Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах человека после воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в зависимости от уровня активных форм кислорода | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).

Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах человека после воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в зависимости от уровня активных форм кислорода

В ранее проведенных нами исследованиях на лимфоцитах периферической крови человека был обнаружен феномен сниженной эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в ответ на воздействие импульсно-периодическим рентгеновским излучением в малых дозах. Одним из объяснений наблюдаемого феномена может являться наличие в клетке порога активации систем антиокислительной защиты и систем репарации радиационно-индуцированных двуните-вых разрывов ДНК, достижение которого является необходимым условием для запуска и эффективного функционирования систем репарации. В связи с этим для анализа влияния уровня активных форм кислорода на эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК был проведен эксперимент по оценке уровня фокусов белка yH2AX после воздействия импульсно-периодическим рентгеновским излучением на лимфоциты периферической крови человека, необработанные и предварительно обработанные 10 мкМ H2O2. Было установлено, что добавление 10 мкМ H2O2 незначительно повышает уровень фокусов белка yH2AX, но не влияет на радиочувствительность клеток. Также не было обнаружено значимых различий между долями репарированных двунитевых разрывов ДНК в предварительно обработанных и необработанных 10 мкМ H2O2 лимфоцитах. В связи с высокой вариабельностью результатов между донорами можно предположить, что эффекты воздействия зависят от индивидуальных особенностей.

Effectiveness of DNA double strand break repair in human lymphocytes exposed to pulsed X-rays depending on reactive oxyg.pdf Введение Человек постоянно подвергается воздействию ионизирующего излучения как от естественных, так и от искусственных источников. Влияние радиации в высоких дозах является сравнительно изученным, в то время как в диапазоне малых доз отмечаются эффекты, механизм которых остается не ясным. Ранее была обнаружена нелинейная зависимость количества радиационно-ин-дуцированных фокусов белков репарации двунитевых разрывов ДНК yH2AX и 53BP1 от дозы импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ). Это выражалось в отклонении от линейности в сторону повышения эффекта в диапазоне 12-32 мГр и снижении эффекта относительно ожидаемого при дальнейшем увеличении дозовой нагрузки до 72 мГр и выше [1, 2]. При этом наблюдалась замедленная динамика исчезновения радиационно-индуцирован-ных фокусов, образованных после воздействия ИПРИ в дозах, вызывающих отклонения от линейной дозовой зависимости. Подобные результаты были обнаружены и в других исследованиях, направленных на оценку уровня разрывов ДНК в клетках. В частности, отмечалась нелинейная зависимость количества фокусов yH2AX и 53BP1 в фибробластах человека от дозы ионизирующего излучения в диапазоне 10-50 мГр [3]. Сходная гиперчувствительность к воздействию радиации в дозах менее 50 мГр была обнаружена в клетках V79-4 при использовании фокусов yH2AX [4]. Кроме того, в лимфоцитах периферической крови после воздействия рентгеновскими лучами была обнаружена повышенная радиочувствительность в области малых доз [5]. Таким образом, в диапазоне доз 1-50 мГр наблюдались отклонения от линейной дозовой зависимости уровня двунитевых разрывов ДНК в различных типах клеток в условиях in vitro и in vivo. Рабочей гипотезой, проверенной в настоящем исследовании, являлось предположение об обусловленности гиперчувствительности клеток к воздействию ионизирующего излучения в малых дозах наличием в клетке порога включения систем антиокислительной защиты и репарации радиацион-но-индуцированных двунитевых разрывов ДНК. Переменной, оцениваемой этим порогом, может быть либо уровень окислительного стресса, либо число окислительных повреждений ДНК. Интересно, что сами радиационно-индуцированные двунитевые разрывы ДНК, по крайней мере до определенного предела, по-видимому, не являются триггером для осуществления их эффективной репарации [6]. Таким образом, гиперчувствительность клеток в диапазоне сверхмалых доз радиации может быть связана с включением ан-тиоксидантных систем и / или систем эффективной репарации повреждений только при уровнях окислительного стресса / окислительных повреждений ДНК, характерных для воздействия более высоких доз ионизирующего излучения. Это приводит к повышенному уровню радиационно-индуцирован-ных повреждений ДНК при воздействии радиации в диапазоне 10-30 мГр в условиях недостаточной активности систем антиоксидантной защиты и эффективной репарации двунитевых разрывов ДНК. Поэтому целью настоящего исследования являлся анализ влияния экзогенного окислительного стресса на эффективность репарации радиационно-индуцированных двуни-тевых разрывов ДНК. Материалы и методики исследования Материалом для исследования послужили лимфоциты периферической крови трех здоровых индивидов: 2 мужчин (28 и 24 лет) и 1 женщины (22 года). Забор крови из локтевой вены осуществляли в вакуумные пробирки типа Vacutainer (BD Bioscience, США), покрытые изнутри натриевой солью гепарина для предотвращения свертывания. Выделение лимфоцитов осуществляли посредством центрифугирования крови в градиенте Фиколл-урографина (р = 1,077) («ПанЭко», Россия). Полученную суспензию разводили до концентрации 3*106 клеток/мл в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США). Затем суспензию делили на две части, в одну из которых добавляли 10 мкМ Н2О2 и выдерживали 30 мин при температуре +4°С. Далее каждую из частей разливали по 2 мл в пластиковые центрифужные пробирки (Greiner, США), пять из которых подверглись воздействию ионизирующего излучения в разных дозах, а одна оставалась в качестве контроля. Транспортировка образцов до места облучения производилась на льду. В исследованиях использовался источник импульсно-периодического рентгеновского излучения «СИНУС-150» (Россия) (ускоряющее напряжение 260 кВ, сила тока 4 кА, энергия фотонов с максимумом 90-100 кэВ, длительность импульса 4 нс), разработанный в Институте сильноточной электроники СО РАН. Для достижения необходимой дозы облучения пробирки с культурой клеток размещались на определенном расстоянии от анода ускорителя. Измерения доз производились с использованием термолюминесцентного дозиметра «КДТ-02М» (Россия) и электростатического дозиметра с кварцевым волокном серии «Arrow-Tech», модель 138-S (США). Облучение лимфоцитов проводилось до 4 000 импульсов в дозах 0,003; 0,008; 0,018; 0,04 и 0,08 мГр/имп. при частоте повторения импульсов 13 имп./с. Для оценки динамики формирования радиационно-индуцированных фокусов гистона yH2AX, являющихся наиболее чувствительным маркером двунитевых разрывов ДНК, клетки инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин и 18 ч после облучения. После инкубации переносили по 1 мл суспензии в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали 5 мин при 200 g 4°С, удаляли надосадочную жидкость и добавляли раствор фосфатного буфера (PBS). Проводили повторное центрифугирование в тех же условиях. Оставляли по 60 мкл клеточной суспензии, которую наносили на предметные стекла, покрытые полилизином (Menzel, Германия). Препараты накрывали покровным стеклом и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Через 10 мин снимали покровные стекла и фиксировали препараты в 3%-ном растворе параформальдегида (Sigma, США) в течение 20 мин при 4°С. При проведении процедуры иммуноокрашивания в качестве первичных антител были использованы моноклональные мышиные антитела к белку yH2AX (Novus, США). Вторичными антителами, несущими флуорохром, выступали кроличьи антитела, конъюгированные с родамином (Novus, США). На препараты раскапывали по 50 мкл 3%-ного раствора FBS с первичными антителами в концентрации 1:1 000 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в трех сменах PBS по 5 мин повторяли инкубацию со вторичными антителами в той же концентрации. Отмывали препараты в трех сменах PBS по 5 мин и окрашивали 0,3 мкМ раствором DAPI (Sigma, США). Для защиты препаратов от выцветания раскапывали на стекла заключающую среду Vectashield (Vector Labs, США), накрывали покровным стеклом и хранили в темноте до начала микроскопирования при 4°С. Визуализация и анализ флуоресцентных сигналов осуществлялись на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) с использованием системы для автоматического анализа цитогенетических препаратов Metafer (Metasystems, Германия). На каждом препарате производилась оценка количества фокусов белка yH2AX в 300 клетках. Эксперимент был проведен в 3 повторах. Оценка уровня фокусов белка yH2AX проводилась с использованием многофакторного анализа (ANOVA) с поправкой на множественность сравнений. Все статистические процедуры были проведены с помощью программного обеспечения StatSoft STATISTICA 8.0. Результаты исследования и обсуждение Уровень фокусов yH2AX был статистически значимо выше по сравнению с контролем через 30 мин после воздействия ИПРИ в дозах 160 и 320 мГр. Меньшие дозы ИПРИ (12-32 мГр) также приводили к повышению уровня фокусов yH2AX, однако значимых отличий с контролем не было обнаружено. При этом не было обнаружено значимых отличий между уровнем фокусов yH2AX в необработанных и предварительно обработанных 10 мкМ Н2О2 лимфоцитах. Чтобы выявить количество фокусов yH2AX, образованных в результате воздействия непосредственно облучения, а не дополнительного окислительного стресса, от каждого результата был вычтен контроль. Таким образом, были получены дозовые зависимости радиационно-индуцирован-ных фокусов белка yH2AX, которые также не различались значимо как в необработанных, так и в предварительно обработанных 10 мкМ Н2О2 лимфоцитах (рис. 1). Это указывает на то, что дополнительный экзогенный окислительный стресс не способствует повышению уровня радиационно-инду-цированных фокусов, т.е. не влияет на радиочувствительность клеток. После воздействия ИПРИ на временном отрезке между 30 мин и 18 ч после облучения без добавления 10 мкМ Н2О2 количество фокусов значимо снижается при воздействии в дозах 160 и 320 мГр, а на фоне Н2О2 - в диапазоне доз 72-320 мГр (p < 0,01) (рис. 1). Это свидетельствует о нормально протекающей репарации двунитевых разрывов ДНК. Кроме того, была оценена доля остаточных фокусов через 18 ч после облучения относительно 30 мин после воздействия ИПРИ, и у двух из трех принимавших участие в эксперименте доноров отмечено повышение количества фокусов белка yH2AX через 18 ч после воздействия ИПРИ в дозе 12 мГр в предварительно необработанных H2O2 клетках (с 0,53 и 0,51 до 0,64 и 0,80 фокусов на клетку соответственно). Это может быть обусловлено индивидуальными различиями между донорами. 0,5 30 мин У Jl X* **/ / 100 200 300 Доза, мГр m 5>° ш А 8 4,5 £ & |Ч0 IS? 3,5 я - о S я if а Я-8-л 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 о 0,5 £ Ч >0,0 -*1 I s 18ч ^ ш* ♦ 100 200 300 Доза, мГр 5,0 0 2 Si га — о л I о 2,0 И*1-5 1 n X 1 П Ф Т.и г • " " 3,5 3,0 ш о х' %< ™ м X ■§■ ч > 0,0 ' I s r£d 400 400 - Без Н-,Оу 10 мкМ Н20-) Без НчО? 10 мкМ Н,0, Рис. 1. Уровень фокусов белка yH2AX без добавления Н2О2 и при добавлении 10 мкМ Н2О2 в лимфоцитах периферической крови человека (n = 3) через 30 мин и 18 ч после воздействия импульсно-периодическим рентгеновским излучением в малых дозах. Данные представлены в виде средних арифметических ± стандартная ошибка: А - без вычета контрольных значений; Б - за вычетом контрольных значений Недавно была высказана гипотеза, предполагающая, что запуск и протекание репарации двунитевых разрывов ДНК после воздействия радиации зависят от присутствия либо окислительного стресса, либо однонитевых разрывов ДНК. Это было подтверждено в исследовании влияния малых доз ионизирующего излучения на динамику репарации двунитевых разрывов ДНК в фибробластах человека [6]. Репарация двунитевых разрывов ДНК (оцененная как возникновение и исчезновение радиационно-индуцирован-ных фокусов yH2AX) была затруднена при воздействии радиации в дозах менее 10 мГр. После воздействия ионизирующего излучения в дозе 2,5 мГр клетки вообще не смогли репарировать двунитевые разрывы ДНК вплоть до 72 ч после воздействия. Интересно, что при обработке клеток 10 мкМ H2O2 перед воздействием радиации в клетках наблюдалась полная репарация всех радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК. Авторы делают вывод о том, что окислительного стресса после воздействия малых доз радиации недостаточно для запуска сигнальных путей, приводящих к репарации двунитевых разрывов ДНК [6]. Обработка клеток H2O2 вызывает значительное повышение окислительного стресса и количества однонитевых разрывов ДНК, что, видимо, приводит в том числе и к запуску процессов репарации двунитевых разрывов ДНК. Наши данные частично противоречат результатам, полученным в эксперименте на фибробластах человека [6]. Как и в ранее проведенных нами исследованиях, была установлена сниженная эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК после воздействия непрерывным у-излучением в малых дозах. Также было показано, что предварительно обработанные 10 мкМ Н2О2 клетки репарировали все двунитевые разрывы ДНК. Это объяснялось тем, что добавление 10 мкМ Н2О2 ведет к повышению уровня активных форм кислорода, активируя определенный пороговый механизм запуска репарации двунитевых разрывов ДНК. Напротив, в настоящем исследовании не было обнаружено никакого модифицирующего влияния Н2О2 на эффективность репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК. Данная несогласованность между полученными результатами может быть обусловлена использованием различных способов облучения (ИПРИ и непрерывное у-излучение), типа клеток (лимфоциты и фибробласты человека), а также разными условиями проведения эксперимента. Кроме того, в настоящем исследовании была обнаружена высокая вариабельность эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК после воздействия ИПРИ в дозе 12 мГр. В связи с этим можно предположить, что эффекты воздействия зависят от индивидуальных особенностей доноров, поэтому в дальнейшем необходимо провести детальный анализ межиндивидуальных отличий эффективности репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК в клетках человека. Заключение Не было обнаружено значимого влияния дополнительного экзогенного окислительного стресса на эффективность репарации радиационно-индуци-рованных двунитевых разрывов после воздействия импульсно-периодиче-ского рентгеновского излучения в малых дозах.

Ключевые слова

low dose ionizing radiation, reactive oxygen species, hydrogen peroxide, DNA double strand break, pulsed X-rays, малые дозы ионизирующего излучения, активные формы кислорода, перекись водорода, дву-нитевые разрывы ДНК, импульсно-периодическое рентгеновское излучение

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Ростов Владислав ВладимировичИнститут сильноточной электроники Сибирского отделения Российской академии наук (г. Томск); Томский государственный университетдоктор физико-математических наук, зав. отделом физической электроники; профессор кафедры физики плазмыrostov@lfe.hcei.tsc.ru
Лебедев Игорь НиколаевичНаучно-исследовательский институт медицинской генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск)доктор биологических наук, руководитель лаборатории цитогенетикиigor.lebedev@medgenetics.ru
Скрябин Николай АлексеевичНаучно-исследовательский институт медицинской генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск)кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории цитогенетикиnukulay@gmail.com
Большаков Михаил АлексеевичТомский государственный университет; Институт сильноточной электроники Сибирского отделения Российской академии наук (г. Томск)доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры физиологии человека и животных Биологического института; с.н.с. отдела физической электроникиmbol@ngs.ru
Кутенков Олег ПетровичИнститут сильноточной электроники Сибирского отделения Российской академии наук (г. Томск)ведущий инженер-электроник отдела физической электроникиKutenkov@lfe.hcei.tsc.ru
Беленко Андрей АлександровичТомский государственный университетаспирант кафедры физиологии человека и животных Биологического институтаgreyden@sibmail.com
Кравченко Кристина АлександровнаТомский государственный университетстудент кафедры цитологии и генетики Биологического институтаtika_ home@mail.ru
Уразова Арина СергеевнаТомский государственный университетстудент кафедры цитологии и генетики Биологического институтаarinasoulmate@mail.ru
Васильев Станислав АнатольевичНаучно-исследовательский институт медицинской генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск)кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории цитогенетикиstas.vasilyev@gmail.com
Всего: 9

Ссылки

Grudzenski S., Raths A., Conrad S. et al. Inducible response required for repair of low-dose radiation damage in human fibroblasts // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2010. Vol. 107, № 32. P. 14205-14210.
Beels L., Werbrouck J., ThierensH. Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation // International Journal of Radiation Biology. 2010. Vol. 86, № 9. P. 760-768.
Leatherbarrow E.L., Harper J.V., Cucinotta F.A., O'Neill P. Induction and quantification of gamma-H2AX foci following low and high LET-irradiation // International Journal of Radiation Biology. 2006. Vol. 82, № 2. P. 111-118.
Markova E., Schultz N., Belyaev I.Y. Kinetics and dose-response of residual 53BP1/gamma- H2AX foci: co-localization, relationship with DSB repair and clonogenic survival // International Journal of Radiation Biology. 2007. Vol. 83, № 5. P. 319-329.
Васильев С.А., Беленко А.А., Кутенков О.П. и др. Различия эффектов импульсно-периодического рентгеновского излучения в опухолевых клетках линии MOLT-4 и лимфоцитах периферической крови человека // Сибирский онкологический журнал. 2013. № 2. С. 45-49.
Васильев С.А., Степанова Е.Ю., Кутенков О.П. и др. Двунитевые разрывы ДНК в лимфоцитах человека после однократного воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в малых дозах: нелинейная дозовая зависимость // Радиационная биология. Радиоэкология. 2012. Т. 52, № 1. С. 31-38.
 Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах человека после воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в зависимости от уровня активных форм кислорода | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).

Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах человека после воздействия импульсно-периодического рентгеновского излучения в зависимости от уровня активных форм кислорода | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2013. № 4 (24).