Локализация районов XL хромосомы ассоциированных с ламином в трофоцитах малярийных комаров | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).

Локализация районов XL хромосомы ассоциированных с ламином в трофоцитах малярийных комаров

С помощью иммуноокрашивания хромосом антителами к ламину В дрозофилы локализованы остатки ядерной оболочки на политенных хромосомах трофо-цитов близких видов малярийных комаров Anopheles atroparvus Thiel. An. messeae Fall. и An. beklemishevi Steg. et Kab. Проанализировано распределение ламина на самой короткой хромосоме набора - XL хромосоме. Ламин выявлялся в дискретных районах XL хромосомы. Число, ширина, распределение на хромосоме наиболее ярких сигналов ламина различаются у разных видов и являются видоспеци-фичным признаком. У An. messeae и An. beklemishevi ламин обнаружен в районах прикрепления хромосом к ядерной оболочке, которые были картированы ранее в ходе исследования полудавленных ядер трофоцитов. Отсутствие ламина в районе прикрепления XL хромосомы у An. atroparvus связано со специфической морфологией прицентромерных районов хромосом и недостатками методики приготовления препаратов хромосом. Межвидовые различия в распределении ла-мина на XL хромосоме свидетельствуют о трансформации системы контактов хромосом с ядерной оболочкой клеток генеративной системы в ходе эволюции.

Localization of XL chromosome regions associated with lamin in nurse cells of malaria mosquitoes.pdf Введение Неслучайная позиция хромосом в ядре обеспечивается двумя механизмами: 1) многообразие белковых комплексов, посредством которых пространственно удаленные локусы физически ассоциируют; 2) специфические локусы могут быть закреплены на некой структуре, выступающей в роли скэффолда, например ядерной ламине [1]. С помощью метода DamID [2] было показано, что филогенетически далекие организмы, такие как дрозофила, мышь и человек, имеют большие домены, ассоциированные с ядерной ламиной, - ЛАДы [3-6]. По-видимому, ЛАДы выполняют важные функции в клеточном ядре, некоторые гены при активации в процессе дифференциров-ки могут открепляться или прикрепляться к ядерной ламине [5]. ЛАДы образуют неоднородную группу - некоторые имеют консервативное расположение в геноме независимо от типа клетки, тогда как другие могут встречаться лишь в клетках определенного типа [7]. Положение консервативных ЛАДов в геномах 28 плацентарных является более постоянным, чем их последовательность, если сравнивать с факультативными ЛАДами и остальной некодирующей частью генома. Таким образом, у плацентарных животных в клетках соматической системы хромосомы имеют эволюционно консервативную систему взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Сходные результаты по изучению архитектуры хромосом слюнных желез у близких видов малярийных комаров были получены в нашей лаборатории [8, 9]. Хромосомы слюнных желез, как и у дрозофилы, а также мальпигиевых сосудов малярийных комаров образуют хромоцентр, что свидетельствует о консервативности крупномасштабной организации ядер соматических клеток у этих насекомых [9]. Это подтверждают и эксперименты по колокализации районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке в интактных ядрах слюнных желез, мальпигиевых сосудов и има-гинальных дисков у комаров An. atroparvus, An. messeae, An. beklemishevi с помощью 3D-FISH (см. статью в номере). Представляет интерес исследовать, каким образом организованы ЛАДы в клетках генеративной системы организмов; сохраняется ли эволюционная консервативность их расположения на хромосомах. Ранее на малярийных комарах было показано, что хромосомы трофоцитов имеют выраженные контакты с ядерной оболочкой, которые можно увидеть с применением рутинной окраски хромосом на полудавленных ядрах. Таким образом, впервые были найдены межвидовые различия во взаимодействии хромосом с ядерной оболочкой в клетках генеративной системы [8]. Недавние работы по исследованию консервативных ЛАДов у млекопитающих показали, что эти домены занимают протяженные участки генома и содержат большее, по сравнению с остальным геномом, количество элементов, ассоциированных с ламином B1 [7]. В настоящей работе нами было проведено исследование локализации ламина В на хромосомах трофоцитов близких видов малярийных комаров с целью поиска межвидовых различий. Для упрощения задачи мы сосредоточили внимание на XL хромосоме, так как она короче остальных хромосом набора и является наиболее изменчивой у видов Anopheles комплекса maculipennis. Материалы и методики исследования Нами была использована методика иммуноокрашивания хромосом, которая применялась для выявления ламина на хромосомах трофоцитов An. gambiae [10]. Материалом для исследования служили имаго малярийных комаров An. atroparvus van Thiel., взятые из лабораторной культуры, An. messeae Fall. и. и An. beklemishevi Steg. et Kab., собранные в в природных популяциях пос. Коларово Томской области и с. Чаинск Томской области в июне - августе 2012 г. и в июне 2013 г. Яичники самок малярийных комаров выделяли на III стадии развития по Селла и немедленно готовили препарат хромосом. Районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке выявляли с помощью иммуноокрашивания хромосом антителами к ламину В-типа дрозофилы - белку Dm0 (DSHB, США) [11] - и антителами кролика к белкам мыши, конъюгированными с FITC (Sigmaaldrich, США) [12]. В эксперименте использовали препараты хромосом трех особей каждого вида. Приготовленные методом иммуноокрашивания препараты политенных хромосом микроскопировали с помощью микроскопа Axio Imager Z1 «Carl Zeiss» (Германия). Анализ, получение и обработку фотографий проводили с помощью программ AxioVision 4.7 «Carl Zeiss» (Германия). Результаты исследования и обсуждение В ходе эволюции малярийных комаров сильным преобразованиям подвергается XL хромосома. XL хромосома (ее длина, порядок дисков, морфология отдельных районов) является главным диагностическим признаком при определении вида [13]. Ранее было отмечено, что близкие виды комаров также четко различаются по особенностям прикрепления хромосом к ядерной оболочке: по наличию или отсутствию районов прикрепления, их расположению и морфологии [8]. У An. atroparvus район прикрепления XL хромосомы расположен в прицентромерной области и имеет веерообразную форму. У An. messeae район прикрепления располагается как в прицентро-мерном участке хромосомы, так и в середине плеча из-за внутривидовых инверсий. У An. beklemishevi район прикрепления находится в середине плеча, но контакт обеспечивают более тонкие тяжи хроматина. Межвидовые различия по XL хромосоме трофоцитов малярийных комаров и особенностях ее взаимодействия с ядерной оболочкой свидетельствует об особой роли этой хромосомы в видообразовании. В связи с этим для нас представлял большой интерес оценить различия в прикреплении XL хромосом к ядерной оболочке с помощью более чувствительного иммуно-гистохимического метода. Мы не имели возможности использовать метод DamID, так как он требует информации о последовательности генома, которая к настоящему времени отсутствует для видов An. atroparvus, An. messeae и An. beklemishevi (https://www.vectorbase.org/genomes). Между тем мы рассчитывали, что поиск остатков ядерной оболочки на хромосомах с использованием антител выявит мажорные области прикрепления хромосом. Кроме того, анализ хромосом полезен для оценки морфологических характеристик районов, связанных с ядерной ламиной, и соответствия районам прикрепления хромосом, выявленным ранее [8]. Как мы и ожидали, анализ показал, что различия в контактах хромосом действительно присутствуют. Нами были обнаружены как дополнительные районы взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой, так и отсутствие сигнала в районах, которые определяются как районы прикрепления на уровне световой микроскопии. Следует отметить, что сравнение линейной организации хромосом трофоцитов разных видов затруднено из-за упомянутых перестроек, которые сопровождали эволюцию изучаемой группы. Однако нами были предприняты попытки картирования районов локализации ламина с использованием карты точек разрыва хромосомных перестроек, приведенных в монографии [13] (рис. 1). a M|Vl № *тлиI IV. С 13с 2с1 I 1 [ |2b I 3b| I 4 ГЛ |3b 2Ь| I d «^«H-Hf^Wc Рис. 1. Изменение линейной структуры XL хромосомы видов An. beklemishevi (а), An. atroparvus (b), An. messeae (c,d) [по 13]. Представлены хромосомы слюнных желез, обозначения районов по карте хромосом слюнных желез An. atroparvus (предковый вид): c - гомозигота по инверсии XL00; d - гомозигота по инверсии XL11; С - центромера Несмотря на то что в рамках исследования невозможно оценить с высокой уверенностью, какие сайты хромосомы локализуются в гомеологичных районах, а какие нет, очевидно, что число и распределение этих сайтов вдоль хромосом различно. Для удобства сайты локализации ламина, выявленные в данном эксперименте, мы будем называть L-сайты (от lamin sites - сайты ламина), противопоставляя их понятию «район прикрепления», которое традиционно используется нами для обозначения районов контактов хромосом, выявленных при использовании рутинных методов окраски препаратов полудавленных ядер трофоцитов [8]. У An. messeae в районе прикрепления хромосомы нами было обнаружено два L-сайта (2b, 2c, обозначения районов здесь и далее приводятся по карте слюнных желез An. atroparvus), а также два дополнительных L-сайта в дис-тальной части левого плеча. У An. atroparvus сигналы выявлены в районах 3a и 4a, а наиболее выраженный сигнал - в районе 2b-2c. В XL хромосоме An. beklemishevi мы выявили четыре L-сайта в районах 1d, 5a и 3b, а также в районе прикрепления 4b. Рис. 2. Локализация ламина В на XL хромосоме трофоцитов An. beklemishevi (а), An. atroparvus (b) и An. messeae (с): обозначения районов по карте хромосом слюнных желез An. atroparvus, хромосома XL An. messeae представлена в виде гомозиготы по инверсии XL ; стрелками указана локализация ламина (L-сайтов); чертами обозначены границы маркерных районов; РП - район прикрепления; С - центромера, масштабная линейка 10 мкм Следует отметить, что распределение L-сайтов на хромосомах, представленное на рис. 2, демонстрирует наиболее типичную картину взаимодействия хромосом с ядерной ламиной. В ходе анализа нами было обнаружено несколько большее число L-сайтов. Однако чтобы исключить сигналы, связанные с неспецифическим мечением антителами, и выявить наиболее выраженные контакты, мы учитывали только те L-сайты, которые детектировались на хромосомах четырех и более ядер (таблица). Практически все сигналы, обнаруженные нами, встречались у каждой проанализированной особи. Исключение составляют районы 4a и 3 a An. atroparvus и район 2c An. messeae. Впрочем, эта ситуация, скорее всего, связана с ограниченной выборкой подходящих для анализа хромосом у этих самок и невысоким качеством препаратов. Частота встречаемости сигналов ламина в районах XL хромосомы трофоцитов малярийных комаров XL An. atroparvus (3 особи) XL An. messeae (3 особи) XL An. beklemishevi (3 особи) 1 2 1 2 1 2 4a 7/13; 0/2; 3/3 2с 0/1; 8/8; 2/2 3b 3/4; 4/4; 7/9 3a 6/13; 0/2; 3/3 2b 1/1; 8/8; 2/2 5a 4/4; 4/4; 9/9 2b-2c 12/13; 2/2; 3/3 2a 1/1; 4/8; 1/2 4b 4/4; 4/4; 9/9 1c 1/1; 4/8; 1/2 1d 4/4; 4/4; 9/9 Примечание. 1 - район XL хромосомы; 2 - количество ядер с сигналом в соответствующем районе / общее количество проанализированных хромосом. Необходимо отметить, что в некоторых случаях мы находили сигналы только в одном гомологе хромосомы, тогда как в другом гомологе сигнал отсутствовал вовсе (рис. 3). Яркость сигналов в таких хромосомах исключает возможность ошибки эксперимента. Полученные данные могли бы свидетельствовать в пользу внутривидовых различий в паттерне взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой, но различия в L-сайтах у гомологов XL хромосомы в пределах одного ядра наблюдались нами в единичных ядрах. Рис. 3. Различия в локализации ламина на гомологах XL хромосомы трофоцитов An. atroparvus Большинство L-сайтов выглядят как более или менее тонкие яркие бен-ды, которые локализуются в междисках хромосом. L-сайты встречаются также и в районах с диффузной морфологией, которых в XL хромосоме каждого вида находится в среднем по одному. В этом случае мы наблюдали «рыхлые», но обычно менее яркие сигналы в районах 2b-2c An. atroparvus и 2b-2c An. messeae (см. рис. 2). Районы прикрепления XL хромосом An. messeae и An. beklemishevi совпадают с L-сайтами. У An. beklemishevi это широкий бенд в диффузном районе 4b, который обнаруживался нами во всех исследованных ядрах. У An. messeae в районе 2b-2c выявлено два сигнала, разделенных немеченой областью. Интересно, что в половине проанализированных нами ядер такой области не было видно, а сигнал занимал весь район прикрепления. Очевидно, что районы прикрепления хромосом, наблюдаемые нами ранее при использовании рутинных окрасок, обеспечивают очень прочное взаимодействие хромосом с ядерной оболочкой, которое не разрушается даже при деформировании ядра в ходе приготовления препарата. В хромосомах XL An. beklemishevi и An. messeae в таких районах расположен наиболее яркий и протяженный сигнал. Исключение в этом смысле составляет только XL хромосома An. atroparvus, у которой мы не выявили сигналов ламина в прицентромерном районе. Система прикрепления хромосом к ядерной оболочке в области центромеры, по-видимому, имеет свои особенности, так как представлена у малярийных комаров декомпактизованными и недореплицированными нитями хроматина. Эти районы чрезвычайно хрупкие, так как при приготовлении давленных препаратов целостность хромосомы нарушается и происходит разделение плеч. С хромосомами без районов прикрепления в прицентро-мерной области, таких как хромосома 2 An. messeae и An. atroparvus, такого не происходит. Районы прикрепления хромосом, расположенные в прицен-тромерной области, образуют характерную морфологию в виде веерообразной сетчатой структуры с тонкими тяжами, которые распластаны на ядерной оболочке. При отделении хромосом от ядерной оболочки в ходе приготовления препаратов эти тяжи остаются связанными с ядерной ламиной. В случае, если мы анализируем хромосому, сохранившую контакт с ядерной оболочкой, становится невозможным «отделить» фоновый сигнал, который дает ядерная ламина, от сигнала на тонких диффузных фибриллах, распластанных на ней (рис. 4). Поэтому даже если связь хромосомы с ядерной оболочкой присутствует, то обнаружить ее очень трудно, так как специфическая сетчатая морфология районов прикрепления не создает необходимой «концентрации» сигнала, как это происходит в интеркалярных районах хромосом. Следует добавить, что предварительный анализ районов прикрепления, локализованных в прицентромерных районах остальных хромосом набора (как хромосомы 3 у трех видов, так и хромосомы 2 у An. beklemishevi), дал сходные результаты. Таким образом, иммуноокрашивание хромосом антителами к ламину В показало свою эффективность только для выявления L-сайтов, расположенных в интеркалярных районах хромосом, тогда как для терминальных районов с диффузной организацией хроматина этот метод не подходит. Анализ межвидовых различий по L-сайтам показал отсутствие совпадения районов, в которых они локализованы (см. рис. 2). Исключение составляют лишь районы 2b-2c у An. messeae и An. atroparvus. Эти районы у обоих видов имеют схожие морфологические особенности - диффузная структура с нарушенной дисковой исчерченностью. Общее происхождение этих районов подтверждается тем, что ДНК из района 2b-2c An. messeae гибриди-зуется с районом 2b-2c An. atroparvus в эксперименте FISH [14]. Следует обратить внимание, что сила взаимодействия XL хромосомы у An. messeae и An. atroparvus различается, так как контакты XL хромосомы An. messeae в районе 2b-2c можно наблюдать на препаратах недавленых ядер, а у XL An. atroparvus такие контакты не обнаружены. Можно сделать вывод, что в ходе эволюции происходит преобразование свойств районов прикрепления, что, возможно, приводит к изменению прочности контактов хромосом с ядерной оболочкой. Рис. 4. Сравнение локализации ламина на XL хромосоме полудавленного ядра An. atroparvus с разным уровнем обработки сигнала FITC: A, B - полная нивелировка фонового сигнала FITC, сигнал заметен только в интеркалярных районах хромосомы; C, D - частичная обработка сигнала FITC, полностью окрашена ламина (фон); дискретный сигнал в районе прикрепления хромосомы (белый контур) не выявляется Несовпадение других L-сайтов в XL хромосомах разных видов показывает, что принцип эволюционной консервативности расположения ЛАД не столь очевиден при оценке результатов иммуноокрашивания хромосом малярийных комаров. Вероятно, в ходе эволюции происходило преобразование структуры взаимодействия хромосом с ядерной ламиной, что приводило как к изменению мощности этих контактов, так и к возникновению в новых районах и исчезновению в старых. Это подтверждается практически полным отсутствием L-сайтов в гомейологичных районах разных видов комаров. Однако необходимо провести более точный анализ гомологии районов, связанных с ламином, XL хромосом у An. atroparvus, An. messeae и An. beklemishevi с использованием in situ гибридизации. Заключение Анализ локализации ламина на XL хромосоме трофоцитов подтвердил показанные ранее межвидовые различия в прикреплении хромосом к ядерной оболочке. Сигналы ламина имели дискретную локализацию в виде более или менее широких бендов в междисках, что говорит о большой протяженности этих районов и подтверждается данными по ламинассоциированным доменам, границы которых были установлены для некоторых групп животных [3-6]. Вероятно, нами выявлены наиболее значительные районы взаимодействия с ядерной оболочкой, так как в анализ вовлекались наиболее яркие L-сайты, уверенно идентифицируемые в большинстве хромосом и у разных особей. Это не исключает существование более слабых взаимодействий хромосом с ядерной оболочкой, которые маркируют более слабые сигналы, отмеченные нами лишь в нескольких хромосомах либо не обнаруженные вовсе. Такие контакты, вероятно, можно будет определить в ходе анализа более чувствительными подходами, как DamlD. Задачей настоящего исследования было выявление мажорных L-сайтов, для чего иммуноокрашивание хромосом представляется более удачным подходом. Несовпадение L-сайтов с наблюдаемым нами ранее районом прикрепления хромосомы происходит в прицентромерном районе XL хромосомы An. atroparvus с диффузной морфологией. Этот результат не позволяет рассматривать данный район в качестве инертного в отношении взаимодействия с ядерной оболочкой, так как цитологические наблюдения, проводимые нами неоднократно, свидетельствовали об его участии во внутриядерной архитектуре. Более того, на наш взгляд, наиболее информативным является использование нескольких методических подходов для выявления хромосомных контактов. Нам не удалось показать эволюционную консервативность расположения контактов хромосом с ядерной ламиной, как это было сделано на клетках соматической системы млекопитающих [7]. Это может свидетельствовать о значительных различиях во взаимодействии хромосом с ядерной оболочкой в клетках генеративной и соматической систем. В дальнейших исследованиях мы планируем провести анализ сайтов связывания ламина на остальных хромосомах набора у видов An. messeae, An. atroparvus и An. beklemishevi, а также установить гомологию ДНК этих районов с помощью in situ гибридизации.

Ключевые слова

Anopheles, malaria mosquitoes, nuclear lamina, nuclear envelope, polytene chromosomes, lamin associated domains, chromosome attachment regions to nuclear envelope, nucleus spatial organization, Anopheles, малярийные комары, ядерная ламина, ядерная оболочка, политенные хромосомы, ламин-ассоциированные домены, районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке, пространственная организация ядра

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Стегний Владимир НиколаевичТомский государственный университетдоктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией эволюционной цитогенетики Научно-исследовательского института биологии и биофизики; зав. кафедрой цитологии и генетики Биологического институтаgene@res.tsu.ru
Сапунов Глеб АлександровичТомский государственный университетстудент кафедры цитологии и генетики Биологического институтаglebsapunov@yandex.ru
Артемов Глеб НиколаевичТомский государственный университеткандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории эволюционной цитогенетики научно-исследовательского института биологии и биофизики; доцент кафедры цитологии и генетики Биологического института; старший научный сотрудник Молодежного центраg-artemov@mail.ru
Всего: 3

Ссылки

Артемов Г.Н., Абылкасымова Г.М., Стегний В.Н. Молекулярно-генетический анализ района прикрепления хромосом к ядерной оболочке малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis // Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2011. № 14 (4). С. 157-169.
Stuurman N., Maus N., Fisher P.A. Interphase phosphorylation of the Drosophila nuclear lamin: site-mapping using a monoclonal antibody // J. Cell Sci. Vol. 108. P. 3137-3144.
Bible E., Chau D.Y.S., Alexander M.R. et al. Attachment of stem cells to scaffold particles for intra-cerebral transplantation // Nature Protocols. 2009. Vol. 4, № 10. P. 1440-1453.
Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск : Изд-во Том. ун-та, 1991. 137 с.
Sharakhova M. V., George P., Brusentsova I.V. et al. Genome mapping and characterization of the Anopheles gambiae heterochromatin // BMC Genomics. 2010. Vol. 11. C. 459.
Стегний В.Н. Системная реорганизация архитектоники политенных хромосом в онтои филогенезе малярийных комаров. Сообщение I. Различия структуры ядер соматических и генеративной тканей // Генетика. 1987. Т. 23, № 5. С. 821-827.
Meuleman W., Peric-Hupkes D., Kind J. et al. Constitutive nuclear lamina-genome inter actions are highly conserved and associated with A/T-rich sequence // Genome research. 2012. Vol. 23. P. 270-280.
Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе маля рийных комаров // Доклады АН СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231.
Peric-Hupkes D., Meuleman W., Pagie L. et al. Molecular maps of the reorganization of genomenuclear lamina interactions during differentiation // Mol. Cell. 2010. Vol. 38. P. 603-613.
van Bemmel J.G., Pagie L., Braunschweig U. et al. The insulator protein SU(HW) fine-tunes nuclear lamina interactions of the Drosophila genome // PLoS ONE. 2010. Vol. 5, № 11. P. e15013.
Pickersgill H., Kalverda B., de Wit E. etal. Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina // Nat. Genet. 2006. Vol. 38. P. 1005-1014.
Guelen L., Pagie L., Brasset E., Meuleman W. et al. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 2008. Vol. 453. P. 948-951.
van Steensel B., Dekker J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture // Nat. Biotechnol. 2010. Vol. 28. P. 1089-1095.
Greil F., Moorman C., van Steensel B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase // Methods Enzymol. 2006. Vol. 410. P. 342-59.
 Локализация районов XL хромосомы ассоциированных с ламином в трофоцитах малярийных комаров | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).

Локализация районов XL хромосомы ассоциированных с ламином в трофоцитах малярийных комаров | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).