. iberica) и С (A. m. ligustica и A. m. carnica) и произошла замена аборигенных подвидов медоносной пчелы завезенными [3, 10-12]. На территории России процессы интродукции подвидов из южных областей страны в более северные и восточные регионы (Урал, Сибирь, Алтай), где традиционно разводилась среднерусская пчела, также приобрели массовый характер в последние десятилетия [29, 40, 43]. Существование на одной территории (часто на одной пасеке) разных пород медоносной пчелы повышает уровень гибридизации медоносных пчел и создает неблагоприятный фон для сохранения генофонда среднерусской пчелы A. m. mellifera, первоначально культивируемой на территории Томской области. В отличие от многих стран Европы, где темная лесная пчела признана исчезающим подвидом и популяции A. m. mellifera являются уникальными [3, 10-14], на территории Томской области сохранились локальные популяции (пасеки) пчел, близких по комплексу признаков к среднерусской породе (рис. 3). Так, пчелиные семьи среднерусской породы выявлены на пасеках с. Могочино (Молчановский район), с. Чалково (Чаинский район), с. Тегульдет (Тегульдетский район), д. Дубровка (Зырянский район), с. Семилужки и п. Заречный (Томский район). Исследованные пасеки в с. Мого-чино, с. Тегульдет и с. Чалково расположены на относительно изолированных территориях северных районов области (Молчановский, Тегульдетский и Чаинский районы соответственно) и рассматриваются как потенциально «чистые», хотя отмечен единичный завоз пчел южного происхождения в эти районы. Пасеки в д. Дубровка, с. Семилужки и п. Заречный расположены в южных районах области (Зырянский и Томский), характеризующихся хорошо развитым пчеловодством и близким расположением пасек друг к другу. Вместе с тем пасека в п. Заречный (Томский район) существует более 50 лет и специализируется на разведении среднерусских пчел (по словам пчеловода, на пасеку в течение длительного времени не завозились новые семьи и постоянно проводится контроль породности семей). В условиях повсеместной гибридизации пчел необходимо совершенствовать генетические методы контроля чистоты пчелосемей. Эти исследования требуют молекулярных подходов как наиболее информативных и надежных. Так, исследования, контролирующие интрогрессию между эндемической А. m. mellifera и интродуцированными подвидами C-линии на территории Европы и России, проводились с использованием локусов мтДНК и микро-сателлитных локусов, ПЦР-ПДРФ и SNP маркеров [10-13, 32, 34, 35, 40, 44]. На основании широкомасштабных исследований, выполненных на территории Европы (поиск информативных маркеров был проведен из числа более 1 000 SNP с применением 5 различных аналитических методов), было разработано 5 панелей, состоящих из 48, 96, 144, 192 и 284 маркеров, информативных для определения предкового происхождения особей, которые авторы предлагают использовать для выявления и оценки примеси С-линий Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. 155 (в частности, А. m. ligustica и А. m. carnica, а также сочетание этих подвидов) в М-линию А. m. mellifera [13, 32]. Однако, для оценки примеси других подвидов линии С и/или их сочетаний (а также более сложных комбинаций) в М-линию требуется тестирование разработанных панелей. Наконец, уменьшенные варианты панелей (48 или 96 маркеров) не подходят для стандартного генетического анализа популяций, в том числе для определения аллельного разнообразия или для оценки изоляции расстоянием, генетического дрейфа или эффекта «горлышка бутылки» [13]. В настоящем исследовании для оценки характеристики генетического разнообразия медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, а также оценки процесса гибридизации пчел проведен анализ вариабельности микросателлитных локусов у медоносных пчел. MoIcbaQOVSky Рис. 3. Распределение пород и гибридов медоносной пчелы на пасеках Томской области согласно результатам анализа мтДНК и морфометрических показателей [Fig. 3. Distribution of honeybee subspecies and hybrids at apiaries of Tomsk region according to the analysis of mtDNA and morphometric parameters] 9 ApismeUiferameUifera О Apis meUifera carpatia Гибриды на основе среднерусской породы [ħybπds based ойтірт mβlltfβra nιeii^βra] Гибриды на основе карпатской породы Ihytffidsbased OaApismsllifeKicarpafica] Разнообразие медоносных пчел Томской области по микросателлитным локусам Для характеристики генетического разнообразия медоносных пчел, обитающих на территории Томской области, и выявления высокополиморфных 156 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. ДНК-маркеров была изучена изменчивость 9 микросателлитных локусов (A008, AC117, A043, A113, A024, Ap243, Ap049, H110, SV185) (табл. 2). Были сформированы четыре выборки, включающие образцы чистопородных и гибридных пчел: 1) среднерусские пчелы, полученные от семей A. m. mellifera и имеющие варианты PQQ или PQQQ локуса COI-COII мтДНК (М-линия); регистрировалось соответствие стандарту породы по морфометрическим признакам; 2) карпатские пчелы, полученные от семей A. m. carpathica, завезенных на территорию области из пчелопитомника, и имеющие вариант Q локуса COI-COII мтДНК (С-линия); регистрировалось соответствие стандарту породы по морфометрическим признакам; 3) пчелы, полученные от гибридных семей на основе среднерусской породы (выявлены варианты PQQ или PQQQ локуса COI-COII мтДНК, однако наблюдается несоответствие морфометрических показателей стандарту среднерусской породы); 4) пчелы, полученные от гибридных семей на основе карпатской породы (выявлен вариант Q локуса COI-COII мтДНК, однако наблюдается несоответствие морфометрических показателей стандарту карпатской породы). Все исследованные локусы были полиморфными: минимальное число аллелей зарегистрировано для локуса AC117 (4 аллеля); максимальное -для локуса A113 (15 аллелей); среднее число аллелей на локус - 8. Для пчел среднерусской породы минимальное число аллелей выявлено для локуса H110 (3 аллеля), максимальное - для локуса А113 (11 аллелей); для пчел карпатской породы минимальное число аллелей выявлено для локуса Ap243 (1 аллель); максимальное - для локуса A008 (9 аллелей); среднее число аллелей на локус для обеих пород составило 5. Кроме того, изученные локусы отличались по вариабельности спектра аллелей у пчел двух выборок (среднерусская и карпатская породы). Например, по локусу Ap243 у пчел карпатской породы зарегистрирован только один аллель «255» (все исследованные особи были гомозиготными), тогда как у пчел среднерусской породы выявлено 8 аллелей. В результате сравнительного анализа вариабельности изученных микро-сателлитных локусов у чистопородных пчел (среднерусских и карпатских пчел) для большинства локусов выявлены различия по спектру и/или частоте регистрации аллелей между подвидами. Кроме того, для некоторых локусов (А008, А043, А113, А024 и Ар049) зарегистрированы преобладающие аллели (встречались с частотой более 0,40), спектр которых отличался у пчел разных эволюционных линий (М и С) (см. табл. 2). Так, для локуса А008 преобладающим аллелем у A. m. mellifera (линия М) был аллель «162» (частота регистрации 0,87), тогда как у A. m. carpathica (линия С) - аллель «174» (частота регистрации 0,46); для локуса А113 преобладающий аллель у A. m. carpathica - «212» (частота регистрации 0,91), у A. m. mellifera - аллель «218» (частота регистрации 0,57). Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. 157 Таблица 2 [Table 2] Частота регистрации (±ошибка) преобладающих аллелей 9 микросателлитных локусов у пород медоносной пчелы (Apis mellifera mellifera и Apis mellifera carpathica) и гибридов разного происхождения [The frequency of registration (± error) of the predominant alleles of 9 microsatellite loci in honeybee breeds (Apis mellifera mellifera and Apis mellifera carpathica) and hybrids of different origin] Размер аллеля, пн [Allele size, bp] Apis mellifera mellifera [PQQ/PQQQ of the COI-COII locus, M-lineage] Apis mellifera carpathica [Q of the COI-COII locus, C-lineage] Гибриды на основе [Hybrids based on] Apis mellifera mellifera [PQQ/PQQQ of the COI-COII locus] Apis mellifera carpathica [Q of the COI-COII locus] Локус A008 [Locus A008] 162 0,868±0,014 0,026±0,013 0,721±0,018 0,687±0,021 174 0,023±0,006 0,455±0,040 0,083±0,011 0,124±0,015 Ho 0,226±0,024 0,500±0,057*** 0,409±0,028 0,463±0,032 He 0,243±0,023 0,729±0,028 0,459±0,023 0,505±0,026 N 306 78 316 246 Локус AC117 [Locus AC117] 181 0,292±0,019 0,031±0,017 0,443±0,024 0,278±0,020 185 0,517±0,020 0,959±0,020 0,343±0,023 0,534±0,022 Ho 0,389±0,028*** 0,082±0,039 0,446±0,034*** 0,391±0,031*** He 0,629±0,014 0,079±0,037 0,662±0,012 0,609±0,015 N 301 49 220 248 Локус A043 [Locus A043] 128 0,831±0,015 0,076±0,023 0,844±0,017 0,637±0,024 140 0,156±0,015 0,629±0,042 0,138±0,016 0,292±0,023 Ho 0,279±0,026 0,242±0,053*** 0,249±0,029 0,451±0,035 He 0,285±0,021 0,553±0,042 0,269±0,025 0,507±0,020 N 305 66 221 204 Локус A113 [Locus AJJ3] 212 0,107±0,013 0,906±0,023 0,171±0,018 0,203±0,019 218 0,571±0,021 0,013±0,009 0,571±0,024 0,545±0,023 Ho 0,521±0,029* 0,075±0,029* 0,567±0,034 0,572±0,032 He 0,596±0,017 0,177±0,041 0,626±0,023 0,645±0,020 N 290 80 211 236 Локус A024 [Locus A024] 92 0,660±0,019 0,066±0,021 0,500±0,025 0,472±0,024 100 0,186±0,016 0,427±0,042 0,194±0,020 0,421±0,024 102 0,007±0,003 0,463±0,043 0,043±0,010 0,082±0,013 Ho 0,505±0,029 0,529±0,061 0,480±0,036*** 0,636±0,033 He 0,513±0,020 0,598±0,022 0,687±0,019 0,593±0,012 N 307 68 196 214 Локус Ap243 [Locus Ap243] 252 0,014±0,006 0 0,184±0,023 0,395±0,027 255 0,427±0,024 1,000±0,000 0,367±0,029 0,214±0,023 263 0,330±0,023 0 0,306±0,028 0,157±0,020 Ho 0,439±0,034*** 0,000±0,000 0,252±0,037*** 0,331±0,037*** He 0,694±0,014 - 0,722±0,012 0,738±0,013 N 212 60 139 166 Локус Ap049 [Locus Ap049] 127 0,673±0,019 0,208±0,039 0,645±0,023 0,609±0,023 130 0,175±0,015 0,679±0,002 0,240±0,020 0,144±0,017 Ho 0,447±0,028 0,585±0,068 0,353±0,032*** 0,418±0,033*** He 0,501±0,020 0,490±0,048 0,518±0,021 0,556±0,020 N 309 53 221 225 158 Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова и др. Окончание табл. 2 [Table 2 (end)] Размер аллеля, пн [Allele size, bp] Apis mellifera mellifera [PQQ/PQQQ of the COI-COII locus, M-lineage] Apis mellifera carpathica [Q of the COI-COII locus, C-lineage] Гибриды на основе [Hybrids based on] Apis mellifera mellifera [PQQ/PQQQ of the COI-COII locus] Apis mellifera carpathica [Q of the COI-COII locus] Локус H110 [Locus H110] 162 0,789±0,017 0,806±0,038 0,625±0,024 0,806±0,019 Ho 0,333±0,028 0,389±0,066 0,559±0,035 0,349±0,032 He 0,343±0,022 0,320±0,049 0,531±0,021 0,325±0,025 N 282 54 204 229 Локус SV185 [Locus SV185] 263 0,288±0,021 0,094±0,026 0,310±0,024 0,222±0,020 266 0,117±0,015 0,266±0,039 0,216±0,021 0,290±0,022 269 0,578±0,022 0,359±0,042 0,367±0,025 0,205±0,020 Ho 0,527±0,032 0,594±0,061 0,662±0,034 0,676±0,033** He 0,569±0,017 0,712±0,014 0,718±0,010 0,781±0,006 N 243 64 192 207 Примечание. N - число исследованных образцов; Ho - наблюдаемая гетерозиготность; He - ожидаемая гетерозиготность. Значения частот преобладающих аллелей (частота регистрации >0,40) у разных подвидов выделены жирным шрифтом. * - отмечены статистически значимые отличия наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой (* - p

Скачать электронную версию публикации