Анализ транскрипции пластидных генов Hordeum vulgare в темноте. | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 2 (18).

Анализ транскрипции пластидных генов Hordeum vulgare в темноте.

С помощью метода run-on транскрипции изучена транскрипция 16 пластидных генов в первых этиолированных листьях ячменя (Hordeum vulgare L.). Анализируемые гены относятся к функционально-различным группам генов пластома. Прежде всего это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза: гены фотосистем I, II, ген большой субъединицы РБФК, АТФ синтетазного комплекса - atp - и субъединица F НАДФН пластохиноноксидоредуктазы - ndhF. Среди генов «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего β субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомной РНК (rrn16 и rrn23); гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y). В результате проведенных исследований нами показана дифференциальная транскрипция пластидных генов.

The analyses of plastid gene transcription Hordeum vulgare in darkness.pdf ВведениеДля реализации основной энергетической функции света растениям необходимо сформировать фотосинтетический аппарат. Особое внимание привлекает процесс регуляции транскрипции в связи с тем, что транскрипция является первым этапом экспрессии генов и от нее зависит не только количество индивидуальных мРНК, но и накопление белка, что прямо влияет на превращение этиопластов в хлоропласты и переход этиолированных растений к автотрофному питанию. Среди многочисленных методов исследования, позволяющих оценивать относительное содержание индивидуальных РНК в клетке, можно выделить метод микрочипов, ПЦР в реальном времени, нозерн- и дот-гибридизации. Единственный метод, демонстрирующий вклад процесса транскрипции в регуляцию содержания мРНК и позволяющий определить скорость транскрипции генов, - метод run-on транскрипции [1]. Данный метод основан на способности изолированных органелл в течение непродолжительного времени осуществлять транскрипцию генов. В нашем исследовании с помощью метода run-on транскрипции оценивалась транскрипция пластидных генов проростков ячменя.Материалы и методики исследованияДля анализа экспрессии пластидного генома ячменя на уровне транскрипции начальным этапом является выделение хлоропластов. При выделении хлоропластов использовали ступенчатый градиент перкола (40 и 70%), который позволяет очистить хлоропласты от ядер и митохондрий и отделить интактные хлоропласты от разрушенных. Для дальнейшей работы брали 5х107 хлоропластов для каждого варианта. Подсчет количества хлоропластов производили на микроскопе Micros MC 100 (Австрия) в камере Розенталя - Фукса. Синтез меченых транскриптов в хлоропластном лизате, ДНК-РНК гибридизацию и экспозицию нейлоновой мембраны с рентгеновской пленкой проводили согласно методике проведения run-on анализа [1-3]. После гибридизации радиоактивные сигналы отсканировали и оцифровали, используя Phosphorimager Typhoon Trio (сканер Typhoon TRIO+ Variable Mode Imager с пакетом программ Typhoon Scaner Control) и ImagerQuant TL Control Centre («GE Healthcarе», США).Результаты исследования и обсуждениеНами проанализирована транскрипция 16 плаcтидных генов ячменя, относящихся к функционально-различным группам генов пластома. Прежде всего, это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза: гены фотосистемы I - psa (psaA и psaB), фотосистемы II - psb (psbA, psbD и psbK), ген большой субъединицы РБФК (rbcL), АТФ синтетазного комплекса - atp (atpB) и субъединица F НАДФН пластохиноноксидоредуктазы - ndhF. Среди генов «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего β субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомной РНК (rrn16 и rrn23); гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y) и др. Подробное описание анализируемых генов приведено в статьях Kravtsov et al., Zubo et al. и Bork [4-6]. Радиоавтографы типичного опыта, полученные в ходе run-on эксперимента с пластидами из первых листьев этиолированного ячменя, и интенсивность транскрипции, выраженная в условных единицах, показаны на рис. 1, 2.Радиоавтограмма результатов run-on транскрипции позволяет выделить три условные группы генов с высокой, средней и низкой транскрипционной активностью. Так, к группе генам с высокой транскрипционной активностью можно отнести гены, продукты которых выполняют не только первостепенную роль для реализации процесса фотосинтеза и кодируют белки фотосистемы II (psbA и psbD), большую субъединицу РБФК (rbcL) и АТФ-синтазу (atpB), но и гены «домашнего хозяйства, кодирующие рибосомный белок (rrn16) и транспортную РНК (trnE/trnY).ndhAndhApetLpetLrpl33rpl33rps16rps16rrn23 rrn23atpBatpBtrnE-YtrnE-YrpoBrpoBРис. 1. Радиограмма результатов run-on транскрипции: А - радиограмма результатов run-on транскрипции; Б - схема нанесения на мембрану ДНК-зондов исследованных геновРис. 2. Интенсивность транскрипции пластидных генов ячменяВ группу со средней транскрибционной активностью можно включить ген фотосистемы I (psaB), ген psbK, кодирующий К-субъединицу (3,9 кДа) фотосистемы II, и гены рибосомных белков (rrn23 и rps16). Среди генов, проявляющих низкую транскрипционную активность, можно выделить гены, кодирующие F (ndhF) и А (ndhA) субъединицы НАДН-пластохиноноксидоредуктазы, ген L субъединицы цитохрома b6f (petL) и ген рибосомного белка L33 (rpl33) (рис. 2). Транскрипционная активность двух генов этиолированных листьев ячменя - psaA и rpoB - в темноте не проявлялась.ЗаключениеТаким образом, в результате проведенных исследований на этиолированных проростках ячменя нами показана дифференциальная транскрипция пластидных генов. Из 16 анализируемых генов наибольшая интенсивность транскрипции отмечена для генов, кодирующих белки фотосистемы II (psbA, psbD и psbK), большую субъединицу РБФК (rbcL), АТФ-синтазы (atpB), рибосомные белки (rrn16, rrn23 и rps16) и гены транспортной РНК (trnE/trnY).

Ключевые слова

etiolation, run-on transcription method, barley, plastid gene, run-on транскрипция, этиоляция, пластидные гены, ячмень

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Кравцов Александр КонстантиновичИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории экспрессии генома растенийkravtsovalexk@gmail.com
Кузнецов Виктор ВасильевичИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией экспрессии генома растенийvkusnetsov2001@mail.ru
Ефимова Марина ВасильевнаНациональный исследовательский Томский государственный университеткандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического институтаstevmv555@gmail.com
Всего: 3

Ссылки

Bock R. Structure, function, and inheritance of plastid genomes // Topics in Current Genetics.Vol. 19. 2007. R. Bock (Ed.): Cell and Molecular Biology of Plastids. P. 29-65.
Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kusnetsov V.V., Borner T. Methyl jasmonate, gibberellic acid, and auxin affect transcription and transcript accumulation of chloroplast genes in barley // J. Plant Physiology. 2011. Vol. 168, iss. 12. P. 1335-1344.
Kravtsov A.K., Zubo Y.O., Yamburenko M.V. et al. Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation // Plant Growth Regulation. 2011. Vol. 64. P. 173-183.
Зубо Я.О., Ямбуренко М.В., Кравцов А.К. и др. Отделенные от растений листья ячменя как экспериментальная модель для изучения регуляции цитокинином транскрипции пластидных генов // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 609-618.
Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К. и др. Особенности экспрессии пластидного генома и развития растений Arabidopsis thaliana с нарушенным синтезом брассиностероидов // Физиология растений. 2012. Т. 59, № 1. С. 32-39.
Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Применение метода run-on транскрипции для изучения регуляции экспрессии пластидного генома // Физиология растений. 2008. Т. 55, № 1. С. 114-122.
 Анализ транскрипции пластидных генов <i>Hordeum vulgare </i>в темноте. | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 2 (18).

Анализ транскрипции пластидных генов Hordeum vulgare в темноте. | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 2 (18).