ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНОЙ НЕЙРОНАЛЬНОЙМАТРИЦЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙСПИНАЛЬНОЙ ТРАВМЫ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2012. № 1 (40).

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНОЙ НЕЙРОНАЛЬНОЙМАТРИЦЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙСПИНАЛЬНОЙ ТРАВМЫ

Цель работы - показать процессы пролиферации и дифференцировки эмбриональных стволовых клетокв нейрональном направлении на коллаген-хитозановой матрице в присутствии искусственной кондициониро-ванной нейрональной питательной среды и факторов нейрональной дифференцировки, продемонстрироватьпрактическое использование специализированных подложек для биоинженерии спинного мозга при экспери-ментальной спинальной травме у крыс путем прямой трансплантации в зону разрыва.

USING NEURONAL POLYSSACHARIDE MATRIXIN THE TREATMENT OF EXPERIMENTAL SPINAL CORD INJURY.pdf ВВЕДЕНИЕПри решении вопросов первичной хирур-гической обработки осложненной позвоночно-спинальной травмы, как правило, не ставятсязадачи реконструкции спинного мозга (СМ),выполняется операция на позвонках и реша-ются задачи стабилизации позвоночника отно-сительно спинного мозга. За последнее времянакоплены важные экспериментальные данныеи ограниченный клинический материал, свиде-тельствующие о принципиальной возможностирегенерации в центральной нервной системе(ЦНС) и восстановлении ее нарушенной функ-ции [1-3]. Полученные научные факты позволя-ют с современных позиций предложить новыестратегии и концепции лечения поврежденийСМ [4]. Основным инструментом регенератор-ной медицины являются различные клеточныетехнологии - от трансплантации клеток в ме-сто травмы после оперативного доступа черезкостные элементы позвоночника и обнаженияспинного мозга (клеточная терапия) до тканевойинженерии.Большаков И. Н., Еремеев А. В., Светлаков А. В., Шеина Ю. И., и др.35Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 1 (40) март2012Экспериментальная хирургияВ экспериментах на крысах пересадка шван-новских клеток крысам в спинной мозг, при ча-стичной его перерезке, может сопровождатьсязначительным восстановлением функции ЦНСс демонстрацией не только обширной регене-рации спинномозговых аксонов ростральнееи каудальнее зоны повреждения, но и ограни-ченного спрутинга аксонов в каудальный конецтрансплантата [5-7]. При этом частично вос-станавливается функция конечностей [8]. Расту-щие аксоны при использовании эмбриональноготрансплантата регенерировали с формировани-ем связей. Применение трансплантации эмбри-ональных стволовых клеток (ЭСК) на моделиспинальной травмы показало способность этихклеток встраиваться в поврежденные участкиСМ, дифференцироваться согласно молеку-лярному и клеточному микроокружению, бытьдлительно жизнеспособными [9]. При этомобразующиеся из ЭСК олигодендроциты у по-ловозрелых крыс подвергаются миелинизациив области аксонов. Аксональный рост может со-провождаться прорастанием через глиальный ру-бец в области хирургического пересечения СМ.Ожидаемые морфологические изменения в СМсопровождаются частичным снижением нейро-дефицита. Пересадка эмбриональной клеточноймассы головного или спинного мозга от крыс иличеловека в разрыв спинного мозга новорожден-ным или взрослым крысам приводит в ранниесроки после травмы (до 7 сут.) к приживлениюи спрутингу пересаженных нейронов, трансля-ции клеток нейроглии в каудальном направленииза пределы зоны повреждения [10, 11]. В зонетравмы СМ трансплантированная ткань актив-но интегрирует с тканью реципиента [12]. Этоподтверждается на модели полной перерезкиСМ у новорожденной крысы. Трансплантацияэмбриональных клеток в зону перерезки СМулучшает его функциональные характеристикипо сравнению с контролем [13].Несмотря на успехи клеточной трансплантоло-гии при реконструкции СМ, использование диф-ференцированных в нейрональном направленииклеток недостаточно эффективно по причине ихнизкой массы, непродолжительной жизнеспособ-ности, большой потери при трансляции с подло-жек в дислокацию травмы. Совершенно очевидно,что процесс инжиниринга поддерживается ком-плексом молекулярного микроокружения, созда-ваемого клетками СМ, в основе которого лежитвзаимодействие нейротрофических факторов.Предлагаемые в настоящей работе подходык реконструкции СМ при экспериментальнойосложненной позвоночно-спинальной травмеоснованы на использовании современных био-деградируемых полисахаридных матриц, содер-жащих необходимое микроокружение, включаяпродукты роста и дифференцировки стволо-вых и нейрональных клеток, предшественникинейрональных клеток с целью восстановлениямоторной и сенсорной функций ЦНС. Имплан-тация такой матрицы может быть осуществленаоткрытым оперативным способом в диастаз СМ.Цель исследования - получение клеточнойбелково-полисахаридной губчатой матрицы, со-держащей нейрональное микроокружение дляпрямой трансплантации нейрональных предше-ственников стволовых клеток в модели спиналь-ной травмы у крыс, анализ специфических моле-кулярных маркеров.Задачи исследования:1. Получить белково-полисахаридную матри-цу с нейрональным микроокружением.2. Провести культивирование и дифферен-цировку эмбриональных стволовых клеток крыс,а также имуноцитохимический контроль диффе-ренцировки.3. Выполнить спинальную травму у крыс,прямую трансплантацию матриц в диастаз СМс обеспечением послеоперационного веденияживотных.4. Осуществить динамический неврологиче-ский контроль животных в течение 4 недель.5. Провести иммуноцито-гистохимическийи гистологический анализы СМ в зоне импланта-ции нейрональной матрицы.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ1. Получение матрицы с нейрональныммикроокружением. Для создания нейрональ-ных матриц был использован базовый полии-онный гелевый комплекс, состоящий из нано-микроструктурированного аскорбата хитозанас молекулярной массой 695 kDa и степенью де-зацетилирования 98 % при содержании на 1 гсухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г,включающий солевые анионные формы хондрои-тинсерной (200 мг/г), гиалуроновой (100 мг/г)кислот и гепарина (5 мг/г), сывороточного фак-тора роста крупного рогатого скота «адгелон»(110 мкг/г).В экспериментах по получению кондициони-рованной среды от стволовых эмбриональныхнейрональных клеток мыши (клетки из головно-го мозга 17-20-дневных фетусов белых мышей36№ 1 (40) март2012 Вопросы реконструктивной и пластической хирургииБольшаков И. Н., Еремеев А. В., Светлаков А. В., Шеина Ю. И., и др.после его диспергирования и обработки 0,5 %раствором коллагеназы в течение 30 мин в средеДМЕМ при 37 °С) для наращивания клеточнойбиомассы использовали среду ДМЕМ с добавле-нием 10 % эмбриональной телячьей сыворотки(ЭТС), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМL-глутамина, в которую дополнительно добавля-ли еще 4нг/мл основного фактора роста фибро-бластов (bFGF), 1 мМ раствора незаменимыхаминокислот (Sigma-Aldrich). Наращивание кле-точной биомассы при 37 °С проводили во флако-нах, покрытых 0,1 % раствором желатина. Сборсреды проводили ежедневно. После пересевас помощью 0,5 % раствора коллагеназы клетокна матрицы их культивировали в среде с добав-лением агента нейрональной дифференцировки(N2-компонента) согласно инструкции произ-водителя. Среду собирали, фильтровали через0,22 мкм ацетат-целлюлозный фильтр, отделяя ееот клеток, и в дальнейшем использовали в каче-стве кондиционированной среды. В частности,кондиционированную среду добавляли в полии-онный хитозановый гель.В дальнейшем осуществляли ковалентноесоединение полученной хитозановой полисаха-ридной гелевой конструкции с бычьим колла-геновым гелем в соотношении 1:3, лиофильноевысушивание глубоко замороженных образцовв установке FC500. Далее продукт упаковывалии стерилизовали электронно-лучевым способом(«Медицинская компания ООО «Коллахит»г. Железногорска Красноярского края, ген. ди-ректор предприятия А. Н. Сапожников).Было предположено, что культивирование наколлаген-хитозановых матрицах ЭСК крысы придобавлении в полную питательную среду факто-ра N2 или B27 (нейрональная добавка), а такжеретиноевой кислоты может приводить к их ней-рональной дифференцировке.2. Культивирование и дифференцировкаэмбриональных стволовых клеток. Маркер-ный анализ. Суспензию клеток в среде со всемикомпонентами осторожно сверху наслаивали нагубчатые матрицы после их предварительнойнейтрализации в стерильном бикарбонатномбуфере и трехкратной отмывки фосфатным бу-фером Дульбекко (Биолот). Эмбриональныестволовые клетки (ЭСК) получали из бластоцистпутем их вымывания из матки средой DMEM нар-котизированного эфиром животного на 4-5-йдень после копуляции. Получение внутреннейклеточной массы (ВКМ) и дальнейшую экспан-сию колоний ЭСК проводили согласно протоко-лу [14, 15]. В экспериментах по культивированиюплюрипотентных клеток на раневых покрытияхпервоначально для наращивания биомассы ис-пользовали основную среду коДМЕМ с добавле-нием 10 % SR (заменитель сыворотки), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1 мМ L-глутамина,4 нг/мл основного фактора роста фибробластов(bFGF), 1 мМ раствора незаменимых аминокис-лот и ингибитора Rock киназы 5 нг/мл. Наращи-вание клеточной биомассы проводили во флако-нах, покрытых 0,1% раствором желатина. Сменусреды проводили ежедневно. Состояние колонийоценивали визуально с помощью микроскопаAxioVert 200. Для оценки поддержания состоя-ния плюрипотентности проводили иммуноцито-химический анализ экспрессии маркеров - oct4,TRA-1-60, SSEA4, cd30. Для дифференцировкиэмбриональных клеток в нейрональном направ-лении их высевали во флаконы в среду со всемидобавками, кроме bFGF, с добавлением ретиное-вой кислоты и N2 компонента.Иммуноцитохимический контроль нейрональ-ной дифференцировки стволовых клеток. Каждыетрое сут проводилась формальдегидная фикса-ция с последующей иммуноцитохимией клетокс помощью антител (все от Abcam, USA) про-тив GFAP - глиального фибриллярного кисло-го белка (маркер астроцитов), нейрофиламентаи нестина. Выявление маркеров осуществлялиметодом согласно инструкции производителяантител. Ядра клеток окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) 10 мин. Для получения изображений и ана-лиза использовали флюоресцентный микроскоп«Olympus BX-51» и программные продукты«Applied Spectral Imaging» (USA). Для анализакаждого маркера эксперимент повторяли триж-ды, наращивая по три флакона, в каждом из ко-торых случайным образом выделяли 6 зон дляпроведения иммуноцитохимии. Микроскопиро-вание проводили по каждой зоне в 30 полях зре-ния.Состав трансплантируемых матриц. В ка-честве вариантов коллаген-хитозановых кон-струкций готовили 2 различные подложки, со-держащие следующее микроокружение длянейрональных клеток:

Ключевые слова

нейрональная матрица, эмбриональная стволовая клетка, предшественники нейрональных кле- ток, экспериментальная спинальная травма, нейрональные маркеры, трансплантация, биоинженерия спинного мозга, неврологический статус, иммуноцитогистохимия, neuronal matrix, embryonal stem cell, predecessors neuronal cells, experimental spinal cord injury, neuronal markers, transplantation, bioengineering of a spinal cord, neurologic status, immuno-cyto-histochemistry

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Большаков Игорь НиколаевичГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития Россиител. 8-913-523-34-35e-mail: bol.bol@mail.ru
Еремеев А. В.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Светлаков А. В.Красноярский центр репродуктивной медицины
Шеина Ю. И.Институт общей генетики им. Вавилова РАН
Рендашкин И. В.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Полстяной А. М.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Кривопалов В. А.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Каптюк Г. И.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Карапетян А. М.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Игнатов А. В.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Медведева Н. Н.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Жуков Е. Л.ГОУ ВПО КРасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
Всего: 12

Ссылки

Kakulas B. A. Neuropathology: the foundation for new treatments in spinal cord injury // Spinal Cord. - 2004. - Vol. 42. - № 10. - P. 549-563.
Young W. Bases for Hope in Spinal Cord Injury. - URL: http://sci.rutgers.edu.
Tsai E. C., Tator C. H. Neuroprotection and regeneration strategies for spinal cord repair // Curr Pharm Des. - 2005. - Vol. 11. - № 10. - P. 1211-1222.
Tator C. H. Strategies for recovery and regeneration after brain and spinal cord injury // Inj. Prev. - 2002. - Vol. 8. - P. 33-36.
Xu X. M., Chen A., Guenard V. et al. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord // J. Neurocytol. - 1997. - Vol. 26. - P. 16.
Weider N., Blesch A., Grill R. J., Tuszynski M. H. Nerve growth factor-hypersecreting Schwann cell grafts augment and guide spinal cord axonal growth and remyelinate central nervous system axons in a phenotypically appropriate manner that correlates with expression of L1 // J. Comp. Neurol. 1999. - Vol. 413. - P. 449-506.
Menei P., Montero-Menei C., Whittemore S. R. et al. Schwann cells genetically modified to secrete human BDNF promote enhanced axonal regrowth across transected adult rat spinal cord // Eur. J. Neurosci. - 1998. - Vol. 10. - P. 607-621.
Sayers S. T., Khan N., Ahmed Y. et al. Preparation of brain-derived neurotrophic factor- and neurotrophin-3-secreting Schwann cells by infection with a retroviral vector // J. Mol. Neurosci. - 1998. - Vol. 10. - P. 143-160.
McDonald J. W., Liu X. Z., Qu Y. et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate, and promote recovery in injured rat spinal cord // Nat. Med. - 2000. - Vol. 5. - P. 1410-1412.
Diener P. S., Bregman B. S. Fetal spinal cord transplants support the development of target reaching and coordinated postural adjustments after neonatal cervical spinal cord injury // J. Neurosci. - 1998. - Vol. 18. - P. 763-776.
Das G. D. Neural transplantation in the spinal cord of adult rats. Conditions, survival, cytology and connectivity of the transplants // J. Neurol. Sci. - 1983. - Vol. 62. - P. 191-210.
Bernstein J. J., Underberger D., Hoovler D. W. Fetal CNS transplants into adult spinal cord: techniques, initial effects and caveats // Cent. Nerv. Syst. Trauma. - 1984. - Vol. 1. - P. 39-46.
Theele D. P., Schrimsher G. W., Reier P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord // Exp. Neurol. - 1996. - Vol. 142. - P. 128-143.
Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. - 1998. - Vol. 282. - № 5391. - P. 1145-1147.
Hee Sun Kima, Sun Kyung Oha, Yong Bin Parkb et al. Methods for Derivation of Human Embryonic Stem Cells // Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. - № 9. - P. 1228-1233.
Салмина А. Б., Шнайдер Н. А., Михуткина С. В. и др. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы в клетках нервной системы коррелирует с развитием постишемической когнитивной дисфункции // Международный неврологический журнал. - 2007. - Т. 1. - №11.
Еремеев А. В., Светлаков А. В., Большаков И. Н. и др. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген- хитозановой матрице // Ж. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Т. IV. - № 2. - С. 55-62.
 ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНОЙ НЕЙРОНАЛЬНОЙМАТРИЦЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙСПИНАЛЬНОЙ ТРАВМЫ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2012. № 1 (40).

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНОЙ НЕЙРОНАЛЬНОЙМАТРИЦЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙСПИНАЛЬНОЙ ТРАВМЫ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2012. № 1 (40).