Изменение объема митохондрий печени мышей после воздействия наносекундных импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Изменение объема митохондрий печени мышей после воздействия наносекундных импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений

Исследовано влияние импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений на митохондрии печени мышей. В качестве индикаторов влияния использовалась оптическая плотность суспензии митохондрий, отображающая объемные характеристики этих органелл. Выявлено, что после облучения суспензии объем митохондрий может изменяться: эффект зависит от частоты повторения импульсов, от интенсивности или дозы воздействия, природы воздействующего фактора, а также от отсутствия или наличия ионов кальция в среде инкубации митохондрий. После воздействия наблюдалось как сокращение объема митохондрий (в большинстве случаев), так и их набухание, что может быть обусловлено модулирующим влиянием импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений на чувствительность неспецифической проницаемости митохондрий к ионам кальция.

Changes in volume of mouse liver mitochondria after exposure to nanosecond pulsed-periodic microwave and x-rays.pdf ВведениеОдной из внутриклеточных мишеней наносекундных импульсно-периоди-ческих микроволнового (ИПМИ) и рентгеновского (ИПРИ) излучений могутбыть митохондрии. Подтверждением этому являются экспериментальные дан-ные о влиянии ИПМИ и ИПРИ на импеданс суспензии митохондрий [1] и дыха-ние органелл, изолированных из печени мышей [2]. В работах предполагалось,что воздействие ИПМИ и ИПРИ способно запускать процессы окислительноймодификации липидов и белков, что должно изменять физико-химические свой-ства биологических мембран и влиять на ионные потоки через них. Согласносовременным представлениям окислительное повреждение органелл являетсямощным индуктором неспецифической проницаемости мембран митохондрий[3]. При этом считается, что в регуляции индукции неспецифической проницае-мости внутренней мембраны органелл важную роль играет окисление специфи-ческих тиоловых групп в белках митохондрий. Она, наряду с оксидантами, ин-дуцируется так же снижением уровня адениновых нуклеотидов и высокими кон-центрациями ионов кальция в митохондриях [4].Изменение ионных потоков в митохондриях под воздействием ИПМИ иИПРИ должно приводить к изменению их объёма, поскольку накопление илиобеднение матрикса органелл теми или иными ионами сопровождаются пе-реносом молекул воды в него или из него соответственно. Изменение объёмамитохондрий приводит к изменению светопропускания суспензии органелл,что можно регистрировать с помощью спектрофотометра [5-8]. Регистрацияизменения объема митохондрий в среде, содержащей ионы Ca2+, позволяетоценить изменение чувствительности неспецифической проницаемости ми-тохондрий в ответ на действие различных факторов [6].Такой метод с успехом был использован для решения многих задач, свя-занных с оценкой функционального состояния митохондрий, в частности приизучении их дыхания, при исследовании механизмов переноса веществ черезвнутреннюю мембрану, а также при оценке влияния различных веществ [6]или при определении функционального состояния организма в условиях раз-вития окислительного стресса [9]. Поэтому цель настоящего исследования -изучить влияние ИПМИ и ИПРИ на митохондрии по изменению их объема спомощью регистрации оптической плотности суспензии органелл.Материалы и методики исследованияЭксперименты выполнены на митохондриях, изолированных из печенимышей. Все процедуры, связанные с забором печени из организма животных,осуществлялись в соответствии с нормами гуманного обращения с животны-ми [10]. Опыты проводились в одно и то же время суток (в утренние часы).Изолированные митохондрии из печени мышей были получены общеприня-тым методом дифференциального центрифугирования [11]. Все манипуляциипроводились при температуре от +1 до +4°С. Печень освобождалась от кровипутем перфузии in situ, охлажденной до 0°С средой выделения, содержащей0,3 М раствор сахарозы, 1 мМ раствор ЭДТА, 10 мМ Трис-буфер (pH 7,4).Навеска печени 1,5 г измельчалась в гомогенизатореСО РАН (г. Томск) [15], который генерировал фотоны рентгеновского излу-чения с энергией 90-120 кЭв, длительностью импульса 4 нс, частотой повто-рения 10-22 имп./с, дозой в импульсе 0,3-2 мР/имп. и суммарной поглощен-ной дозой до 80 мГр.В работе тестировались суспензии митохондрий, облученные 4 000 им-пульсов ИПМИ или ИПРИ и ложнооблученные суспензии, которые подвер-гались аналогичным манипуляциям, что и облученные, но без включения ис-точников излучения. Длительность воздействия варьировала от 3 до 7 мин взависимости от частоты повторения импульсов.Изменение объема митохондрий в суспензии после облучения ИПМИ илиИПРИ регистрировалось с помощью спектрофотометра СФ 103 (Россия) поизменению оптической плотности при длине волны 540 нм. Облученные илиложнооблученные суспензии митохондрий (1 мг митохондриального белка)помещались в среду, состоящую из 250 мМ сахарозы, 5 мМ KH2PO4, 2,5 мМMgCl2 (рН 7,4, 25°С). Митохондрии энергезировались добавлением 5 мМ сук-цината. Для измерения скорости набухания митохондрий в присутствии ионовCa2+ в инкубационную среду сразу после воздействия ИПМИ или ИПРИ до-бавлялся раствор CaCl2 в конечной концентрации 200 нмоль/ мг белка.Все эксперименты были проведены в 6 повторностях для каждого из ис-пользованных режимов воздействия. Величина эффекта рассчитывалась поизменению оптической плотности облученных образцов относительно этогопоказателя у ложнооблученных (рис. 1). Полученные результаты подверга-лись статистической обработке, при которой рассчитывались средняя ариф-метическая величина показателя и её стандартная ошибка. Значимость разли-чий между показателями облученных и ложнооблученных выборок опреде-лялась с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни [16]. Всерасчёты были выполнены с использованием лицензионного пакета компью-терных программ StatSoft Statistica 6.0.Результаты исследования и обсуждениеНа рис. 1 представлены типичные кривые регистрации набухания митохон-дрий по изменению оптической плотности суспензии органелл после воздейст-вия ИПМИ или ИПРИ. Для унификации оценивания эффекта воздействия по-казатели изменения объёма митохондрий регистрировались через 5 мин послепрекращения облучения и, соответственно, через 5 мин после добавления ио-нов Ca2+, которое осуществлялось сразу же после прекращения облучения.Эффект воздействия ИПМИ. После облучения митохондрий ИПМИ спППМ 70, 700 и 1500 Вт/см2 при всех использованных частотах повторенияимпульсов изменений оптической плотности митохондрий в среде без ионовСа2+ не наблюдалось (рис. 2, А), что указывало на отсутствие существенногоизменения объема митохондрий. Это означает, что изменения ионных пото-ков не происходило либо потоки изменялись, но суммарный баланс переносазарядов сохранялся. Результаты экспериментов согласуются с полученныминами ранее данными о том, что воздействие ИПМИ с пППМ 700 и1500 Вт/см2 при аналогичных частотах не изменяло импеданса суспензии ми-тохондрий [17]. Однако воздействие с пППМ 70 Вт/см2 снижало этот пара-метр [17]. Можно предположить, что при низкоинтенсивном воздействии(пППМ 70 Вт/см2) мембрана митохондрий становится более проницаема дляионов, о чем свидетельствует снижение импеданса суспензии. Однако приэтом перенос ионов сбалансирован и ионная сила матрикса митохондрий неизменяется, а следовательно, потоки воды через внутреннюю мембрану от-сутствуют и потому объем остается неизменным.Рис. 1. Типичные кривые регистрации изменения оптической плотности суспензииизолированных митохондрий печени мышей после воздействия: А - в среде без ионовCa2+; Б - с добавлением ионов Са2+ (200 нмоль/мг белка) (описание в тексте)При измерении индуцированного ионами Ca2+ набухания митохондрий, об-лученных ИПМИ, наблюдался иной эффект. После воздействия ИПМИ спППМ 70 Вт/см2 при всех использованных частотах оптическая плотность сус-пензии митохондрий повышалась относительно ложнооблученных образцов(рис. 2, Б). Это означало, что такое воздействие приводит к снижению чувстви-тельности неспецифической проницаемости митохондрий, индуцированнойионами Ca2+. Более интенсивное воздействие ИПМИ (700 Вт/см2) с частотамиповторения 10 и 16 имп./с, наоборот, сопровождалось уменьшением оптиче-ской плотности облученной суспензии. Это может быть результатом того, чтопосле воздействия с таким режимом повышается чувствительность неспеци-фической проницаемости митохондрий к ионам Ca2+ и происходит более ран-нее открытие пор неспецифической проницаемости, в органеллы поступаетвода и митохондрии быстрее набухают. Воздействие ИПМИ с интенсивностью1500 Вт/см2 при всех использованных частотах повторения импульсов значимоне меняло оптическую плотность суспензии митохондрий в ответ на ионы Ca2+в сравнении с ложнооблученными образцами. Это означает, что потоки ионовчерез внутреннюю мембрану не меняются либо изменяются с полной компен-сацией переносимых зарядов, поэтому и объем не изменяется.Рис. 2. Изменение оптической плотности суспензии митохондрий на 5-й минутепосле воздействия ИПМИ с пППМ 70, 700 и 1500 Вт/см2 и частотами повторенияимпульсов 10, 13, 16 и 22 имп./с в среде инкубации: А - в среде без ионов Ca2+;Б - с добавлением ионов Са2+ (200 нмоль/мг белка). Заштрихованное пространство -95%-ный доверительный интервал среднего значения показателя в ложнооблученныхобразцах. * - различия между показателями облученной и ЛО выборокстатистически значимы (р ≤ 0,05)Эффект воздействия ИПРИ. Воздействие ИПРИ на митохондрии в сре-де без ионов кальция и при индукции набухания ионами Са2+ сопровожда-лось реагированием разного характера (рис. 3).Рис. 3. Изменение оптической плотности суспензии митохондрий на 5-й минутепосле воздействия ИПРИ с дозами 0,3-2 мР/имп. и частотами повторения импульсов10-22 имп./с в среде инкубации: А - в среде без ионов Ca2+; Б - с добавлением ионов Са2+(200 нмоль/мг белка). Обозначения аналогичны использованным на рис. 2После облучения митохондрий в среде без ионов кальция ИПРИ с дозой0,3 мР/имп. наблюдалось увеличение оптической плотности суспензий (рис. 3, А)и этот эффект зависел как от частоты повторения импульсов, так и от дозы. Приэтом воздействие с частотами повторения 10, 13 и 16 имп./с повышало оптиче-скую плотность суспензии и эффект был обратно пропорционален частоте. Об-лучение суспензии с максимальной из использованных доз (2 мР/имп.) сопрово-ждалось изменением оптической плотности, причем эффект был также обратнопропорционален частоте повторения импульсов (воздействие с частотой10 имп./с сопровождалось значимым повышением оптической плотности, а воз-действие с частотой 22 имп./с - значимым понижением оптической плотности)(рис. 3, А). ИПРИ с дозой 1,1 мР/имп. при всех частотах повторения импульсовне влияло на оптическую плотность облученной суспензии (рис. 3, А).При измерении индуцированного кальцием изменения объема митохондрийпосле их облучения ИПРИ наблюдался иной эффект. Воздействие со всеми дозамии с частотами повторения 13 и 22 ипм./с увеличивало оптическую плотность сус-пензии митохондрий (рис. 3, Б). При этом величина эффекта возрастала пропор-ционально увеличению частоты повторения импульсов. Наибольшее снижениеоптической плотности наблюдалось после воздействия с частотой повторения22 имп./с и дозой 0,3 мР/имп. Полученные результаты могут свидетельствовать оповышении чувствительности неспецифической проницаемости мембран мито-хондрий, индуцированной ионами кальция, обусловленном более ранним откры-тием пор неспецифической проницаемости в ответ на добавление Са2+.ЗаключениеПолученные результаты свидетельствуют о влиянии наносекундных ИПМИи ИПРИ на функциональное состояние митохондрий, оцененное по их объему.Эффект зависел от частоты повторения импульсов, от интенсивности или дозывоздействия, природы воздействующего фактора (ИПМИ или ИПРИ), а такжеот отсутствия или наличия ионов кальция в среде инкубации митохондрий.После воздействия можно было наблюдать как сокращение объема митохонд-рий (в большинстве случаев), так и их набухание. Причинами сокращения объ-ема митохондрий могли быть: а) образование дополнительных структур про-водимости, например разрывы во внутренней мембране митохондрий, которыеобеспечивали нескомпенсированный выход ионов из матрикса, что иницииро-вало вывод воды из митохондрий; б) изменение эффективности работы мем-бранных структур в сторону усиления вывода ионов.Набухание митохондрий после воздействия может быть связано с окисли-тельным стрессом, последующей активацией ПОЛ, в результате чего происхо-дят частичное нарушение фосфолипидов мембран митохондрий и увеличениепроницаемости внутренней мембраны митохондрий как для протонов, так идля других ионов [9]. Другим механизмом, также приводящим к повреждениюмитохондрий, может быть индукция поры неспецифической проницаемости навнутренней мембране. АФК в определенных условиях могут потенцироватьоткрытие поры, поэтому эти два механизма обычно взаимосвязаны [3]. Ранеебыло показано, что воздействие ИПМИ или ИПРИ на митохондрии приводит кизменению уровня пероксида водорода в этих органеллах [18]. Результаты на-стоящей работы указывают на реальную возможность изменения чувствитель-ности поры неспецифической проницаемости после воздействия ИПМИ илиИПРИ (рис. 2, Б и 3, Б). В результате ИПМИ или ИПРИ могут приводить к бо-лее раннему или замедленному открытию пор в ответ на ионы кальция. Этосопровождается более ранним или более поздним набуханием органелл в ответна Са2+. Такой эффект может быть обусловлен окислением специфическихтиоловых остатков белка митохондрий активными формами кислорода, яв-ляющимися важным регулятором индукции пор неспецифической проницае-мости органелл [3]. При этом через такие неспецифические поры по градиентуэлектрического поля вначале могут входить преимущественно только катионы(в первую очередь ионы K+, Ca2+), которые начинают накапливаться в матриксес одновременным накоплением аниона фосфата. Увеличение осмотическогодавления в результате этого приводит ко входу воды внутрь митохондрий и ихнабуханию. Отсутствие изменения объема митохондрий после воздействияможет быть обусловлено либо отсутствием влияния, либо, что более важно,увеличением встречных потоков ионов, компенсирующих изменения осмомо-лярности. В этом случае преимущественного потока воды не должно быть, азначит, не будет изменяться объем митохондрий.Поскольку эффекты изменения объема митохондрий после облучения в от-сутствии и при наличии ионов кальция в среде существенно различаются, этоуказывает на важную роль этого иона в реагировании митохондрий на воздей-ствие. В дополнение к этому в работе В.Р. Адей [19] показана существеннаяроль ионов кальция в формировании эффектов модулированных радиочастот-ных излучений. Как известно, ионы Са2+ оказывают двойственное действие нафункционирование митохондрий [3]. С одной стороны, ионы Са2+ стимулиру-ют окислительное фосфорилирование на многих уровнях, включая активациюпируватдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы и альфа-кетоглутаратдегидро-геназы [20], также стимулируют АТФ-синтазу [21] и транслоказу адениновыхнуклеотидов [22]. С другой стороны, высокие концентрации ионов Са2+, а так-же другие стимулы, в первую очередь оксиданты, открывают в митохондрияхпоры неспецифической проницаемости, что приводит к удалению адениновыхнуклеотидов из митохондрий [23] и их набуханию.Таким образом, механизмы изменения объема митохондрий печени мы-шей после воздействия наносекундных импульсно-периодических микровол-нового и рентгеновского излучений в настоящий момент трудно интерпрети-ровать. Тем не менее полученные результаты подтвердили данные о влияниинаносекундных импульсно-периодических электромагнитных излучений нафункциональное состояние митохондрий [2]. Поскольку митохондрии играютважную роль в поддержании кальциевого гомеостаза клетки [24], ИПМИ илиИПРИ, изменяя уровень АФК и тем самым оказывая влияние на чувствитель-ность неспецифических пор проницаемости мембран митохондрий, могутмодулировать

Ключевые слова

импульсно-периодические электромагнитные излучения, митохондрии, ионы кальция, repetitive pulsed electromagnetic radiation, mitochondria, calcium ions

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Большаков Михаил АлексеевичНациональный исследовательский Томский государственный университетдоктор биологических наук, профессор, профессор кафедры физиологии человека и животных Биологического института, старший научный сотрудник отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)mbol@ngs.ru
Ростов Владислав ВладимировичИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)доктор физико-математических наук, зав. отделом физической электроники, профессор кафедры физики плазмы Томского государственного университета (г. Томск)rostov@lfe.hcei.tsc.ru
Кутенков Олег ПетровичИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)ведущий инженер-электроник отдела физической электроникиKutenkov@lfe.hcei.tsc.ru
Керея Анна ВикторовнаНациональный исследовательский Томский государственный университетмагистрант кафедры физиологии человека и животных Биологического институтаkereya21@mail.ru
Князева Ирекле РашидовнаСибирский государственный медицинский университет (г. Томск)кандидат биологических наук, доцент кафедры нормальной физиологии, ведущий инженер отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)kir@rubl.tomsk.ru
Иванов Владимир ВладимировичСибирский государственный медицинский университет (г. Томск)кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии, старший научный сотрудник НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск)iseivv@mail.ru
Жаркова Любовь ПетровнаНациональный исследовательский Томский государственный университеткандидат биологических наук, ассистент кафедры физиологии человека и животных Биологического института инженер отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)Zharkova_Lubov@mail.ru
Всего: 7

Ссылки

Пазялова А.А. Влияние микотоксинов боверицина и энниатина на функциональные системы митохондрий // Известия ПГПУ. 2007. № 3. С. 300-3007.
Николс Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию : пер. с англ. М. : Мир, 1985. 190 с.
Оливьер П.Дж., Сантос М.С., Узллас К.В. Тиолзависимые изменения неспецифической проницаемости и дыхания митохондрий, вызываемые доксорубицином // Биохимия. 2006. Т. 71, № 2. С. 247-254.
Brinkkoetter P-T., Song H., Loser R. et al. Hypothermic injury: the mitochondrial calcium, ATP and ROS love-hate triangle out of balance // Cellular physiology and biochemistry. 2008. Vol. 22. P. 195-204.
Brookes P.S., Yoon Y., Robotham J.L., Anders M.W., Sheu S-S. Calcium, ATP, and ROS; a mitochondrial love-hate triangle // American Journal of Physiology. Cell Physiology. 2004. Vol. 287. P. 817-833.
Князева И.Р., Жаркова Л.П., Кутенков О.П., Ростов В.В., Большаков М.А. Изучение функционирования митохондрий после воздействия импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений // Тезисы докладов 21-го Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва ; Калуга, 2010. С. 276-277.
Жаркова Л.П., Афанасьев К.В., Большаков М.А., Князева И.Р., Ростов В.В. Оценка влияния импульсно-периодического рентгеновского и микроволнового излучений на биологические структуры с помощью измерения импедансных характеристик // Вестник Томского государственного университета. 2008. № 312. С. 180-183.
Crichton P.G., Parker N., Vidal-Puing A.J., Brand M.D. Not all mitochondrial carrier proteins support permeability transition pore formation: no involvement of uncoupling protein1 // Bioscience reports. 2009. Vol. 30(3). P. 187-192.
Брайловская И.В., Старков А.А., Мохова Е.Н. Индукция Ca2+-зависимой поры в митохондриях печени под действием аскорбата в присутствии низких концентраций ионов железа // Биохимия. 2001. Т. 66, № 8. С. 1117-1121.
Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. (Based on the revised Appendix A of the European Convention ETS 123) FELASA: Federation of European Laboratory Animal Science Associations, London, UK. 2007. 17 с. URL: www.felasa.eu.
Pallotti F., Lenaz G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. // Methods Cell Biology. 2001. Vol. 65. P. 1-35.
Grafc U. Biochemistry of antibiotics // Berlin spectrum akademisher Verlag. 1992. P. 124-282.
Klimov A.I., Kovalchuk O.V., Rostov V.V., Sinyakov A.N. Measurement of Parameters of XBand High-Power Microwave Superradiative Pulses // IEEE Transactions on Plasma Science. 2008. Vol. 36, № 6. P. 1-4.
Жаркова Л.П., Мамонова Н.В., Князева И.Р., Кутенков О.П., Ростов В.В., Большаков М.А. Регенерация нейрогенных изъязвлений слизистой желудка после облучения импульсно-периодическим микроволновым излучением // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2010. № 2. С. 112-122.
Артемов К.П., Ельчанинов А.А., Кутенков О.П., Ростов В.В., Турчановский И.Ю. Импульсно-периодический источник рентгеновского излучения // Приборы и техника эксперимента. 2004. № 5. С. 67-68.
Ефимов В.М., Ковалева В.Ю. Многомерный анализ биологических данных. 2-е изд., испр. и доп. СПб., 2008. 86 с.
Жаркова Л.П. Реализация окислительных процессов в печени и крови после кратковременного воздействия наносекундных импульсно-периодических электромагнитных излучений: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Томск, 2010. 24 с.
Жаркова Л.П., Князева И.Р., Иванов В.В., Большаков М.А., Кутенков О.П., Ростов В.В. Влияние импульсно-периодического рентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах // Вестник Томского государственного университета. 2010. № 333. С. 161-163.
Adey W.R. Tissue interaction with nonionising electomagnetic fields // Physiology Review. 1981. Vol. 61(2). P. 435-514.
McCormack J.G., Denton R.M. Mitochondrial Ca2+ transport and the role of intramitochondrial Ca2+ in the regulation of energy metabolism // Dev Neuroscience. 1993. Vol. 15. P. 165-173.
Das A.M., Harris D.A. Control of mitochondrial ATP synthase in heart cells: inactive to active transitions caused by beating or positive inotropic agents // Cardiovascular Research. 1990. Vol. 24. P. 411-417.
Mildaziene V., Baniene R., Nauciene Z. et al. Calcium indirectly increases the control exerted by the adenine nucleotide translocator over 2-oxoglutarate oxidation in rat heart mitochondria // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1995. Vol. 324. P. 130-134.
Halestrap A.P., Brennerb C. The adenine nucleotide translocase: a central component of the mitochondrial permeability transition pore and key player in cell death // Current Medicinal Chemistry. 2003. Vol. 10. P. 1507-1525.
Gunter T.E., Yule D.I., Gunter K.K., Eliseev R.I., Salter J.D. Calcium and mitochondria // FEBS Letters. 2004. Vol. 567. P. 96-102.
 Изменение объема митохондрий печени мышей после воздействия наносекундных импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Изменение объема митохондрий печени мышей после воздействия наносекундных импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 3 (15).

Полнотекстовая версия