Популяционно-генетический анализ и филогеография китайского печеночного сосальщика (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) на территории России | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 3 (23).

Популяционно-генетический анализ и филогеография китайского печеночного сосальщика (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) на территории России

Clonorchis sinensis относится к эпидемиологически значимым трематодам, так как способен паразитировать у человека, вызывая хроническое заболевание -клонорхоз. В России данный вид встречается только в бассейне р. Амур. В работе впервые исследуется генетическое разнообразие C. sinensis в российской части его ареала с использованием стандартного маркерного фрагмента ДНК -внутреннего транскрибируемого спейсера 1. Были проанализированы 52 особи из пяти отдаленных географических точек, расположенных в Хабаровском и Приморском краях. Полиморфизм маркерного фрагмента исследовался путем анализа данных секвенирования ДНК. Расчет стандартных статистических индексов показал низкое генетическое разнообразие C. sinensis на исследуемой территории. Значение индекса Fst свидетельствует о низкой степени дифференциации изученных популяций. Анализ распределения попарных нуклеотидных различий предполагает недавнее изменение численности вида. Выдвинуто предположение об относительно позднем заселении клонорхом Приморья в результате человеческих миграций.

Population genetic analysis and phylogeography of chinese liver fluke (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) from th.pdf Введение Китайский печеночный сосальщик - паразитическая трематода из семейства Opisthorchiidae. Основной ареал вида приходится на страны Восточной и Юго-восточной Азии, в первую очередь Китай [1]. На территории России паразит распространен только в бассейне р. Амур на Дальнем Востоке [2]. C. sinensis, как и его близкородственные виды Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) и O. viverrini (Poirier, 1886), паразитируя в желчных протоках окончательных хозяев - рыбоядных млекопитающих, включая человека [2], вызывает заболевание клонорхоз. В ряде случаев оно сопровождается тяжелыми осложнениями, в том числе холангиокарциномой. По данным Международного агентства по изучению рака (IARC) C. sinensis отнесен к канцерогенным факторам первой группы [3]. Первые оценки внутривидового генетического разнообразия C. sinensis были сделаны на основе результатов анализа нуклеотидного полиморфизма в ряде ядерных и митохондриальных маркеров у 3-4 особей из разных мест ареала [4, 5]. Кроме того, ранее для ITS1 было выявлено два уровня внутривидовой вариабельности [6]. Однако, несмотря на большое эпидемиологическое значение этого паразитического вида, исследования его популяцион-ной структуры до сих пор не проводились. Популяционно-генетические исследования паразитических видов позволяют оценить степень их генетического разнообразия и имеют огромное значение в понимании процессов, проходящих в их популяциях в прошлом и в настоящее время. Понимание факторов, определяющих популяционно-генетическую структуру у трематод со сложным жизненным циклом, может иметь решающее значение для мероприятий, направленных на санитарно-эпидемиологический контроль трематодозов. В настоящее время для популяционно-генетических исследований широко используются маркерные фрагменты ДНК (митохондриальные гены, ITS1 и ITS2, микросателлитные последовательности), имеющие достаточную вариабельность, чтобы оценить генетическое разнообразие в природных популяциях и реконструировать филогеографию видов. ITS1 является некодирующим участком в кластере рибосомальных генов и эволюционирует гораздо быстрее, чем последовательности собственно рибосомальных РНК, а также ядерных белок-кодирующих генов [7]. В результате высокой вариабельности ITS1 часто используется для решения филогенетических и популяционных задач, в том числе и у трематод [8]. Цель работы - изучить генетическое разнообразие C. sinensis на российской части его ареала. Материалы и методики исследования Метацеркарии C. sinensis были собраны из мышечной ткани карповых рыб (Cyprinidae): гольяна озёрного (Phoxinus percnurus, Pallas, 1814), горчака обыкновенного (Rhodeus sericeus, Rhodeus sericeus, Pallas, 1776), желтощёка (Elopichthys bambusa, Richardson, 1845) и амурского чебачка (Pseudorasboraparva, Temminck и Schlegel, 1846), отловленных в трех географических точках: в Анученском (р. Арсеньевка) и Дальнереченском (р. Б. Уссурка) районах Приморского края и в г. Хабаровске (о. Б. Уссурийский, р. Амур) (рис. 1). Рис. 1. Места сбора образцов C. sinensis. Вверху для каждого района показано количество проанализированных образцов Из 26 образцов ДНК была выделена стандартным фенол-хлороформным методом [9]. Для ПЦР и секвенирования использовались следующие праймеры: прямой 5'-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA и обратный 5'-ACAC-GAGCCGAGTGATCC с температурой отжига 59°C. ПЦР проводилась в общем объеме 20 мкл (250 мкМ dNTP, 25 мкМ dUTP, праймеры по 200 нМ каждого, 0,1 ед. урацил-ДНК-гликозилазы (Fermentas), 1,5 мМ MgCl2, 1,5 ед. TrueStart Hot Start Taq DNA polymerase (Fermentas) и соответствующий ей ПЦР буфер) при следующих условиях: 37°С - 5 мин, 94°С - 2 мин, 10 циклов: 94°С - 10 с, 69°С, декремент -1°С за цикл - 20 с, 72°С - 40 с, 20 циклов: 94°С - 10 с, 59°С - 20 с, 72°С - 40 с, финальная элонгация при 72°С - 5 мин. Секвенирование проводилось по методу Сэнгера с использованием BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, USA). Продукты реакции Сэнгера были проанализированы на приборе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Последовательности депонированы в Genbank (KC987514-539). Последовательность наиболее представленного гаплотипа находится в Genbank под номером KC987514. Кроме полученных нами данных, мы также использовали 26 последовательностей фрагмента ITS1 C. sinensis, депонированных в Genbank с номером JQ048576-601 из Спасского (с. Кронштадтка) и Уссурийского (с. Кондратеновка) районов (см. рис. 1) [6]. Таким образом, для анализа была подготовлена выборка из 52 последовательностей; использовался фрагмент позиций 153-607 (JQ048601). Суммарно было охвачено 5 географических точек (см. рис. 1). Расчет стандартных статистик генетического разнообразия и оценка демографической динамики вида были проведены с помощью программы DnaSP 4.5 [10]. Медианная сеть гаплотипов была построена методом median joining в программе Network 4.6 [11]. Степень дифференциации популяций рассчитана в программе Arlequin 3.5 [12]. Результаты исследования и обсуждение Анализ нуклеотидного полиморфизма во фрагменте ITS1 выявил низкое генетическое разнообразие у C. sinensis в Приморье. Анализируемый фрагмент был представлен двумя формами: 92,3% последовательностей имели 450 п.о., а 7,7% - 455 п.о. Различие последовательностей по длине объясняется разным количеством повторов (GCCTG). Было найдено всего 6 гаплотипов. Доля полиморфных позиций (S) составила 1,8% (8 пар оснований, из которых 5 приходится на инсерцию / делецию (И/Д)). Индекс генного (гаплотипического) разнообразия (Hd) - 0,21 ± 0,05, нуклеотидного (п) - 0,0006 ± 0,0002. Далее мы провели оценку различий между 5 популяциями, использованными в анализе. Согласно S. Wright, полученное значение индекса Fst (0,045; р = 0,059) свидетельствует о низкой степени их дифференциации [13]. При построении сети гаплотипов было выявлено значительное преобладание одного (мажорного) гаплотипа, доля которого составила 88,5%. Из оставшихся 5 гаплотипов 3 были синглетными, т.е. встретились только у одной особи (рис. 2). Максимальное расстояние между гаплотипами составило 3 нуклеотидные замены и одну И/Д 5 оснований, т.е. оно является относительно большим для такой слабоструктурированной сети. Рис. 2. Медианная сеть гаплотипов C. sinensis. Указаны частоты гаплотипов в выборке, размер узла сети пропорционален частоте гаплотипа. Цветовая кодировка обозначает места сбора образцов и соответствует таковой на рис. 1 Таким образом, мы показали, что исследованная территории клонорха характеризуют: 1) низкое генетическое разнообразие; 2) низкие различия между популяциями; 3) бедная гаплотипическая сеть с преобладанием одного гаплотипа. Наблюдаемую нами картину можно объяснить экспансией вида после переселения небольшой группы на новые территории («эффект основателя», когда происходят снижение разнообразия и случайное смещение частот гаплотипов) или после прохождения видом «узкого бутылочного горлышка» на занимаемой им ранее территории. Формирование подобной структуры под действием отбора (преобладание одного гаплотипа вследствие его приспособительного преимущества) можно исключить, поскольку ITS1 считается селективно нейтральным участком ДНК. Многие виды палеоарктической зоны претерпели снижение численности в результате геоклиматических событий плейстоцена с последующей экспансией из небольшой предковой группы, сохранившейся в убежищах (рефугиумах) [14]. В нашей работе, посвященной O. felineus, было показано крайне низкое разнообразие вида на огромной территории и высказано предположение о восстановлении этого вида из популяции с низкой численностью и бедным генофондом [15]. Напротив, у другого близкородственного вида O. viverrini, ареал которого ограничен бассейном р. Меконг в тропических широтах, было показано высокое генетическое разнообразие и наличие разветвленной сети гаплотипов [16]. К сожалению, фактически нет работ, исследующих генетическое разнообразие клонорха на территории его обширного ареала, приходящегося как на умеренную, так и на субтропическую климатические зоны. Для подтверждения гипотезы об экспансии вида мы провели оценку динамики численности C. sinensis на российской части ареала с помощью анализа распределения попарных нуклеотидных различий. Было получено унимодальное L-образное распределение замен (рис. 3), что позволяет предположить недавнее изменение численности вида на российской части его ареала. Этот анализ также позволяет оценить параметр т (т = 2ut; t - время, рассчитанное в поколениях; u - скорость накопления мутаций в последовательности за поколение). Для шистосом (Schistosomatidae, Trematoda) было показано, что скорость накопления мутаций составляет 0,8% за миллион лет [17]. Используя данные С.А. Беэра о том, что смена поколений у близкородственного вида O. felineus происходит за один год, мы приняли такую же оценку для C. sinensis [18] и рассчитали, что изменение численности C. sinensis на изучаемой территории началось порядка 4,5 тыс. лет назад. 0,8 0,4 Рис. 3. Распределение попарных нуклеотидных различий. Зеленая сплошная линия - значения, ожидаемые для модели растущей популяции, красная пунктирная - полученные нами значения 0,Б 0,2 0, 0 5 10 15 20 Попарные различия Во время плейстоценовых похолоданий климат на изучаемой территории был значительно холоднее современного. Несмотря на отсутствие ледового щита, повсеместно встречались участки вечной мерзлоты, и долины были заболочены [19]. Таким образом, условия были непригодны для существования C. sinensis. Поскольку основной современный ареал C. sinensis расположен на территории Китая, то логично предположить, что заселение изучаемой территории произошло именно оттуда по завершению ледникового периода. Однако на пути естественной миграции из Восточной Азии на Дальний Восток России присутствует географический барьер - Малый Хинган и Мань-чжуро-Корейские горы, являющиеся серьезным препятствием для диких животных [20, 21]. Поскольку данные археологических раскопок свидетельствуют о появлении активных миграций человеческих племен на территории Маньчжурии начиная с 6,5 тыс. лет назад, можно предположить, что основную роль в заселении Приморья клонорхом мог сыграть человек [22]. Заключение Таким образом, показано низкое генетическое разнообразие C. sinensis на изучаемой территории. Филогеографический анализ вида позволил предположить, что подобная картина могла сформироваться вследствие недавнего проникновения вида на Дальний Восток России, имевшего место приблизительно 4,5 тыс. лет назад и предположительно связанного с миграциями человека.

Ключевые слова

Opisthorchiidae, Clonorchis sinensis, Trematoda, phylogeography, рopulation genetics, Clonorchis sinensis, Opisthorchiidae, трематоды, филогеография, популяционная генетика

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Мордвинов Вячеслав АлексеевичИнститут цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск)доктор биологических наук, зам. директора по научной работеmordvin@bionet.nsc.ru
Сазонов Алексей ЭдуардовичСибирский государственный медицинский университет (г. Томск)доктор медицинских наук, главный научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лабораторииsazonov_al@mail.ru
Семенченко Надежда НиколаевнаТихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, Хабаровский филиалкандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории пресноводных биоресурсовn.semenchenko@mail.ru
Беспрозванных Владимир ВладимировичБиолого-почвенный институт Дальневосточной отделение Российской академии наук (г. Владивосток)доктор биологических наук, зав. лабораторией паразитологииbesproz@ibss.dvo.ru
Катохин Алексей ВадимовичИнститут цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск)кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессовkatokhin@bionet.nsc.ru
Брусенцова Ирина ВитальевнаИнститут цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск)кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессовbrusiii@ngs.ru
Брусенцов Илья ИвановичИнститут цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск)инженер лаборатории молекулярных механизмов патологических процессовbrusentsovi@gmail.com
Всего: 7

Ссылки

Вострецов Ю. Приморские охотники-собиратели и земледельцы бассейна Японского моря: адаптация и взаимодействие в среднем и позднем голоцене (6500-1800 лет назад) : автореф. дис.. д-ра ист. наук. СПб., 2010. 64 c.
Driscoll C., Yamaguchi N., Bar-Gal G. et al. Mitochondrial phylogeography illuminates the origin of the extinct caspian tiger and its relationship to the amur tiger // PloS one. 2009. Vol. 4, № 1. P. e4125.
Shi Y., Cui Z., Li J. Reassessment of Quaternary glaciation problems in East China. Earth Sciences 2 / ed. by G. Tu // Advances in Science of China: Earth Sciences. 1987. P. 45-54.
Белянин П. Растительность междуречья рек Уссури и Сунгач в позднем плейстоцене (Приморский край). Актуальные проблемы палеогеографии и стратиграфии плейстоцена. М. : Географ. факультет МГУ, 2010. С. 14.
Беэр С.А. Биология возбудителя описторхоза. М. : Тов-во науч. изд. КМК, 2005. 336 c.
Despres L., Imbert-Establet D., Combes C., Bonhomme F. Molecular evidence linking hom-inid evolution to recent radiation of schistosomes (Platyhelminthes: Trematoda) // Molecular phylogenetics and evolution. 1992. Vol. 1, № 4. P. 295-304.
Thaenkham U., Nuamtanong S., Sa-nguankiat S. et al. Monophyly of Opisthorchis viverrini populations in the lower Mekong Basin, using mitochondrial DNA nad1 gene as the marker // Parasitology international. 2010. Vol. 59. P. 242-247.
Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis // Evolutionary bioinformatics online. 2005. Vol. 1. P. 47-50.
Wright S. Evolution and Genetics of Population. Chicago : University of Chicago Press, 1978. 590 p.
Hewitt G. Post-glacial re-colonization of European biota // Biological Journal of the Linnean Society. 1999. Vol. 68, № 1-2. P. 87-112.
Brusentsov I.I., Katokhin A.V., Brusentsova I.V. et al. Low Genetic Diversity in WideSpread Eurasian Liver Fluke Opisthorchis felineus Suggests Special Demographic History of This Trematode Species // PloS one. 2013. Vol. 8(4). e62453.
Rozas J., Sanchez-DelBarrio J., MesseguerX., RozasR. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics (Oxford, England). 2003. Vol. 19, № 18. P. 2496-2497.
Bandelt H., Forster P., Rohl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies // Molecular biology and evolution. 1999. Vol. 16, № 1. P. 37-48.
Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 2344 p.
Nolan M., Cribb T. The use and implications of ribosomal DNA sequencing for the discrimi nation of digenean species // Advances in parasitology. 2005. Vol. 60, № 2. P. 101-163.
Tatonova Y., Chelomina G., Besprosvannykh V. Genetic diversity of nuclear ITS1-5.8S-ITS2 rDNA sequence in Clonorchis sinensis Cobbold, 1875 (Trematoda: Opisthorchidae) from the Russian Far East // Parasitology international. 2012. Vol. 61, № 4. P. 664-674.
Hwang U.W., Kim W. General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics // The Korean journal of parasitology. 1999 Vol. 37. P. 215-228.
Park G-M. Genetic comparison of liver flukes, Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini, based on rDNA and mtDNA gene sequences // Parasitology research. 2007. Vol. 100, № 2. P. 351-357.
Bouvard V., Baan R., Straif K. et al. A review of human carcinogens--Part B: biological agents // The lancet oncology. 2009. Vol. 10, № 4. P. 321-322.
Lee S., Huh S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese iso lates of Clonorchis sinensis // The Korean journal of parasitology. 2004. Vol. 42, № 3. P. 145-148.
Беспрозванных В.В., Ермоленко А.В., Румянцева Е.Е. и др. Нозоареалы клонорхоза в Приморском крае // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012. № 2. С. 7-14.
Посохов П.С. Клонорхоз в Приамурье. Хабаровск : Изд-во Дальневосточ. гос. мед. ун та, 2004. 187 с.
 Популяционно-генетический анализ и филогеография китайского печеночного сосальщика (<i>Clonorchis sinensis</i> Cobbold, 1875) на территории России | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 3 (23).

Популяционно-генетический анализ и филогеография китайского печеночного сосальщика (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) на территории России | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 3 (23).