Характеристика антагонистической активности Staphylococcus aureusпри межмикробных взаимодействиях | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Характеристика антагонистической активности Staphylococcus aureusпри межмикробных взаимодействиях

На примере антагонистической активности S. aureus показано, что биологические свойства бактерий могут изменяться в условиях межмикробных отношений, при взаимодействии с ассоциативными микроорганизмами, которые действуют по направлениям: индифферентное, стимулирующее, ингибирующее и инвертирующее. Эффекторами регуляции выступают метаболиты и фрагменты клеточных стенок ассоциантов. Способность регулировать межмикробные отношения в системе «прокариот - прокариот» является новым свойством фрагментов клеточных бактерий и грибов. Изменение антагонизма осуществляется за счет регуляции продукции и/или активности антимикробных веществ, например лизоцима. Полученные результаты обосновывают положение, что антагонистическая активность штамма - результат межмикробных отношений, при которых возможность и выраженность продукции антимикробных веществ активным штаммом определяются ассоциативными микроорганизмами. Обсуждается роль ассоциативных микроорганизмов в процессах формирования и функционирования микробиоценозов. В частности, предложен новый механизм колонизационной резистентности микробного сообщества - снижение колонизационного потенциала аллохтонных микроорганизмов. Микробные ингибиторы факторов колонизации патогенных микроорганизмов перспективны для разработки новых противоинфекционных препаратов.

Characteristic of antagonistic activity of Staphylococcus aureusin cross-species interaction between microorganisms.pdf ВведениеВ природе бактерии обитают не обособленно, а в окружении других микро-организмов, поэтому их свойства могут отличаться от наблюдаемых в чистыхкультурах, что диктует необходимость исследования свойств микроорганизмов вусловиях межмикробных отношений. Антагонизм - тип симбиотических отно-шений между организмами, в результате которых один из участников взаимо-действий (антагонист) получает селективное преимущество в борьбе за выжива-ние за счет конкурентных свойств: высокие ростовые и адаптационные возмож-ности, продукция антибиотических веществ. Антагонистические свойства бакте-рий - один из механизмов формирования и функционирования микробного со-общества, не являются исключением и микробиоценозы человека [1].Ранее нами была показана потенциальная роль окружающих ассоциатив-ных микроорганизмов (АМ) в функционировании сообщества, в частности ввыполнении им защитной функции, заключающаяся в стимуляции ростовыхи антимикробных свойств доминантных бактерий [2-4]. Представляет инте-рес изучение роли АМ при формировании микробиоценоза, в частности приколонизации биотопа аллохтонными микроорганизмами.К микроорганизмам, обладающим высоким колонизационным потенциалом,относятся представители рода Staphylococcus sp., которые широко распростране-ны в природе, особенно на поверхности тела теплокровных животных и челове-ка, обладают широким спектром факторов колонизации - адгезинами и антаго-нистической активностью (АА), а также высокой выживаемостью за счет нали-чия прочной клеточной стенки, факторов персистенции, выраженной способно-сти к биопленкообразованию и др. [5, 6]. Типовой вид - Staphylococcus aureus[7]. Как правило, патогенные бактерии, к которым относится и золотистый ста-филококк, являются аллохтонными для микробиоценозов макроорганизма. Та-ким образом, S. aureus является удобным объектом для исследования измененияколонизационного потенциала микроорганизмов в условиях межмикробных от-ношений и изучения роли АМ в формировании микробиоценоза.Цель исследования - изучить антагонистическую активность и продукциюантимикробных веществ Staphylococcus aureus при межмикробных взаимо-действиях.Материалы и методики исследованияВ работе использовали микроорганизмы, выделенные из различных био-топов человека. Штамм-антагонист S. aureus (колонизатор) выделен с кожирук бактерионосителя, остальные микроорганизмы - из женского репродук-тивного тракта, включая штаммы-ассоцианты Lactobacillus casei, Enterococcusfaecalis, S. hominis, Corynebacterium minutissimum, Enterobacter agglomerans,E. cloacae и Candida albicans, индикаторные тест-культуры L. acidophilus,L. casei и S. hominis (чувствительность была определена в сериипредварительных экспериментов).Идентификацию бактерий проводили общепринятыми методами по Берд-жи [7], с использованием тест-систем Api («Bio Meriex», Франция) и диффе-ренциально-дагностической среды для кандид Nickerson (Bi.G.G.Y - agar,«HiMedia», Индия).Культивирование лактобацилл и кандид проводили в микроаэрофильныхусловиях при 37.С, 20-24 ч, на среде Манна-Рогоза-Шарпа («HiMedia», Ин-дия), остальных микроорганизмов - в аэробных условиях при 37.С, 20-24 ч, в1,5%-ной пептонной воде, на основе гидролизата рыбной муки («Питатель-ные среды», Россия).Для моделирования межмикробных отношений в системе «штамм-антагонист S. aureus - штамм-ассоциант» использовали оригинальный метод [8],основанный на тестировании антимикробной активности исследуемого антаго-ниста, обработанного метаболитами и пептидогликаном клеточных стеноккультуры-ассоцианта. Антагонизм клеточных компонентов ассоциативныхмикроорганизмов исключали. Метаболиты получали центрифугированиемкультуральной жидкости при 3000g 20 мин, стерилизовали фильтрованием(0,30 мкм, «Millipore», США). Пептидогликан клеточных стенок бактерий по-лучали по Герхардту с дополнениями [2, 9], стерилизовали автоклавированиемпри 0,5 атм 30 мин. Аналогичным способом готовили и фрагменты клеточныхстенок C. albicans. При получении пептидогликана из клеточных стенок гра-мотрицательных энтеробактеров перед всеми операциями биомассу бактерийобрабатывали горячим (65.С) 10%-ным водным раствором фенола для удале-ния липополисахарида. Исследование традиционными методами газожидкост-ной и высокоэффективной жидкостной хроматографией состава образцов пеп-тидогликана показало содержание нетипичных (согласно [10]) для клеточныхстенок данного вида микроорганизма аминокислот и нейтральных углеводовпо 0-3,0% (по массе) и отсутствие жирных кислот, что говорит о достаточнойчистоте препарата. В работе использовали количество фрагментов клеточныхстенок ассоцианта, равное оптической плотности бульонной культуры.Антагонистическую активность выражали в процентах угнетения приростаКОЕ индикаторной культуры при инкубации с метаболитами антагониста, посравнению с приростом КОЕ культуры при влиянии среды роста антагониста.Влияние ассоциантов на ростовые свойства антагониста оценивали поприросту оптической плотности (ОП) его бульонной культуры, измереннойпри 492 нм (фотометр Multiscan Ascent («Thermo Labsystems», EC)) в стан-дартных 96-луночных планшетахную активность выражали в мкмоль продукта, образующегося за 1 час инку-бации при 37.С в 0,025М натрий-калий-фосфатном буфере (рН=6,2) субстра-та с культуральной жидкостью исследуемой культуры, в пересчете на 1 мл(мкмоль/ч·мл). Реактивы «Sigma-Aldrich» и «Реахим» (Россия).Результаты представлены в виде средней арифметической и стандартногоотклонения (М + σ), которые обрабатывали с использованием U-критерияМанна-Уитни [13]. Различие между выборками считали достоверным приотвержении нулевой гипотезы на уровне статистической значимости р0,05)S. hominis МПГИИИИИ0680+241000+5C. minutissimum МПГ-+-+И0640+151520+10E. agglomerans МПГИ-00-080+28720+36E. cloacae МПГИИИ0-И1040+120, (р>0,05)840+20C. albicans МКС+0+0+- - вПримечание. а - КК - вид клеточного компонента: метаболиты (М), пептидогликан (ПГ) иКС (клеточные стенки). Действие на антагонизм штамма-антагониста: «0» - индиффе-рентное, «+» - стимулирующее, «-» - ингибирующее, «И» - инвертирующее; б - обнару-жено большое содержание нейтральных углеводов, что не позволило считать образец пеп-тидогликаном, анализ КС грибов не проводили; в - лизоцимная активность не определена,так как в культуральной жидкости данных ассоциантов содержалось большое количествовосстанавливающих сахаров (глюкоза МРС-среды), препятствующих анализу. Все изме-нения антагонистической и лизоцимной активностей статистически значимо (р0,05).При исследовании антагонистических отношений в ассоциации из близ-кородственных бактерий установлено, что регуляции в условиях межмикроб-ных отношений подвержен не только межродовой, но и внутриродовой анта-гонизм. На примере отношений между антагонистом S. aureus и тест-культурой S. hominis показано, что АА золотистого стафилококка снижается,вплоть до инверсии, после его обработки клеточными компонентами изучен-ных АМ, особенно их метаболитами (см. таблицу). Например, активностьS. aureus в контроле составила 30±6%, при действии L. casei наблюдали ин-вертирование признака до -182±15%, C. minutissimum - до -2±0,5%, и самогоS. hominis - до -60±2%. E. agglomerans и E. cloacae - снижали до 5±2% и14,75±1,25%, соответственно (для всех р

Ключевые слова

cell wall, colonization resistance, colonization, antagonism, cross-species, microbial ecology, клеточная стенка, колонизационная резистентность, колонизация, антагонизм, межмикробные отношения, экология микроорганизмов

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Семенов Александр ВасильевичИнститут клеточного и внутриклеточного симбиоза УО РАН (г. Оренбург)кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов формирования микробиоценозов человекаlever3@yandex.ru
Всего: 1

Ссылки

Xu X.-L., Lee R., Fang H.-M., Wang Y.-M. et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p // Cell Host&Microbe. 2008. Vol. 4, № 1. Р. 28-39.
Головина И.Г. Литические ферменты микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1972. № 8. С. 108-134.
Peterson S., Dunn A., Klimowicz A. Handelsman J. Peptidoglycan from Bacillus cereus mediates commensalisms with rhizosphere bacteria from the Cytofaga-Flavobacterium group // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, № 8. P. 5421-5427.
Mearns-Spragg A. Cross-species induction and encasement of antimicrobial activity produced by epibiotic bacteria from marine algae and invertebrates, after exposure to terrestrial bacteria // Lett. Appl. Microbiol. 1998. № 27. Р. 142-146.
Singh P., Shin Y., Park C., Chung Y. Biological control of Fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria // Phytopathology. 1999. № 89. P. 92-99.
Zeilinger S., Galhaup C., Payer K. Chitinase gene expression during mycoparasitic interaction of Trichoderma harzianum with its host // Fungal. Genet. Biol. 1999. Vol. 26, № 2. P. 131-40.
Garcia-Brugger A., Lamotte O., Vandelle E., Bourque S., Lecourieux D, Poinssot B., WendehenneD., Pugin A. Early signaling events induced by elicitors of plant defenses // Mol. Plant-Microbe Interact. 2006. Vol. 19, № 7. Р. 711-724.
Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М. : Медицина ; Екатеринбург : УрО РАН, 1999. 366 с.
Cerca N., Martins S., Sillankorva S. et al. Effects of growth in the presence of subinhibitory concentrations of dicloxacillin on Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus biofilms // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, № 12. P. 8677-8682.
Захарова И.Я., Павлова И.Н. Литические ферменты микроорганизмов. Киев : Наук. думка, 1985. 215 с.
Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М. : Медицина, 2005. 367 с.
Nakimbugwe D., Masschalck B., Deckers D. Cell wall substrate specificity of six different lysozymes and lysozyme inhibitory activity of bacterial extracts // FEMS Microbiol. Lett. 2006. № 259. P. 41-46.
Monchois V., Aberge C., Sturgis J. Escherichia coli ykfE ORF an gene encodes a potent inhibitor of C-type lysozyme // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 21. P. 18437-18441.
Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов // Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. М. : Медицина, 1982. С. 87-88.
Haran S., Schickler H., Chet I. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biocontrol activity of Trichoderma harzianum // Microbiology. 1996. № 142. P. 2321-2331.
Lutz M., Feichtinger G., Defago G., Duffy B. Mycotoxigenic fusarium and deoxynivalenol production repress chitinase gene expression in the biocontrol agent Trichoderma atroviride P1 // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, № 6. P. 3077-3084.
Taga M., Bassler B. Chemical communication among bacteria // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. № 100. P. 14549-14554.
Rasmussen T., Givskov M. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects // Microbiology. 2006. № 152. P. 895-904.
Сидоренко С.В., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. 2004. № 44. С. 263-306.
Lorito M., Di Pietro A., Hayes C. et al. Antifungal, synergistic interaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and Enterobacter cloacae // Phytopathology. 1993. № 83. P. 721-728.
Nykanen A., Vesanen S., Kallio H. Synergistic antimicrobial effect of nisin whey permeate and lactic acid on microbes isolated from fish // Journal Appl. Microbiol. 1998. № 27. P. 345-348.
Bronneke V., Fiedler F. Production of bacteriolytic enzymes by Streptomyces globisporus regulated by exogenous bacterial cell walls // Appl. Environ. Microbiol. 1994. Vol. 60, № 3. Р. 785-791.
Barefoot S. Identification and purification of a protein that induces production of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lactacin B // Appl. Environ. Microbiol. 1994. Vol. 60, № 10. Р. 3522-3528.
Dubuis C., Haas D. Cross-species GacA-controlled induction of antibiosis in Pseudomonads // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, № 21. P. 650-654.
Kleerebezem M., Quadri L., Kuipers O., de Vos W. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction system in gram-positive bacteria // Mol. Microbiol. 1997. № 24. P. 895-904.
Экологическая роль микробных метаболитов / отв. ред. Д.Г. Звягинцев. М. : МГУ, 1986. 240 с.
Хохлов А.С. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития микроорганизмов. М. : Наука, 1988. 306 с.
Лакин Г.Ф. Биометрия. М. : Высшая школа, 1990. 352 с.
Schleifer K., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications // Bacteriol. Rev. 1972. Vol. 36, № 4. Р. 407-477.
Miller G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem. 1959. № 31. P. 426-428.
Fermor T., Wood D., Lincoln S., Fenlon J. Bacteriolysis by Agaricus bisporus // Journal Gen. Microbiol. 1991. № 130. P. 761-769.
Методы общей бактериологии : в 3 т. / под ред. Ф. Герхардта и др. М. : Мир, 1984. Т. 2. 472 с.
Определитель бактерий Берджи : в 2 т. / пер. с англ. М. : Мир, 1984.
Бухарин О.В., Семенов А.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. Способ определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий / Патент РФ № 2376381 от 20.12.2009. Бюл. № 35.
Kloos W., Bannerman T. Update on clinical significance of coagulase-negative Staphylococci // Clinical Microbiol. Rev. 1994. Vol. 7. P. 117-140.
Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург : УрО РАН, 2000. 240 с.
Бухарин О.В., Семенов А.В., Черкасов С.В. Характеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии // Клиническая микробиология, антимикробная химиотерапия. 2010. Т. 12, № 4. С. 347-352.
Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз человека (на модели репродуктивного тракта женщин) // Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург : УрО РАН, 2007. 264 с.
Семёнов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. № 11. С. 545-548.
Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г., Черкасов С.В. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург : УрО РАН, 2006. 546 с.
 Характеристика антагонистической активности <i>Staphylococcus aureus</i>при межмикробных взаимодействиях | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Характеристика антагонистической активности Staphylococcus aureusпри межмикробных взаимодействиях | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Полнотекстовая версия