ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ TiO2 и Al2O3НА БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS FLUORESCENSИ BACILLUS MUCILAGINOSUS | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2009. № 4 (8).

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ TiO2 и Al2O3НА БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS FLUORESCENSИ BACILLUS MUCILAGINOSUS

Изучено воздействие наночастиц TiO2 (размером 5,50 и 350 нм) иAl2O3 (размером 7,70 нм и 4 мкм) на бактерии Pseudomonas fluorescens AP-33 иBacillus mucilaginosus В-1574. Тестирование показало, что бактериальные тест-культуры наиболее чувствительны к дисперсной системе наночастиц оксидатитана (TiO2) размером 5 нм и дисперсной системе частиц оксида алюминия(Al2O3) размерами 70 нм и 4 мкм.

STUDYING OF THE INFLUENCE OF NANOPARTICLES TIO2 AND AL2O3ON BACTERIA PSEUDOMONAS FLUORESCENSAND BACILLUS MUCILAGINOSUS.pdf В настоящее время всё возрастающее внимание во всем мире уделяетсяперспективам развития технологий направленного получения и использова-ния материалов в диапазоне размеров до 100 нм. Уникальные свойства нано-материалов и их биологическая активность могут быть использованы в мик-роэлектронике, энергетике, строительстве, химической, фармацевтической,парфюмерно-косметической и пищевой промышленности и др. Однако досих пор не проведена полноценная оценка биологических рисков применениянаночастиц. За рубежом проблема безопасности наноматериалов в настоящеевремя выдвигается на первый план. Такие исследования проводятся в США,Евросоюзе, а также в ряде других международных организаций [1-3]. Необ-ходимо учитывать, что при переводе исходного вещества в наносостояниепроисходит коренное изменение его свойств. В литературе неоднократно от-мечалось, что неблагоприятное воздействие наночастиц нельзя с надежно-стью предсказать или установить, исходя из известных токсических свойствболее крупных частиц того же самого химического вещества [4, 5].Целью настоящей работы было изучение воздействия наночастиц оксидатитана и оксида алюминия на бактерии Pseudomonas fluorescens AР-33 и Bacillusmucilaginosus В-1574.Материалы и методы исследованийПроведение работ по исследованию воздействия наночастиц в зависимо-сти от их размера и интерпретация результатов соответствуют общеприня-тым методам изучения биокинетических параметров культур тестовых мик-98 И.В. Лущаева, С.Н. Моргалевроорганизмов. Принцип использованных методов основан на определенииудельной скорости роста популяции бактерий при их культивировании напитательной среде без внесения дисперсной системы наночастиц (ДС НЧ)TiO2 и Al2O3 и на питательной среде с их внесением в различной концентра-ции. Удельная скорость роста бактериальных периодических культур опре-делялась методом нелинейной регрессии [6, 7].В данной работе использовали культуры бактерий Ps. fluorescens AP-33 иBac. mucilaginosus В-1574. Известно, что в почвах доминирующее положениезанимают неспорообразующие флюоресцирующие бактерии рода Pseudomonasи спорообразующие бактерии рода Bacillus [8, 9]. Данные виды микроор-ганизмов присутствуют в микробоценозах практически всех почв. Изменениеих количества или свойств может повлиять на состав почвенного микробоце-ноза и, как следствие, привести к нарушениям химических свойств почв.Кроме того, в результате проведенных нами предварительных исследованийданные виды тест-культур почвенных микроорганизмов были отобраны какчувствительные к присутствию в среде ДС НЧ.Опыты проводили в трех повторностях. Прирост биомассы бактерий оце-нивали по изменению оптической плотности клеточной суспензии на спек-трофотометре КФК-3 при длине волны 590 нм.При проведении работ по оценке воздействия наночастиц в зависимостиот их размера бактерии высевали на питательный бульон (30 г готового сухо-го питательного бульона на 1 л дистиллированной воды). Первоначально го-товили концентрированные растворы питательной среды. Дисперсные систе-мы наночастиц TiO2 и Al2O3 из расчета концентрации 1; 0,1; 0,01; 0,001 и0,0001 мг/л среды добавляли в стерильную концентрированную питательнуюсреду. После внесения ДС НЧ в колбу с питательной средой содержимоеколбы тщательно перемешивали. В приготовленную питательную среду длякультивирования бактерий вносили посевной материал (суточную культурубактерий в количестве 5% от объема питательной среды). Культивированиеклеток проводили при температуре +28 ºС и необходимом уровне аэрации.Нанопорошки TiO2 и Al2O3 были получены в ООО «Мипор» (г. Томск).Дисперсные системы наночастиц были приготовлены в центре «Биотест-нано» Томского государственного университета.РезультатыИзучение воздействия наночастиц TiO2 на бактерии Ps. fluorescensAР-33 и Bac. mucilaginosus В-1574. В результате проведенных исследованийбыло оценено воздействие наночастиц TiO2 размером 5 и 50 нм и микрочас-тиц TiO2 размером 350 нм различных концентраций на бактерии Ps. fluorescensAР-33 и Bac. mucilaginosus В-1574.При культивировании бактерий в колбах с добавлением к питательной средеразличных концентраций ДС НЧ TiO2 были зафиксированы различия по оптиче-ской плотности культуры по сравнению с контролем без внесения ДС НЧ TiO2.Удельные скорости роста μ культур, рассчитанные по изменению оптическойплотности культур в экспоненциальной фазе роста, представлены в табл. 1.Изучение воздействия наночастиц TiO2 и Al2O3 99Т а б л и ц а 1Удельная скорость роста Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в контролеи при внесении в питательную среду ДС НЧ TiO2Удельная скорость роста культур (ч-1)в средах с добавлением ДС НЧ TiO2Тест- различных концентраций, мг/лкультураРазмер-ностьДС час-тицTiO2, нмУдельнаяскоростьростакультур вконтроле,ч-1 1 0,1 0,01 0,001 0,00015 0,1931±0,00560,1487±0,00420,1426±0,00390,1872±0,00540,1562±0,00680,1659±0,005750 0,1704± 0,00430,1725±0,00980,1760±0,01210,1886±0,00870,1776±0,01140,1824±0,0085Ps. fluorescens350 0,0982± 0,00520,0963±0,00480,0935±0,00320,0943±0,00520,0993±0,00360,0899±0,00215 0,2598±0,00860,3079±0,01240,3025±0,00960,3030±0,00540,3095±0,01180,3055±0,007850 0,1243±0,00540,1316±0,00360,1383±0,00280,1304±0,00750,1413±0,00530,1382±0,0042Bac. mucilaginosus350 0,0812± 0,00750,0929±0,00360,0835±0,00280,0720±0,00450,0873±0,00360,0804±0,0057Как видно из табл. 1, при культивировании бактерий Ps. fluorescens в пи-тательной среде с добавлением ДС НЧ TiO2 размером 5 нм удельная скоростьроста культуры во всех вариантах опыта ниже, чем в контроле. Однако мож-но отметить, что на последующих стадиях развития периодических бактери-альных культур (стадия замедления и стационарная фаза) происходит стиму-ляция роста бактериальных культур во всех опытных вариантах (рис. 1). Та-ким образом, выбранная для расчетов удельной скорости роста экспоненци-альная фаза развития периодических бактериальных культур не отражаетвлияния наночастиц, и в дальнейшей работе следует проводить расчет удель-ной скорости с использованием логистической кривой.При культивировании бактерий Bac. mucilaginosus с внесением ДС НЧTiO2 размером 5 нм в питательную среду удельная скорость роста культуры,по сравнению с контролем, увеличивается. Однако при выходе в стационар-ную фазу развития культуры наблюдается некоторое ингибирование ростабактерий, что также свидетельствует о необходимости выбора для расчетовлогистической кривой.Аналогичные результаты были получены для роста бактериальных куль-тур в присутствии ДС НЧ TiO2 размером 50 нм. Добавление дисперсной сис-темы микрочастиц TiO2 размером 350 нм практически не повлияло на ростбактерий Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus.В целом, присутствие в питательной среде ДС НЧ TiO2 размерами 5 и50 нм влияет на рост популяции бактерий: стимулирует рост Ps. fluorescens иподавляет рост Bac. mucilaginosus. Для интерпретации полученных данныхнеобходимо проведение дополнительных исследований.100 И.В. Лущаева, С.Н. Моргалев00,20,40,60,811,21,40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.едк 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лаа00,10,20,30,40,50,60,70,80,910 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.ед.к 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лббРис. 1. Динамика роста Pseudomonas fluorescens (а) и Bacillus mucilaginosus (б)в контроле (к) и в присутствии ДС НЧ TiO2 (5 нм)Изучение воздействия наночастиц Al2O3 на бактерии Ps. fluorescensAР-33 и Bac. mucilaginosus В-1574. В результате проведенных исследованийбыло оценено воздействие наночастиц Al2O3 размером 7 и 70 нм и микрочас-тиц Al2O3 размером 4 мкм в концентрациях ДС от 1 до 0,0001 мг/л на бакте-рии Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus., отн. ед. , отн. ед.Изучение воздействия наночастиц TiO2 и Al2O3 101При культивировании Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в колбах сдобавлением к питательной среде различных концентраций ДС НЧ Al2O3были определены удельные скорости роста культуры, рассчитанные поизменению оптической плотности культур в экспоненциальной фазе роста(табл. 2).Т а б л и ц а 2Удельная скорость роста Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosusв контроле и при внесении в питательную среду ДС НЧ Al2O3Удельная скорость роста культур (ч-1)в средах с добавлением ДС НЧ Al2O3Тест- различных концентраций, мг/лкультураРазмер-ность ДСчастицAl2O3Удель-ная ско-ростьростакультурв кон-троле,ч-11 0,1 0,01 0,001 0,00017 нм 0,1157±0,00860,1146±0,00280,1151±0,00480,1323±0,00130,1218±0,00110,1256±0,001270 нм 0,0915±0,00210,0848±0,00180,0846±0,00070,0891±0,00120,1551±0,00240,1339±0,0028Ps. fluorescens4 мкм 0,1003±0,00440,0979±0,00320,0813±0,00560,0948±0,00230,1120±0,00450,1048±0,00397 нм 0,3418±0,00350,3528±0,00630,3422±0,00720,3296±0,00320,3194±0,00260,3211±0,003570 нм 0,4561±0,00890,4175±0,01160,4624±0,00910,4579±0,00580,4365±0,00800,4198±0,0088Bac. mucilaginosus4 мкм 0,1975±0,00420,1848±0,00560,1772±0,00470,2123±0,00230,1936±0,00420,2468±0,0087В результате проведенных исследований установлено, что внесение ДС НЧAl2O3 размером 7 нм в малых концентрациях (0,01, 0,001 и 0,0001 мг/л) в пита-тельную среду для культивирования бактерий Ps. fluorescens незначительностимулирует удельную скорость роста бактериальной культуры, о чем свиде-тельствует увеличение удельных скоростей в данных опытных вариантах.Как и в отношении оксида титана, для оценки воздействия наночастиц ок-сида алюминия следует использовать расчет удельных скоростей по логисти-ческой кривой, т.к. удельные скорости, полученные при учете роста толькона стационарной фазе, противоречат экспериментальным данным, приведен-ным на рис. 2.Добавление ДС НЧ Al2O3 размером 7 нм в питательную среду для культиви-рования бактерий Bac. mucilaginosus стимулирует рост культуры на стадии за-медления - стационарной фазе, за исключением варианта с добавлением ДС НЧAl2O3 в концентрации 0,0001 мг/л, а учитывая только экспоненциальную частькривой, удельные скорости роста несколько ниже контрольных показателей.Удельная скорость роста бактерий Ps. fluorescens при культивировании напитательной среде с добавлением ДС НЧ Al2O3 размером 70 нм в концентра-циях 0,001 и 0,0001 мг/л возрастает, по сравнению с контролем, в 1,5 раза.102 И.В. Лущаева, С.Н. МоргалевПри культивировании бактерий Bac. mucilaginosus с внесением ДС НЧ Al2O3размером 70 нм в питательную среду удельная скорость роста культуры воз-растает, по сравнению с контролем, причем в данном опыте наблюдаетсяпрямая зависимость от концентрации, вносимой ДС НЧ Al2O3. Однако прирасчете удельных скоростей данной зависимости отмечено не было, что, ве-роятно, связано с неправильно выбранной моделью расчета.00,20,40,60,811,21,40 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.ед.к 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лРис. 3. Динамика роста Bac. mucilaginosus в присутствии ДС НЧ Al2O3 (7 нм)00,20,40,60,811,21,40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.ед.к 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лРис. 4. Динамика роста Bac. mucilaginosus в присутствии ДС НЧ Al2O3 (70 нм), отн. ед. , отн. ед.Изучение воздействия наночастиц TiO2 и Al2O3 103Внесение ДС микрочастиц Al2O3 размером 4 мкм в питательную среду длякультивирования бактерий Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus стимулировалорост обеих тест-культур (рис. 5, а, б).00,20,40,60,811,21,40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.ед.к 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лаа00,20,40,60,811,21,40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100Время, чОптическая плотность культуры Ех, отн.ед.к 1 мг/л 0,1 мг/л 0,01 мг/л 0,001 мг/л 0,0001 мг/лббРис. 5. Динамика роста Ps. fluorescens (а) и Bac. mucilaginosus (б)при воздействии ДС частиц Al2O3 размером 4 мкмТаким образом, при культивировании бактерий Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosusна питательной среде с добавлением ДС частиц Al2O3 размером 7,, отн. ед., отн. ед.104 И.В. Лущаева, С.Н. Моргалев70 нм и 4 мкм наблюдается стимуляция роста культуры бактерий. ДляPs. fluorescens наибольшая удельная скорость роста культуры достигается намалых концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л ДС частиц Al2O3 размером 70 нм и4 мкм. Для Bac. mucilaginosus эффект стимуляции роста отмечен на всех кон-центрациях всех исследованных размерностей ДС частиц Al2O3.ОбсуждениеВ результате проведенных исследований было выявлено, что бактерии раз-личных систематических групп по-разному реагируют на присутствие в средеДС НЧ. Происходит как угнетение, так и стимуляция роста тест-культур. Приэтом четкой зависимости от концентрации наночастиц не выявлено.Влияние нанопорошков на рост бактерий изучено недостаточно. По дан-ным Вильямса с соавт. [10], которые изучали динамику роста E. coli в при-сутствии наночастиц оксида кремния, оксида железа и наночастиц золота, небыло выявлено значимых различий роста культуры E. coli при добавлении всреды суспензии наночастиц по сравнению с контролем. Авторами было сде-лано предположение, что изменения происходят на более тонком клеточномуровне - на уровне гена или белков.В ходе проведенных исследований выявлено, что при воздействии нано-частиц на бактериальные тест-культуры существует зависимость от размер-ности и химической природы вещества. Тестирование показало, что бактери-альные тест-культуры наиболее чувствительны к ДС НЧ оксида титана раз-мером 5 нм и ДС оксида алюминия размерами 70 нм и 4 мкм. При оценкевоздействия дисперсных систем наночастиц необходимо рассматривать каж-дую ДС с определенной концентрацией наночастиц как самостоятельныйобъект оценки. Для интерпретации полученных результатов необходимо изу-чение механизмов воздействия наночастиц на бактерии. Можно предполо-жить, что бактерии Ps. fluorescens и Bac. mucilaginosus в некоторых случаяхпо-разному реагируют на введение одних и тех же наночастиц из-за принци-пиально различного строения клеточной мембраны.Исследование выполнено в рамках государственного контракта Государственного об-разовательного учреждения высшего профессионального образования «Томский государ-ственный университет» с Федеральным агентством по науке и инновациям№ 01.648.11.3005 от 11 сентября 2008 г. «Разработка методологии биотестирования и соз-дание средств обнаружения наночастиц в окружающей среде для оценки их безопасности,распространения и воздействия».

Ключевые слова

Pseudomonas fluorescens, тест-культуры, биотестирование, наночастицы, Bacillus mucilaginosus, nanoparticles, methods of biotesting, test cultures, Pseudomonas fluorescens, Bacillus mucilaginosus

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Моргалев Юрий НиколаевичНаучно-исследовательский институт биологии и биофизикиТомского государственного университетакандидат биологических наук, зав. лабораторией мозгового кровообращениядиректор центра «Биотест-нано»valeo@mail.tsu.ru
Лущаева Инна ВладимировнаНаучно-исследовательский институт биологии и биофизикиТомского государственного университетакандидат биологических наук, зав. секторомобщей микробиологииinna@res.tsu.ru
Всего: 2

Ссылки

Williams D.N., Ehrman S.H., Holoman T.R.P. Evaluation of the microbial growth response to inorganic nanoparticles // Journal of Nanobiotechnology. 2006. Vol. 4, № 3. P. 771-779.
Славнина Т.П., Инишева Л.И. Биологическая активность почв Томской области. Томск: Изд-во ТГУ, 1987. 216 с.
Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. Алма-Ата: Наука, 1982. 230 с.
Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных процессов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1993. 300 с.
Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 715 с.
Ostiguy C., Lapointe G., Trottier M. et al. Health effects of nanoparticles // Studies and research projects. IRSST. 2006. 52 р.
Heinlaan M., Ivask A., Blinov I., Dubourguier H.-Ch., Kahru A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus // Chemosphere. 2008. Vol. 71, iss. 7. P. 1308-1316.
Wang B. Acute toxicity of nano- and micro-scale zinc powder in healthy adult mice // Toxicology Letters. 2006. Vol. 161, iss. 2. P. 115-123.
Lin D. Phytotoxicity of nanoparticles: inhibition of seed germination and root growth // Environmental Pollutants. 2007. Vol. 150, iss. 2. P. 243-250.
Chen Z. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // Toxicology Letters. 2006. Vol. 163, iss. 2. P. 109-120.
 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ TiO2 и Al2O3НА БАКТЕРИИ <i>PSEUDOMONAS FLUORESCENS</i>И <i>BACILLUS MUCILAGINOSUS</i> | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2009. № 4 (8).

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ TiO2 и Al2O3НА БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS FLUORESCENSИ BACILLUS MUCILAGINOSUS | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2009. № 4 (8).

Полнотекстовая версия