Молекулярно-генетический анализ районовприкрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийныхкомаров Anopheles комплекса maculipennis | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2010. № 2 (10).

Молекулярно-генетический анализ районовприкрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийныхкомаров Anopheles комплекса maculipennis

С помощью микродиссекции политенных хромосом была выделена ДНК районаприкрепления XL хромосомы к оболочке ядра трофоцитов яичников Anophelesmesseae Fall. (района 2b-c), получена библиотека клонов в плазмидном векторе ипроведен анализ первичной последовательности ДНК этого района. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК показал, что район 2b-c содержит мобильныеэлементы, тандемные повторы и гены. Проведен поиск общих последовательностейДНК, характерных для районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus van Thiel. Большая часть этих последовательностей, способнасвязывать белки ядерного матрикса. Полученные результаты необходимы для оценки роли последовательности ДНК в реорганизации архитектуры хромосом в ядрахтрофоцитов малярийных комаров в процессе видообразования

MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF REGIONS OF CHROMOSOMEATTACHMENT TO NURSE CELLS NUCLEAR ENVELOPE OF ANOPHELESMALARIA MOSQUITOES FROM «MACULIPENNIS» COMPLEX.pdf Проблема организации генома в пространстве ядра в настоящее время яв-ляется чрезвычайно актуальной. Выделяют три иерархических уровня кон-троля генетической экспрессии - последовательность ДНК, структуру хрома-тина и внутриядерную организацию генетического материала [1, 2].Контроль экспрессии генов на первом уровне довольно хорошо изучен - онсвязан с работой цис-регуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры,сайленсеры, и транс-регуляторных факторов, включающих ДНК-связывающиетранскрипционные факторы и аппарат транскрипции. Второй уровень регуляциигенетической экспрессии связан с представлениями о нуклеосомном коде, когда,главным образом, посттрансляционные модификации гистонов определяюттранскрипционный статус последовательности ДНК. Наиболее сложная системаконтроля работы генома осуществляется на третьем уровне.Оказывается, что все процессы в ядре происходят в определенной областиядра. Так, было отмечено, что гетерохроматин, который представляет собой восновном повторенные последовательности, небольшое количество геновлибо участки генома, в которых транскрипция репрессирована, локализован,прежде всего, на периферии ядра, в то время как активно экспрессирующиесяучастки расположены в центре ядра [3]. Позиционирование хромосом в про-странстве ядра происходит за счет взаимодействия хроматина с белкамиядерного матрикса и, прежде всего, с белками ядерной ламины, которая рас-положена между внутренней ядерной мембраной и периферическим хрома-тином. В состав ядерной ламины входят фибриллярные белки - ламины ибелки внутри ядерной мембраны, которые с ними ассоциированы [4]. С эти-ми белками взаимодействуют как белки хроматина, так и ДНК. За контакт сбелками ядерного матрикса отвечают последовательности SAR/MAR (scaffoldassociated region/matrix attached region) [5].Изучение районов хромосом, осуществляющих контакт с ядерной оболоч-кой, имеет большое значение, т.к. неизвестны механизмы формирования ихорганизации в пространстве в разных тканях и у разных видов. Интереснымобъектом для исследования районов прикрепления хромосом к ядерной обо-лочке являются малярийные комары Anopheles комплекса maculipennis.В клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов, трофоцитов яичников этихнасекомых формируются политенные хромосомы.Ранее было отмечено [6], что близкородственные виды малярийных кома-ров комплекса maculipennis отличаются по пространственной организациихромосом в ядрах трофоцитов, а именно - по наличию либо отсутствию кон-тактов с оболочкой ядра, районам локализации этих контактов на хромосо-мах и морфологическим особенностям районов прикрепления. Так, напри-мер, у An. messeae Fall. Х-хромосома взаимодействует c ядерной оболочкойрайоном 2b-c, который находится в середине плеча, хромосома 2 не образуетконтакта с ядерной оболочкой, а хромосома 3 крепится к оболочке ядра при-центромерным районом. Пространственная организация хромосомAn. atroparvus van Thiel. отличается от An. messeae только по Х-хромосоме,которая образует контакт с оболочкой ядра прицентромерным районом. Сле-дует отметить, что несмотря на сходство взаимоотношения хромосом 2 и 3 сядерной оболочкой, у этих видов морфологические особенности районовприкрепления являются специфичными.Целью настоящего исследования было определить первичную последова-тельность ДНК района прикрепления XL-хромосомы An. messeae (района2b-c), а также провести сравнительный анализ этой последовательности с по-следовательностями ДНК районов прикрепления хромосом 3R An. messeae(района 32d) и XL An. atroparvus (района 5а). Результаты данной работы по-зволят определить последовательности ДНК, которые характеризуют районыприкрепления, а также выявить межвидовые особенности и различия после-довательностей этих районов разных хромосом одного вида.Материалы и методы исследованияМикродиссекция хромосом. В качестве материала для исследования ис-пользовали малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis. СамкиМолекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 125An. messeae были собраны в природных популяциях, а самки An. atroparvusбыли взяты из лабораторной культуры. Препараты готовили по стандартнойметодике [7]. Проводили микродиссекцию трех районов политенных хромо-сом - района 2b-c XL-хромосомы An. messeae (рис. 1, А), 5а XL An. atroparvus(рис. 1, Б) и 32d An. messeae (рис. 1, В) - как описано в [8].Рис. 1. Хромосомы XL An. messeae (А), XL An. atroparvus (Б), 3R An. messeae (В):контуром выделены микродиссектированные районы 2b-c An. messeae, 5аAn. atroparvus и 32d An. messeae; масштабная линейка 20 мкмПолучение библиотеки клонов ДНК района 2b-c An. messeae в плазмидеpJET 1.2/blunt. Библиотеку клонов ДНК района 2b-c An. messeae получали вплазмиде pJET 1.2/blunt с использованием наборов реактивов CloneJet PCRCloning Kit (Fermentas), TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas),GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) согласно предложенным протоко-лам. Было получено 485 колоний E. coli несущих плазмиды со встройками, ивыделено 323 образца плазмидной ДНК.Определение первичной последовательности ДНК района 2b-cAn. messeae. Определение первичной последовательности в настоящей рабо-те осуществляли с помощью четырехкапиллярного автоматического анализа-тора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Была получена первичнаяпоследовательность для 300 фрагментов ДНК изучаемого района.Анализ последовательности ДНК района 2b-c An. messeae in silico. По-лученные после секвенирования последовательности ДНК клонов анализиро-вали in silico. Последовательность клонов проверяли на гомологию с генома-ми An. gambiae в TBLASTX VectorBase (vectorbase.org/Tools/BLAST/), с ге-номами видов Drosophila в BLASTN Ensembl Metazoa (metazoan.ensembl.org/Anopheles_gambiae/blastview/) и FlyBase (flybase.org/blast). Кроме того, былпроведен поиск мобильных генетических элементов (МГЭ) с помощью про-грамм RepeatMasker (repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker) и Censor(girinst.org/censor). Полученные последовательности анализировали на нали-чие тандемных повторов в TandemRepeatsFinder (tandem.bu.edu/trf/trf.html).Была проведена оценка фрагментов на потенциальное сродство с белкамиядра с использованием программы ChrClass [9].Дот-блот-гибридизация ДНК проб районов 32d An. messeae и 5aAn. atroparvus с библиотекой клонов района 2b-c An. messeae. Для приготовле-126 Г.Н. Артемов, В.Н. Стегнийния зонда использовали реакцию ник-трансляции в присутствии биотин-11-дУТФ. Около 50 нг ДНК клонов библиотеки района 2b-c An. messeae после ам-плификации плазмидной ДНК наносили на положительно заряженную нитро-целлюлозную мембрану (Fermentas). Гибридизацию, отмывку и детекцию про-водили с помощью Biotin detection kit (Fermentas) по предложенному протоколу.Результаты исследования и обсуждениеОбщая протяженность области, первичная последовательность которойоколо 72 тыс. п. н. 58% AT-пар нуклеотидов, позволяет утверждать, что рай-он 2b-c представляют АТ-богатые последовательности. ПоследовательностьДНК этого района анализировали на предмет МГЭ, тандемных повторов игенов. В изучаемом районе были выявлены все классы нуклеотидных после-довательностей. Тандемных повторов обнаружено мало (табл. 1). Среди нихвыявлены микросателлиты (Mes2b-c_273, Mes2b-c_426, Mes2b-c_430) и ми-нисателлиты (Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_229, Mes2b-c_273, Mes2bc_353) с небольшим числом копий.Т а б л и ц а 1Тандемные повторы района 2b-c An. messeaeКлон 2b-cAn. messeae Последовательность консенсуса ДлинаконсенсусаЧислоповторовMes2b-c_2 AGGAAGAAAACAG 13 2Mes2b-c_157 TTATGATGAAAAAG 14 1,9Mes2b-c_229 GAAGTATGAAAGA 13 3,8Mes2b-c_273 AAAG 4 8,8Mes2b-c_353 TTTTGTTTTGTTTGG 15 1,9Mes2b-c_426 TAC 3 40,7Mes2b-c_430 TC 2 13,5Сателлитов обнаружить не удалось, видимо, по той причине, что анализуподвергались фрагменты, по длине не превышающие в среднем 250 п. н.Следует обратить внимание, что тандемные повторы, которые входят в со-став клонов Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_175, Mes2b-c_229 и Mes2bc_273, имеют мотивы AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG. Эти мотивы гомоло-гичны консенсусу AAAAG, описанному для ДНК ядерной ламины гепатоци-тов мыши [10].Анализ показал большое разнообразие МГЭ в районе 2b-c An. messeae(табл. 2). Были обнаружены LTR-ретротранспозоны и LINE-элементы, а так-же транспозоны, однако SINE, MITE и гелитроны в районе 2b-c не найдены.Были выявлены МГЭ, характерные для An. gambiae, а также МГЭ, описанныеу представителей одноклеточных, позвоночных, растений и других таксонов.Эти МГЭ имеют довольно низкий процент дивергенции с обнаруженными уAn. messeae даже по сравнению с МГЭ семейства Gypsy An. gambiae.Поиск уникальных последовательностей в районе 2b-c An. messeae позво-лил выявить пять генов (табл. 3). Найденные уникальные последовательностиМолекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 127оказались гомологичны генам An. gambiae, функция которых неизвестна. Од-нако для большинства генов были определены ортологи у D. melanogaster.Т а б л и ц а 2Мобильные элементы района 2b-c XL хромосомы An. messeaeСемейство MГЭ MГЭ/организм Гомология,%L1 L1_SS, L1MC4_5end, L1_Mur2_orf2, L1MA6,L1MB3_EC, L1MB 75-91CR1 L2A/Eutheria; CR1-4_AG/Anopheles gambiae 66-71RTE RTE-9_SP/Strongylocentrotus purpuratus 88; 91Penelope Penelope-13_HM/Hydra magnipapillata 91R4 EhRLE2/Entamoeba histolytica 72LINEOutcast Outcast/Anopheles gambiae 74LTR/Gypsy Gypsy43-I_AG-int/Anopheles gambiae 70LTR/BEL BEL13-I_AG/Anopheles gambiae 65; 71LTR TONT1_LE_I/Solanum lycopersicum;AGM1/Anopheles gambiae 79; 67LTRERV/ERV1 HARLEQUIN, ZFERV-2-I_DR/Chordata 72; 80EnSpm EnSpm-3_HV/Triticeae, EnSpm-6_VV/Vitis vinifera 67-83DNA/P P1_AG/Anopheles gambiae 89-94Sola Sola1-7_AP, Sola1-9_AP/Acyrthosiphon pisum 91; 72Polinton Polinton-2_NV/Nematostella vectensis 72MuDR MUDSOLT1/Solanum tuberosum 76hAT CHARLIE3/Eutheria 86Chapaev Chapaev3-2_AC/Oryzias latipes 69ТранспозоныpiggyBac/Looper LOOPERN2_DR/Danio rerio 72Примечание. Жирным шрифтом выделены МГЭ, описанные у An. gambiae.Т а б л и ц а 3Генетический состав района 2b-c An. messeaeКлон 2b-c Гомолог у An. gambiaeAn. messeae Ген E-value Хромосома/районОртолог уD. melanogasterMes2b-c_144 AAGAP000357 5,5e-07 XL/3B -Mes2b-c_198 AAGAP006662 2e-10 2L/25D CG3165Mes2b-c_255 AAGAP001531 3e-23 2R/8B CG6125Mes2b-c_263 AAGAP005897 3e-04 2L/23С CG5087Mes2b-c_425 AAGAP000621 2e-47 X/1C, X/5D CG3108Примечание. E-value - вероятность случайной гомологии.С целью поиска последовательностей гомологичных для районов прикре-пления хромосом An. messeae был проведен скрининг библиотеки клоноврайона 2b-c An. messeae с использованием ДНК района прикрепления хромо-сомы 3R An. messeae (район 32d). В результате эксперимента было показано,что общими для районов 2b-c и 32d An. messeae являются последовательно-сти МГЭ типа DOC6_DM, ретротранспозоны семейств L1 и Erv (табл. 4). По-следовательность клона Mes2b-c_403, которая представлена в прицентромер-ных районах хромосом X, 2L, 2R и некартированных сайтах An. gambiae,128 Г.Н. Артемов, В.Н. Стегнийимеет свойство образовывать контакт с ядерной ламиной. Однако с большейдостоверностью ДНК ядерной ламины выявлялась в клонах, содержащихМГЭ L1MC4_5end и HARLEQUIN. Все клоны, кроме Mes2b-c_417, обладаютсвойствами потенциального взаимодействия с ядерными структурами.Т а б л и ц а 4Характеристика гомологичных последовательностей районовприкрепления хромосом XL и 3R An. messeaeКлон 2b-c МГЭAn. messeae Название Гомология, %Взаимодействие с бел-ками или SAR/MARMes2b-c_18 DOC6_DM 44 СК, SAR/MARMes2b-c_346 L1MC4_5end 85 Ядерная ламинаMes2b-c_383 HARLEQUIN 72 Ядерный матрикс,ядерная ламинаMes2b-c_390 L1HS 91 Ядерный матриксMes2b-c_417 L1MEf_5end 75 -Тандемные повторыКонсенсус ПериодMes2b-c_431 AAAACACATT 2,2 Ядерный матриксДругие последовательностиMes2b-c_204, Mes2bc_277, Mes2b-c_395,Mes2b-c_432, Mes2bc_403, Mes2b-c_455Ядерный матрикс,SAR/MAR,СКядерная ламинаПримечание. СК - синаптонемальный комплекс.Для поиска эволюционно-консервативных элементов, которые характери-зуют районы прикрепления XL-хромосом видов An. messeae и An. atroparvus,был проведен скрининг библиотеки клонов 2b-c An. messeae с помощьюДНК-пробы района 5а An. atroparvus (табл. 5). В результате скрининга быловыявлено 11 последовательностей, среди которых отсутствовали кодирую-щие белки. Около половины выявленных клонов представляли собой рет-ротранспозоны, и лишь в одном клоне (Mes2b-c_199) был найден тандемныйповтор. Большинство фрагментов после анализа в программе ChrClass былоотнесено к классу взаимодействующих с белками розеткоподобных структури внутриядерным матриксом фибриллярно-гранулярной сети. В ходе анализабыли найдены клоны, характерные для 2b-c An. messeae, 32d An. messeae и 5аAn. atroparvus, - LINE-элементы (Mes2b-c_390 и Mes2b-c_417), и последова-тельность клона Mes2b-c_395, которая способна потенциально взаимодейст-вовать с белками ядерного матрикса.Таким образом, было установлено, что в состав района 2b-c XL-хро-мосомы An. messeae входят в основном повторенные последовательности -тандемные повторы и мобильные элементы, тогда как генов в данном районеобнаружено мало. Эти данные свидельствуют о сходстве первичной последо-вательности района 2b-c с гетерохроматиновыми районами хромосом.В результате сравнения последовательностей ДНК районов прикрепленияхромосом разных видов были выявлены гомологичные последовательности,Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 129большая часть которых способна взаимодействовать с белками внутриядер-ных структур.Т а б л и ц а 5Характеристика последовательностей, общих для районов прикрепленияхромосомы XL An. messeae и An. atroparvusКлон 2b-c МГЭAn. messeae Название Гомология, %Взаимодействие сбелками илиSAR/MARMes2b-c_3 Gypsy43-I_AG-int 70,79 Ядерная ламинаMes2b-c_243 ERV3 90,62 -Mes2b-c_390 L1HS 91,20 Ядерный матриксMes2b-c_417 L1MEf_5end 75,00 -Тандемные повторыКонсенсус ПериодMes2b-c_199 ТТТТТТС 2,9 -Другие последовательностиMes2b-c_153 Ядерная ламинаMes2b-c_158, Mes2b-c_195,Mes2b-c_337, Mes2b-c_395,Mes2b-c_418Ядерный матриксЭти данные свидетельствуют о функциональном сходстве этих районов,которое является отражением их свойства взаимодействовать со структурны-ми элементами ядра. Однако районы прикрепления разных хромосом должныиметь различия в организации, которые определяют специфику их взаимоот-ношения с ядерной оболочкой. Результаты сравнения последовательностейДНК хромосом позволили выявить эти различия.Предположено, что районы прикрепления хромосом составляют следую-щие элементы: 1) эволюционно консервативные (обнаруженные в результатесравнения 2b-c An. messeae и 5а An. atroparvus); 2) специфичные для каждогорайона прикрепления (последовательности района 2b-c, не выявленные прискрининге библиотеки клонов); 3) консервативные для всех районов прикре-пления хромосом (гомологичные последовательности трех сравниваемыхрайонов прикрепления). Гипотеза подтверждается данными анализа последо-вательности ДНК прицентромерного района хромосомы 2 An. atroparvus [11],в котором авторы выявили хромосомоспецифичные и универсальные после-довательности.Полученные результаты указывают на сложную организацию районовприкрепления хромосом. Необходимо определить причины разнообразияМГЭ в этих районах. Возможно, что перемещения МГЭ и ассоциированных сними SAR/MAR способны изменять локализацию районов прикрепления нахромосомах либо приводить к возникновению новых сочетаний ассоцииро-ванных с ядерной оболочкой последовательностей и тем самым изменятьпространственную организацию ядра.

Ключевые слова

Anopheles, пространственная организация ядра, политенные хромосомы, мобильные элементы, повторенные последовательности ДНК, malaria mosquitoes, nucleus spatial organization, polytene chromosomes, transposable elements, repetitive DNA

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Артемов Глеб НиколаевичБиологический институт Томского государственного университетааспирант кафедры цитологии и генетикиcenter_cu@res.tsu.ru
Стегний Владимир НиколаевичБиологический институт Томского государственного университетадоктор биологических наук, профессор,заведующий кафедрой цитологии и генетикиstegniy@res.tsu.ru
Всего: 2

Ссылки

Van Driel R., Fransz P.F., Verschure P.J. The eukaryotic genome: a system regulated at different hierarchical levels // Journal Cell Science. 2003. Vol. 116. P. 4067-4075.
Misteli T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function // Cell. 2007. Vol. 128. P. 787-800.
Cremer M., Kupper K., Wagler B. et al. Inheritance of gene density-related higher order chromatin arrangements in normal and tumor cell nuclei // Journal Cell Biology. 2003. Vol. 162. P. 809-820.
Gruenbaum Y., Margalit A., Shumaker D.K., Wilson K.L. The nuclear lamina comes of age // Molecular Cell Biology. 2005. № 6. P. 21-31.
Wang T.Y., Chai Y.R., Yuan B.M. Effects and the mechanism of nuclear matrix attachment regions on transgene expression // Chinen Journal Cell Biology. 2004. Vol. 26, № 6. P. 587-590.
Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе маля- рийных комаров // Доклады AН СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231.
Kumar V., Cornel A.J., Mukabayire O. In situ hybridization to Anopheles polytene chromosomes // Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. London: Chapman and Hall, 1997. P. 337-345.
Рубцов Н.Б., Алексеенко А.А., Беляева Е.С. и др. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster // Генетика. 1999. Т. 35, № 1. С. 55-61.
Rogozin I.B., Glazko G.V., Glazkov M.V. Computer prediction of sitesassociated with various elements of the nuclear matrix // Briefings in bioinformatics. 1999. Vol. 1, № 1. P. 33-44.
Шабарина А.Н., Прилепа Е.И., Глазков М.В. Необычная нуклеотидная последователь- ность ДНК, выделенная из ядерных оболочек гепатоцитов мыши // Генетика. 2006. Т. 42, № 7. С. 879-886.
Grushko O.G., Sharakhova M.V., Stegnii V.N., Sharakhov I.V. Molecular organization of heterochromatin in malaria mosquitoes of Anopheles maculipennis subgroup // Gene. 2009. Vol. 448. P. 192-197.
 Молекулярно-генетический анализ районовприкрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийныхкомаров <i>Anopheles </i>комплекса <i>maculipennis</i> | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2010. № 2 (10).

Молекулярно-генетический анализ районовприкрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийныхкомаров Anopheles комплекса maculipennis | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2010. № 2 (10).

Полнотекстовая версия