Генетическая изменчивость и дифференциация длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus) по данным RAPD-PCR-анализа | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 4 (20).

Генетическая изменчивость и дифференциация длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus) по данным RAPD-PCR-анализа

Методом RAPD-PCR-анализа суммарной клеточной ДНК с использованием десяти произвольных олигонуклеотидных праймеров впервые проведено сравнение генетической изменчивости и выяснен уровень генетической дифференциации четырех подвидов длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus (Pallas 1773), которые по аллозимным данным относятся к двум разобщенным географическим формам - западной (S. u. eversmanni) и восточной (S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis). Идентифицированы 288 признаков, включая таксон-специфичные маркерные фрагменты для отдельных подвидов, а также для двух географических форм. Рассчитаны значения параметров генетического разнообразия и построены NJ-филогенетическая реконструкция и UPGMA-дендрограмма генетического сходства популяций. Показаны высокий уровень генетической дифференциации западной и восточной форм длиннохвостого суслика (D = 0,24-0,27; р = 0,00) и близость восточных подвидов между собой (D = 0,005-0,008; р = 1,00). Проведена таксономическая оценка их молекулярных различий.

Genetic variability and differentiation of the long-tailed ground squirrels (Spermophilus undulstus) based on RADD-PCR a.pdf Введение Длиннохвостый суслик Spermophilus undulatus (Pallas 1778) - политипический вид голарктического рода Spermophilus (F. Cuvier 1825), населяющий горные и предгорные районы Северо-восточной Азии (от Джунгарского Алатау до Приамурья и Якутии). Широкое географическое распространение обусловило значительную изменчивость фенотипических характеристик входящих в его состав форм. На основании морфологических и биоэкологических особенностей были выделены и описаны 6 современных подвидов длиннохвостого суслика: S. undulatus undulatus (Pallas 1778), S. u. stramin-eus (Obolensky 1927), S. u. eversmanni (Brandt 1841), S. u. intercedens (Ognev 1937), S. u. jacutensis (Brandt 1843) и S. u. menzbieri (Ognev 1937) [1-3]. Получены обширные данные по географической изменчивости длиннохвостого суслика по разным системам признаков: морфологическим [4-5] и аллозим-ным [6]. Показано, что подвиды, распространенные в западной части ареала (S. u. stramineus, S. u. eversmanni), отличаются от подвидов из восточной части (S. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis), S. u. undulatus занимает промежуточное положение между ними. Степень различий между группами западных и восточных подвидов по разным данным достигает уровня полувидов [6] или видов [5]. С развитием и освоением новых молекулярных технологий существенно расширился спектр методов, привлекаемых, наряду с классическими морфологическим и биохимическим подходами, для решения таксономических проблем [7-9]. Одним из доступных методов является полимеразная цепная реакция (PCR) с использованием произвольных праймеров (RAPD - случайно амплифицированная полиморфная ДНК). С её помощью выявляется генетическая изменчивость по множеству независимых признаков, разбросанных по всему геному. Причем в последнее время было показано, что среди продуктов амплификации представлены все типы последовательностей ДНК. Благодаря считыванию информации с разных функциональных участков молекулы ДНК метод RAPD-PCR позволяет выявить «скрытую» генетическую изменчивость и более точно оценить полиморфизм по сравнению с аллозимным анализом [7]. Наряду с положительными сторонами метода существует ряд технически преодолимых сложностей и концептуальных ограничений, которые следует учитывать при работе [10-12]. Несмотря на известные недостатки метода, он остается популярным, успешно применяется в исследованиях систематики животных и наиболее адекватен для внутри- и межвидовых сравнений [13-15]. Перспективность использования RAPD-PCR-маркёров в сравнительных молекулярно-генетических, таксономических и филогенетических исследованиях палеарктических сусликов рода Spermophilus показана нами в предыдущих работах [16-20]. Цель настоящей работы - изучить генетическую изменчивость и внутривидовую дифференциацию длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus с помощью метода полимеразной цепной реакции со случайными прайме-рами (RAPD-PCR). Использование характеристик ядерного генома позволит на более высоком уровне оценить масштаб географической изменчивости популяций длиннохвостого суслика, определить генетическую структуру и уточнить степень генетической дифференциации подвидов из разных частей ареала. Материалы и методики исследования Материалом для данной работы послужили образцы тканей длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus: S. u. eversmanni, S. u. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis из экспедиционных сборов 1992, 2004-2005 гг., а также 1977-1982 гг., исследованные ранее морфометрическими и алло-зимными методами (табл. 1, рис. 1). Для межвидовых парных сравнений в анализ включили образцы S. parryi (Richardson 1825) из того же подрода (Urocitellus), что и S. undulatus, а также S. dauricus (Brandt 1843) и S. relictus (Kaschkarov 1923), относящихся к другому подроду Citellus. В качестве внешней группы использовали азиатского бурундука Tamias sibiricus (Lax-mann 1769). ДНК исследуемых сусликов выделяли по стандартному методу феноль-ной депротеинизации с использованием протеиназы К и последующим осаждением изопропиловым и этиловым спиртами [21] из свежемороженых и фиксированных в спирте печени и скелетных мышц. Для анализа использовали 10 из 26 предварительно протестированных декамерных олигонуклеотидных праймеров, инициировавших синтез различимых продуктов амплификации (OPA-02, OPC-02, OPC-05, OPC-09, OPC-10, OPC-12, OPC-16, OPC-20, OPD-05, OPE-20, «Operon Technologies Inc.», США). Во избежание методических ошибок предварительно проводили оптимизацию условий PCR-реакции с каждым праймером: уточняли активность Taq-полимеразы, подбирали оптимальную концентрацию ионов магния Mg2+ и количество ДНК-мишени. Т а б л и ц а 1 характеристика использованного материала № Число места Вид / подвид особей Место сбора сбора (n) 1 S. undulatus intercedens 4 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, с. Верхний Цасучей (долина р. Онон) 2 -//- 1 Там же, Читинский р-н, станция «Новая» (60 км на восток от Читы) 3 S. u. menzbieri 6 РФ, Амурская обл., Михайловский р-н, окр. с. Безозёрное 4 S. u. jacutensis 6 РФ, Якутия, пос. Тулагино (22 км от Якутска) 5 S. u. eversmanni 1 РФ, Республика Алтай, Онгудайский р-н, пос. Онгудай 6 -//- 1 Там же, Онгудайский р-н, пос. Каракоп 7 S. dauricus dauricus 3 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, пос. Усть-Ималка 8 -//- 3 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, окр. пос. Усть-Ималка 9 6 Там же, окр. пос. Усть-Ималка, кордон «Булум» 10 S. relictus relictus 4 Узбекистан, Тянь-Шань, Кураминский хр., Ангренское плато, перевал Чапанкуйды 11 S. parryi leucostictus 3 РФ, Магаданская обл., Хасын-ский р-н, окр. пос. Атка Рис. 1. Видовые ареалы сусликов и места сбора материала в соответствии с табл. 1 Для исключения артефактных полос вследствие образования вторичных структур в праймере или контаминации ставили контрольную пробу с полной амплификационной смесью без добавления ДНК. Воспроизводимость результатов амплификации (идентичность полос в спектрах) проверяли троекратно с праймерами 0PC-02, OPC-16, 0PD-05 и двукратно с каждым из остальных праймеров. Полимеразную цепную реакцию (RAPD-PCR) проводили в амплифика-торе «BioRad» (США) в следующих условиях: денатурация - 2 мин/94°С, затем 41 цикл: денатурация - 1 мин/94°С, отжиг - 30 сек/37°С, 15 сек/45°С, синтез - 2 мин/72°С. Стадию синтеза на конечном этапе проводили при 72°С в течение 6 мин. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 60 нг тотальной ДНК, 1 х буфер (67 мМ трис-НС1, рН 8,8, 2 мМ MgCl2, 0,1% Tween-20, 0,01 М 2-меркаптоэтанол), по 0,2 мМ каждого dNTP, 25 пкмоль праймера, 1 ед. Taq-полимеразы. Продукты амплификации разгоняли электрофорезом в 2%-ном агароз-ном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия в 1х TBE-буфере, в течение 1-1,5 ч до полного разделения фрагментов. В качестве маркера молекулярной массы использовали рестрицированную Pst I ДНК фага лямбда (X) известного размера. Гели фотографировали в отраженном УФ-свете с помощью гель-документирующей системы «BioRad» (США). Для статистической обработки результатов по электрофореграммам составляли бинарные матрицы «1 - 0» (присутствие - отсутствие фрагмента), учитывая все визуально выявляемые полосы. С помощью программ POP-GENE ver. 1.31 [22] и TFPGA-ver. 1.3 [23] рассчитывали параметры генетической изменчивости и дифференциации популяций. Оценку генетической изменчивости проводили по числу полиморфных признаков (Nn), частоте фрагментов (А) и доле полиморфных фрагментов в отдельных (Р) и совокупной выборках (Роб). Для оценки генетических различий между популяциями использовали индексы сходства I (I=2Nab/(Na+Nb), где Na и Nb - числа амплифицированных фрагментов у образцов a и b; Nb - число фрагментов с одинаковой электрофоретической подвижностью), и межпопуляционные генетические дистанции D (D = -lnI) [24]. Также проводили точный тест на дифференциацию популяций [23]. Дендрограмма генетического сходства построена посредством невзвешенного парно-группового метода с арифметическим усреднением UPGMA [25]. Филогенетическая реконструкция выполнялась методом ближайшего связывания NJ с бутстрепными оценками степени надежности порядка ветвления [26]. Результаты исследования и обсуждение Описание RAPD-профилей. В суммарной выборке, включающей все исследованные виды, идентифицировано 288 признаков, в выборке Spermophilus undulatus - 141 признак. Число амплифицированных фрагментов в спектрах PCR-продуктов варьировало от 6 до 21. Молекулярный вес фрагментов находился в пределах от 250 пар нуклеотидов (пн) до 2150 пн. RAPD-спектры продуктов амплификации, полученные с каждым из 10 исследованных праймеров, показали уникальный тип распределения амплифицированных фрагментов. Праймеры OPA-02, OPC-02, OPC-05, OPC-09, OPC-12, OPC-20, OPD-05, OPE-20 инициировали синтез полиморфных, а OPC-10 и OPC-16 - мономорфных профилей у особей длиннохвостого суслика S. undulatus. В целом выборки S. undulatus имели похожие спектры продуктов амплификации, отличаясь от других видов - S. parryi, S. dauricus и S. relictus. RAPD-профили особей трех восточных подвидов длиннохвостого суслика (S. u. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis) оказались наиболее сходными между собой. Особи подвида S. u. eversmanni отличались от них набором отдельных фрагментов, что позволяло их идентифицировать визуально (рис. 2, а-д). Так, S. u. intercedens, S. u. menzbieri и S. u. jacutensis имеют одни и те же фрагменты в спектрах PCR-продуктов ДНК (ОРА-021159, ОРС-02790, OPC-09поо, OPC-09шо, OPC-09м, OPC-09^, OPD-051700), отсутствующие у S. u. eversmanni. В свою очередь, последний подвид имеет наибольшее количество уникальных фрагментов (ОРА-02514, OPC-09264, OPD-0 5 350, OPE-201700), отличающих его от трёх других подвидов длиннохвостого суслика. С помощью праймера ОРС-02 выявлены фрагменты, маркирующие подвиды S. u. intercedens (1843 пн) и S. u. jacutensis (2 100 пн) (рис. 2, б). Три праймера (OPC-20, OPD-05, OPE-20) показали количественные различия между выборками (подвидами) длиннохвостого суслика, определяемые по яркости отдельных фрагментов. Так, S. u. menzbieri отличается от остальных подвидов яркостью фрагмента OPE-20660, а S. u. eversmanni - «мажорностью» фрагмента OPE-201260. Фрагменты OPC-20920 (данные не приведены) и 0PD-051490 наиболее ярки сразу у трех выборок из восточной части ареала - S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis (рис. 2, г, д). М 1 2 3 < 9 / 5 6 7 6 1 9 10 11 12 13 14 15 16 171819 - --- - --- - - М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и 72 13 75 76 77 1819 gj ^-1843 пн - W - _ - _w ез - - - ' _ » м- - - - - - -■ - - - IT S - - - - ег - - ' - - = - - = - - Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 171819 Рис. 2. RAPD-PCR-спектры сусликов: Spermophilus undulatus intercedens (дорожки 1-5), S. u. menzbieri (дорожки 6-11), S. u. jacutensis (дорожки 12-17) и S. u. eversmanni (дорожки 18-19), инициированные праймерами ОРА-02 (а), ОРС-02 (б), ОРС-09 (в), OPD-05 (г) и ОРЕ-20 (д); M- маркер молекулярного веса (PstI) Генетическая изменчивость и дифференциация. В табл. 2 представлены параметры генетической изменчивости Spermophilus undulatus. Вследствие невысокой изменчивости RAPD-PCR-спектров выборки длиннохвостого суслика имеют сходные значения частот фрагментов (А). В целом по всем праймерам значения данного показателя изменяются в пределах 0,38-0,48. По отдельным праймерам разброс значений несколько шире, например 0,3-0,43 (ОРС-02), 0,36-0,63 (ОРС-16), 0,35-0,64 (ОРЕ-20). Наибольшие различия по частотам фрагментов (0,11-0,63) между всеми выборками длиннохвостого суслика S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis, S. u. eversmanni выявлены с помощью праймера ОРС-09. Т а б л и ц а 2 Генетическая изменчивость S. undulatus Pallas, 1773, выявляемая с помощью десяти праймеров (141 признак) Прай-мер Нуклеотидная последовательность (5'-3') N/ Nn ^об А/P S. и. intercedens S. и. menzbieri S. и. jacutensis S. u. eversmanni ОРА- 02 TGCCGAGCTG 6/4 0,67 0,5/0 0,61/0,83 0,67/0 0,67/0,33 ОРС- 02 GTGAGGCGTC 21/21 1 0,31/0,1 0,36/0,48 0,3/0,38 0,43/0,43 ОРС- 05 GATGACCGCC 20/16 0,8 0,56/0,15 0,5/0,15 0,66/0,35 0,38/0,05 ОРС- 09 CTCACCGTCC 19/16 0,84 0,11/0,11 0,63/0 0,53/0,16 0,42/0,32 ОРС- 10 TGTCTGGCTG 16/10 0,63 0,31/0,31 0,29/0,31 0,29/0,25 0,19/0,13 ОРС- 12 TGTCATCCCC 20/7 0,35 0,32/0,25 0,11/0,1 0,21/0,25 0,13/0,05 ОРС- 16 CACACTCCAG 14/3 0,21 0,47/0,07 0,63/0,07 0,44/0,5 0,36/0 ОРС- 20 ACTTCGCCAC 19/19 1 0,35/0,32 0,42/0,21 0,26/0,21 0,5/0,16 OPD- 05 TGAGCGGACA 21/19 0,9 0,58/0,05 0,57/0 0,57/0,24 0,4/0,14 ОРЕ- 20 AACGGTGACC 10/9 0,9 0,64/0,1 0,63/0,1 0,52/0,3 0,35/0,1 В целом по всем праймерам 16,6/ 13,6 0,82 0,42/0,15 0,48/0,23 0,45/0,27 0,38/0,17 _ _ Примечание. N - общее число признаков; Nn - число полиморфных признаков; А - частота фрагментов; Роб и Р - доля полиморфных признаков в совокупной и в отдельных выборках соответственно. Для выявления внутривидового полиморфизма наиболее эффективными оказались 6 праймеров: ОРС-02, ОРС-05, ОРС-09, ОРС-20, ОРD-05 и ОРЕ-20 (Роб = 0,79-1). Самые низкополиморфные амплификанты были получены с помощью праймеров ОРС-12 и ОРС-16 (Роб = 0-21-0-35). Среднее значение Роб для выборки S. undulatus в целом, рассчитанное по всем праймерам, составляет 0,82. С помощью показателя генетического полиморфизма (Р) мы также оценивали внутрипопуляционную изменчивость разных подвидов длиннохвостого суслика. Значения генетического полиморфизма, рассчитанные по всем прайме-рам, у подвидов S. undulatus в целом низки: близкие значения выявлены для S. u. jacutensis и S. u. menzbieri (0,27 и 0,23 соответственно), S. u. eversmanni и S. u. intercedens (0,17 и 0,15 соответственно). Значения данного показателя, выявленные с помощью отдельных праймеров, внутри каждой выборки варьируют незначительно у S. u. intercedens (0-0,32), S. u. jacutensis (0-0,38) и S. u. eversmanni (0-0,43), и более широко - у S. u. menzbieri (0-0,83). Для выявления степени генетической дифференциации между подвидами длиннохвостого суслика и видами S. parryi, S. dauricus и S. relictus были рассчитаны коэффициенты генетических дистанций (D) и сходства (I) (табл. 3). Наименьшие значения D и, соответственно, наибольшие значения I обнаружены между двумя популяциями S. u. intercedens (0,04 и 0,96). Между подвидами длиннохвостого суслика коэффициенты генетических дистанций изменяются в широком диапазоне от 0,05 (S. u. intercedens - S. u. menzbieri) до 0,27 (S. u. intercedens - S. u. eversmanni), т.е. различаются более чем в 5 раз, что свидетельствует о разной степени генетической дифференциации подвидов длиннохвостого суслика между собой. Наименьшие значения выявлены между подвидами из восточной части ареала, S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis, (0,05-0,08), наибольшие - между подвидом из западной части ареала (S. u. eversmanni) с каждым из «восточных» подвидов (0,24-0,27). Значения генетических дистанций между популяциями видов одного подрода Urocitellus (S. undulatus - S. parryi) изменялись от 0,33 до 0,44, между видами разных под-родов Urocitellus - Citellus (S. undulatus - S. dauricus, S. undulatus - S. relictus, S. parryi - S. dauricus и S. parryi - S. relictus) были выше: от 0,37 до 0,59. Т а б л и ц а 3 Генетическое сходство (I, выше диагонали) и различия (D, ниже диагонали) популяций сусликов рода Spermophilus по 288 RAPD-признакам Виды D/I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. S. dauricus (7) - 0,96 0,96 0,61 0,58 0,61 0,66 0,64 0,66 0,64 2. S. dauricus (8) 0,04 - 0,95 0,61 0,57 0,60 0,64 0,63 0,66 0,62 3. S. dauricus (9) 0,04 0,05 - 0,58 0,55 0,58 0,62 0,62 0,65 0,63 4. S. undulatus intercedens (1) 0,49 0,50 0,54 - 0,96 0,95 0,95 0,77 0,66 0,66 5. S. u. intercedens (2) 0,54 0,56 0,59 0,04 - 0,93 0,92 0,77 0,64 0,64 6. S. u. menzbieri (3) 0,49 0,51 0,55 0,05 0,07 - 0,94 0,77 0,66 0,65 7. S. u. jacutensis (4) 0,42 0,44 0,47 0,06 0,08 0,06 - 0,79 0,68 0,69 8. S. u. eversmanni (5) 0,45 0,47 0,48 0,26 0,27 0,26 0,24 - 0,69 0,72 9. S. relictus (10) 0,41 0,41 0,44 0,41 0,45 0,42 0,39 0,37 - 0,66 10. S. parryi (11) 0,45 0,47 0,46 0,40 0,44 0,43 0,37 0,33 0,41 - Примечание. В скобках указано место сбора в соответствии с табл. 1. Максимальные значения попарных генетических дистанций, рассчитанных для каждой пары сусликов по общим для них признакам (табл. 4), выявлены между S. u. intercedens - S. u. eversmanni, S. u. menzbieri - S. u. eversmanni, S. u. jacutensis - S. u. eversmanni (D = 0,39-0,41), минимальные - между S. u. intercedens - S. u. menzbieri (D = 0,06). S. u. intercedens - S. u. jacutensis и S. u. menzbieri - S. u. jacutensis имеют средние значения данного параметра (0,26 и 0,24 соответственно). Генетические расстояния между двумя географическими формами длиннохвостого суслика (восточной и западной) равняется 0,48, между близкими видами S. undulatus и S. parryi - 0,53, S. dauricus и S. relictus -0,88. Точный тест на дифференциацию с высокой достоверностью (p = 0,00) различил две пары подвидов длиннохвостого суслика S. u. menzbieri - S. u. eversmanni и S. u. jacutensis - S. u. eversmanni, a также восточную - западную формы длиннохвостого суслика и пару видов S. undulatus - S. parryi. Т а б л и ц а 4 Параметры генетической дифференциации исследованных выборок сусликов рода Spermophilus Выборки n N D Точный тест (р) intercedens / menzbieri 10 138 0,06 1,00 ,jS menzbieri /jacutensis 12 141 0,24 1,00 intercedens / jacutensis 10 143 0,26 1,00 JS menzbieri / eversmanni 8 152 0,39 0,00 Чз с jacutensis / eversmanni 8 127 0,39 0,00 со intercedens / eversmanni 6 157 0,41 1,00 формы восточная / западная 19 141 0,48 0,00 S. undulatus / S. parryi 22 167 0,53 0,00 S. dauricus/ S. relictus 16 158 0,88 1,00 На UPGMA-дендрограмме генетического сходства популяций, построенной на основании данных сходства и различия (I/D), три подвида длиннохвостого суслика Spermophilus undulatus - S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis образовали единую группу, от которой последовательно отделены ветви S. u. eversmanni, S. parryi и S. relictus. S. dauricus образовал самостоятельный кластер и значительно удален от трёх других видов. Внутри основного кластера генетическое расстояние между тремя подвидами S. undulatus неодинаково: S. u. menzbieri и S. u. jacutensis ближе друг к другу, чем к S. u. intercedens. Две популяции S. u. intercedens наиболее близки. Подвид S. u. eversmanni, географически удаленный от других подвидов своего вида, высоко дифференцирован, а его ответвление от основного кластера произошло на уровне, близком к межвидовому узлу. На NJ-филогенетической реконструкции наиболее близки между собой три восточных подвида длиннохвостого суслика - S. u. intercedens, S. u. men-zbieri и S. u. jacutensis, западный подвид S. u. eversmanni значительно удален от них и образует самостоятельный подкластер со 100%-ной бутстреп-под-держкой (рис. 3). Рис. 3. Филогенетическая реконструкция (NJ) сусликов Spermophilus undulatus intercedens (inl, in2), S. u. menzbieri (m), S. u. jacutensis (jac), S. u. eversmanni (ev), S. parryi, S. dauricus и S. relictus, полученная на основе 1 000 бутстреп-репликаций. Указаны значения бутстрепа выше 50% Длиннохвостый суслик Spermophilus undulatus - сравнительно молодой вид голарктического подрода Urocitellus, предки которого мигрировали из Северной Америки и заселили Северо-восточную Азию в позднем плиоцене - раннем эоплейстоцене [2, 27]. История расселения и становление ареала длиннохвостого суслика, основанные на хромосомных данных, подробно описаны Н.Н. Воронцовым и Е.А. Ляпуновой [28, 29]. Формирование ареала и внутривидовая дифференциация S. undulatus шли под воздействием климатических изменений, происходивших в позднем плейстоцене. Многократные периодические похолодания способствовали распространению тундростеп-ных биотопов - основному местообитанию длиннохвостого суслика, и широкому расселению данного вида в пределах Северной Евразии. Потепление и увлажнение климата в межледниковые периоды приводили к восстановлению лесистости, регрессу тундростепей, сокращению площадей открытых ландшафтов. Последствия этих изменений - деградация видового ареала, разобщение и исчезновение длиннохвостых сусликов с ряда занимаемых территорий (оптимальные условия для обитания сохранились в горах Алтая, Саян, в Юго-Восточной Сибири и на Дальнем Востоке) - способствовали независимому развитию популяций и накоплению генетических различий между ними. В настоящее время длиннохвостый суслик распространен на значительной территории Северо-Восточной Азии: в Центральной Сибири и Дальнем Востоке России (от Алтая до Центральной Якутии и Приамурья), Казахстане, Монголии и северо-восточной части Китая. Современный ареал сильно фрагментирован. От основной его части, расположенной в Центральной Сибири и в основном имеющей сплошной характер, отделены множество мелких полуизолированных и изолированных участков в Восточной Сибири и два крупных обособленных участка в Якутии и Приамурье. Интенсивное заселение Сибири и Дальнего Востока, развитие промышленности и хозяйственное освоение земель в ХХ в. привели к сокращению ареала длиннохвостого суслика и частичному исчезновению этого вида с указанных территорий. В то же время строительство авто- и железнодорожных мостов и магистралей привело к расселению сусликов в местах, недоступных ранее [30]. К сожалению, на данный момент численность и динамика изменения ареала длиннохвостого суслика прослеживается лишь в отдельных регионах России [31-35], и полная картина нам неизвестна. В современную эпоху процесс формообразования у длиннохвостого суслика продолжается [4-6]. Авторы цитируемых работ увязывали значительную изменчивость морфологических и аллозимных характеристик данного вида с палеогеологическими событиями и его современным географическим распространением, подчеркивая тем самым ведущую роль указанных факторов в микроэволюции данного вида. К этому следует добавить, что заметное влияние на характер генетической и морфологической изменчивости длиннохвостого суслика также оказывают особенности пространствен-но-этологической структуры популяций вида, динамика его расселения и адаптивные возможности. У длиннохвостого суслика отмечены клинальный характер изменчивости морфометрических и морфотипических признаков и высокий уровень дифференциации между западными подвидами S. u. eversmanni, S. u. stra-mineus и восточными S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis [4, 5, 36]. S. u. undulatus занимает промежуточное положение между группами западных и восточных подвидов. Краевые подвиды различаются между собой не менее, чем разные виды S. undulatus и S. parryi [2, 5]. Прежде некоторые из них были описаны как самостоятельные виды [37, 38]. Кроме того, установлен высокий уровень морфологической дифференциации между восточными подвидами длиннохвостого суслика, в то время как дифференциация между западными подвидами между собой незначительна [4, 36]. Пространственная неравномерность морфологической дифференциации подтверждается иммунологическими данными [39] и особенностями строения зубной системы [40]. Исследования географической изменчивости и внутривидовой дифференциации S. undulatus на генетическом уровне были продолжены с помощью электрофоретического анализа водорастворимых белков [4, 6, 41]. В серии указанных работ на основе количественных различий по генетическим вариантам белков крови трансферрина и постальбумина установлены достоверные отличия длиннохвостых сусликов западной (S. u. stramineus, S. u. eversmanni) и восточной (S. u. jacutensis, S. u. intercedens, S. u. menzbieri) частей ареала. Кроме того, между ними выявлена гибридная зона, охватывающая большую часть ареала S. u. undulatus в Забайкалье [4, 6], которая, предположительно, образовалась вследствие вторичного контакта данных форм в ксеротермическую фазу четвертичного оледенения и свидетельствует о незавершенности расхождения исследованных внутривидовых форм. К сожалению, исследования сусликов из гибридной зоны не имели продолжения, что не позволило авторам корректно оценить таксономическую значимость их аллозимных отличий. В настоящей работе были изучены только 4 подвида длиннохвостого суслика (S. u. eversmanni, S. u. intercedens, S. u. menzbieri, S. u. jacutensis) из 6 ныне существующих [2, 3] и исследованных ранее с помощью аллозимно-го анализа [6]. Тем не менее их географическое распространение охватывает значительную российскую часть видового ареала, и это позволило получить представление о внутривидовой генетической дифференциации S. undulatus на основе RAPD-PCR-маркёров. RAPD-PCR-анализ длиннохвостых сусликов из различных участков ареала позволил отличить нам западную (в данной работе представленную одним подвидом, S. u. eversmanni) и восточную (S. u. intercedens, S. u. jacutensis, S. u. menzbieri) формы. Восемь праймеров из десяти (кроме OPC-10 и OPC-16) инициировали амплификацию специфических фрагментов, с помощью которых легко идентифицировать особей этих форм на электрофореграммах. Все проведенные на основе этих данных анализы (распределение частот полиморфных признаков, оценка генетического полиморфизма и генетических дистанций, точный тест на дифференциацию популяций) также дискриминировали эти формы. Однако, несмотря на высокую генетическую дифференциацию данных пар, все же генетические дистанции между ними D = 0,24-0,27 и D = 0,48 (см. табл. 3 и 4 соответственно) ниже значений, обнаруженных при сравнении высокодифференци-рованных видов подрода Urocitellus: S. undulatus - S. parryi (D = 0,33-0,44 и D = 0,53) и Citellus: S. dauricus - S. relictus (D = 0,41-0,44 и D = 0,88) [19, 42]. По результатам аллозимного анализа 14 белковых систем крови генетическая дифференциация западной и восточной форм длиннохвостого суслика (D = 0,187-0,192) даже превышает таковую между парами близких видов S. suslicus - S. odessanus, S. pygmaeus - S. musicus и близка к наблюдаемой в надвидовой группе major [41, 43, 44]. По результатам сравнения последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК восточная и западная географические формы длиннохвостого суслика (D = 0,116) различаются как высокодифференцированные виды S. undulatus - S. parryi (D = 0,134) [45]. Заключение По нашим данным, подвиды S. u. intercedens, S. u. jacutensis, S. u. menzbieri, относящиеся к восточной форме, несмотря на пространственную географическую разобщенность, мало отличаются между собой. Высокое сходство RAPD-PCR-профилей, низкие генетические дистанции (D = 0,05-0,08), результаты теста на генетическую однородность популяций (р = 1,00) и их объединение на NJ-филогенетической реконструкции и UPGMA-дендрограмме генетического сходства мы склонны рассматривать как результат общности их происхождения. Близость подвидов восточной формы между собой поддерживается данными по цитогенетическому анализу сусликов из Читинской (S. u. intercedens) и Амурской областей (S. u. menzbieri), обладающих идентичными кариотипами [46]. Более тесные родственные связи сусликов «восточной» формы показаны также при сравнении генетических дистанций и полученных по результатам аллозимного анализа (D = 0-0,021) [41] и сравнения последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК (D = 0,022-0,05) [45]. Сравнение значений генетических дистанций, полученных по 288 RAPD-PCR-признакам для популяций (0,04), подвидов (0,05-0,08), географических форм (0,24-0,27) и видов подрода Urocitellus (0,33-0,44), показало существование хиатуса между каждым из перечисленных уровней дивергенции (табл. 3). Как видно из приведенных данных, разрыв между значениями двух последовательных уровней подвиды - географические формы более значителен (в среднем в 3 раза), чем между уровнями географические формы - виды (в среднем почти в 1,7 раза). В целом, характер генетической дифференциации длиннохвостого суслика на молекулярном уровне согласуется с данными морфологического, морфометрического и аллозимного исследований о значительной степени отличий восточной и западной форм. Высокий уровень аллозимной и молекулярной дифференциации географических форм длиннохвостого суслика позволяет с равной долей обоснованности рассматривать их либо в качестве самостоятельных таксонов видового уровня в рамках надвида S. undulatrn, либо в рамках единого вида, обладающего максимальной внутривидовой географической изменчивостью. Для решения данного вопроса необходимо провести комплексное исследование гибридной зоны этих форм в Прибайкалье и западной части Забайкалья. В любом случае существующая структура палеарктического вида Spermophilus undulatus является результатом продолжающегося процесса видообразования, географические формы которого, по всей видимости, сформировались сравнительно недавно, во время последнего гляциального (ледникового) периода. Авторы благодарят д-ра биол. наук, проф., зав. лабораторией цитогенетики Института биологии развития Е.А. Ляпунову и канд. биол. наук, старшего научного сотрудника лаборатории цитогенетики Института биологии развития (г. Москва) О.В. Брандлера за любезное предоставление образцов тканей реликтового и длиннохвостого сусликов, д-ра биол. наук, ведущего научного сотрудника Института геологии алмаза и благородных металлов СО РАН (г. Якутск) Г.Г. Боескорова и младшего научного сотрудника Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток) Ю.В. Татонову - за помощь в сборе и обработке материала.

Ключевые слова

intraspecific differentiation, phylogeny, genetic variability, RAPD-PCR analysis, RAPD-markers, Spermophilus undulatus, внутривидовая дифференциация, филогения, генетическая изменчивость, RAPD-маркеры, RAPD-PCR-анализ, Spermophilus undulatus

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Кораблёв Владимир ПавловичБиолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (г. Владивосток)кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, старший научный сотрудник лаборатории эволюционной зоологии и генетикиkorablev@ibss.dvo.ru
Цвирка Марина ВладимировнаБиолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (г. Владивосток)кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эволюционной зоологии и генетикиtsvirkamv@yandex.ru
Всего: 2

Ссылки

Tsvirka M., Korablev V., Pang J. Genetic differentiation and systematics of long-tailed ground squirrels Spermophilus undulatus Pallas, 1773 (Rodentia, Sciuridae) based on the molecular genetics analysis // Modern Achievements in Population, Evolutionary, and Ecological Genetics: International Symposium. Vladivostok, 2009. P. 48.
Кораблёв В.П. Цитогенетическое изучение изменчивости гетерохроматина и районов ядрышкового организатора у сусликов фауны СССР : автореф. дис.. канд. биол. наук. М. : ИБР АН СССР, 1989. 26 с.
Кораблев В.П., Фрисман Л.В., Цвирка М.В. и др. Цитологическое и аллозимное исследование сусликов группы «major» (Spermophilus, Sciuridae, Rodentia) // Проблемы эволюции. Владивосток : Дальнаука, 2003. Т. 5. С. 151-166.
Frisman L., Korablev V., Tsvirka M. et al. Genetic differentiation of ground squirrels (Spermophilus, Sciurudae, Rodentia) in major-erythrogenys-pallidicauda species group // Evolution, genetics, ecology and biodiversity: international conference. Vladivostok, 2001. P. 59.
Цвирка М.В. Молекулярно-генетические связи восточно-палеарктических сусликов рода Spermophilus (Sciuridae, Rodentia) // Териофауна России и сопредельных территорий (VIII съезд ТО). М. : КМК, 2007. С. 535.
Крюков А.П., Шереметьева И.Н., Картавцева И.В. и др. Генетические исследования ресурсных видов наземных позвоночных Российского Дальнего Востока // «Биологические ресурсы Дальнего Востока России: комплексный региональный проект ДВО РАН» / под ред. Ю.Н. Журавлёва. М. : КМК, 2007. С. 271-294.
Попков А.Ф. Внутривидовая изменчивость эколого-физиологических признаков сибирского длиннохвостого суслика Citellus undulatus Pallas : автореф. дис.. канд. биол. наук. Владивосток : БПИ ДВНЦ АН СССР, 1978. 159 с.
Пляттер-Плохоцкий К.А. Вредные и полезные животные в сельском хозяйстве ДВК. Хабаровск : Дальгиз, 1934. 143 с.
Воронцов Н.Н., Жолнеровская Е.Н., Баранов О.К. Иммуносистематика сусликов Па-леарктики (СШИт, Sciuridaе, Rodеntia). Серологическая дифференциация сусликов Палеарктики и подродовое членение рода // Зоологический журнал. 1981. Т. 60. С. 1070-1077.
Оболенский С.И. Предварительный обзор палеарктических сусликов (q.q. Citellus и Spermophilopsis) // Доклады АН СССР. 1927. С. 188-193.
Воронцов Н.Н., Межова О.Н. Клинальный характер изменчивости морфометриче-ских признаков у Citellus undulatus - вида с дизъюнктивным ареалом // Зоологический журнал. 1982. Т. 61, № 10. С. 1697-1703.
Скалон Н.В., Гагина Т.Н., Сергеев В.Е. Ареологические особенности и современное состояние популяций краснощекого и длиннохвостого сусликов в Кемеровской области // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. научн. конф. М. : КМК, 2005. С. 96-98.
Минаков И.А., СмирновМ.Н., Никитенко Б.В. Распространение и численность длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus Pall.) в Красноярском крае // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. научн. конф. М. : КМК, 2005. С. 63-65.
Винокуров В.Н. Численность и изменения ареалов длиннохвостых сусликов Якутии // Суслики Евразии (роды Spermophilus, Spermophilopsis): происхождение, систематика, экология, сохранение видового разнообразия : мат-лы рос. науч. конф. М. : КМК, 2005. С. 24-25.
ПоповВ.В., Вержуцкий Д.Б., Ткаченко В.А. Миграционная активность длиннохвостого суслика при низкой численности // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междунар. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2003. C. 273-274.
ПопковА.Ф., ЧипанинЕ.В. Эколого-фенетические исследования основных носителей чумы в сибирских природных очагах // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междун. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2003. C. 272-273.
Соломонов Н.Г., Ануфриев А.И., Седалищев В.Т. О причинах снижения численности суслика Citellus undulatus в Якутии // Териофауна России и сопредельных территорий : матер. междунар. совещ. Москва ; Тула : ИПП «Гриф и К», 2003. C. 334-335.
Ляпунова Е.А. Видообразование и филогения некоторых видов млекопитающих на основе молекулярно-генетических подходов : автореф. дис.. д-ра биол. наук. М. : ИБР АН РФ, 2002. 60 с.
Saitou N., NeiM. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phyloge-netic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. Vol. 4. P. 406-425.
Агаджанян А.К. Этапы эволюции сусликов Северной Евразии // Бюллетень МОИП. Отд. Биол. 2006. Т. 111, вып. 5. С. 4-16.
Воронцов Н.Н., Ляпунова Е.А. Строение хромосом Citellus undulatus и история становления ареалов С. undulatus и C. parryi // Доклады АН СССР. 1969. T. 187, № 1. C. 207-210.
Yeh F.C., Boyle T.J.B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits // Belgian Journal of Botany. 1997. Vol. 129. P. 157.
MillerM.P. Tools for population genetic analysis (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software distributed by author, 1997.
Nei M. Genetic distance between populations // American Naturalist. 1972. Vol. 106, № 949. P. 283-292.
Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco : W.H. Freeman and Co., 1973. P. 442.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М. : Мир, 1984. 474 с.
Tsvirka M.V., Chelomina G.N., Korablev V.P. Genetic differentiation between two Palaearc-tic groups of Ground-Squirrels, Subgenera Citellus and Colobotis (Spermophilus, Sciuridae, Rodentia), based on RAPD-PCR assay // 1st European Ground Squirrel Meeting. Felsotarkany. Hungary, 2006. P. 56.
Цвирка М.В., Спиридонова Л.Н., Кораблёв В.П. Молекулярно-генетические связи некоторых восточно-палеарктических сусликов рода Spermophilus (Sciuridae, Rodentia) // Генетика. 2008. Т. 44, № 8. С. 1108-1116.
Цвирка М.В., Челомина Г.Н., Кораблёв В.П. Генетическая дифференциация, филогене-тика и систематика пустынных сусликов подрода Colobotis (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) // Зоологический журнал. 2006. Т. 86, № 5. С. 629-640.
Цвирка М.В., Кораблёв В.П., Челомина Г.Н. Генетическая дифференциация близких видов сусликов Spermophilus musicus, S. pygmaeus, S. suslicus (Rodentia, Sciuridae) // Материалы междунар. конф. «Систематика, филогения и палеонтология мелких млекопитающих». СПб. : ЗИН РАН, 2003. С. 228-230.
Цвирка М.В. Генетическое разнообразие, филогенетические связи и систематика па-леарктических сусликов рода Spermophilus (подроды Citellus и Colobotis) : автореф. дис.. канд. биол. наук. Владивосток : БПИ ДВО РАН, 2005. 24 с.
Wasko A.P., Galletti P.M. RAPD analysis in the Neotropical fish Brycon lundii: genetic diversity and its implications for the conservation of the species // Hydrobiology. 2002. Vol. 474. P. 131-137.
Lavrenchenko L.A., Potapov S.G., Lebedev VS., Ryskov A.P. The phylogeny and system-atics of the endemic Ethiopian Lophuromys flavopunctatus species complex based upon random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis // Biochemical Systematics and Ecology. 2001. Vol. 29, № 11. P. 1139-1151.
Backeljau T., DeBruyn L., De Wolf H., et. al. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and parsimony methods // Cladistics. 1995. Vol. 11, № 2. P. 119-130.
Потапов С.Г., ВасильевВ.А., Самарина О.Г., Рысков А.П. Молекулярно-генетическое маркирование геномов представителей рода Phodopus // Генетика. 1994. T. 30, № 5. С. 615-621.
Банникова А.А. Молекулярные маркеры и филогенетика млекопитающих // Журнал общей биологии. 2004. Т. 65, № 4. С. 278-305.
Lamboy W.F. Computing genetic similarity coefficients from RAPD data: correcting for the effects of PCR artifacts caused by variation in experimental conditions // Genome Research. 1994. Vol. 4. P. 38-43.
Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Гене тика. 2002. Т. 38, № 8. С. 1013-1033.
Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. N.Y. : Chapman and Hall, 1994. 511 p.
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Гене тика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1173-1195.
Фрисман Л.В., Воронцов Н.Н. Геногеографическая изменчивость длиннохвостого суслика Citellus undulatus Pallas // Современные подходы к изучению изменчивости. Владивосток : ДВО АН СССР, 1989. С. 43-60.
Линецкая О.Н., Линецкий А.И. Видовые различия в характере краниометрической из менчивости у сусликов Восточной Палеарктики (подрод Urocitellus) // Современные подходы к изучению изменчивости. Владивосток : ДВО АН СССР, 1989. С. 99-105.
Громов И.М., Бибиков Д.И., Калабухов Н.Н., Мейер М.Н. Фауна СССР Млекопитаю щие. Наземные Беличьи (Maimotinae). М. ; Л. : Наука, 1965. T. 3. Вып. 2. 468 с.
Громов И.М., Ербаева М.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных террито рий. Зайцеобразные и грызуны. СПб. : ЗИН РАН, 1995. C. 104-136.
Vorontsov N.N., Frisman L.V., Lyapunova E.A. et al. The effect of isolation on the morphological and genetical divergence of populations // Genetica (Neth). 1980. Vol. 52-53. P. 339-359.
Громов И.М., Гуреев А.А., Новиков Г.А. и др. Млекопитающие фауны СССР. Ч. 1. М. ; Л. : Изд-во АН СССР, 1963. 638 с.
 Генетическая изменчивость и дифференциация длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus) по данным RAPD-PCR-анализа | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 4 (20).

Генетическая изменчивость и дифференциация длиннохвостого суслика (Spermophilus undulatus) по данным RAPD-PCR-анализа | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2012. № 4 (20).