ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННЫХ МАТРИКСОВ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2016. № 1 (56).

ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННЫХ МАТРИКСОВ

Цель исследования - оценить влияние внеклеточных криопротекторов на микроструктуру и состав внеклеточного матрикса (ВКМ) при перфузионной децеллюляризации целых органов. Эксперимент выполнен на 34 крысах-самцах. Установлено, что перед выполнением перфузионной децеллюляризации целесообразно подвергать орган циклу замораживания-оттаивания с предварительной перфузией 5%-м раствором трегалозы. Это способствует значительной презервации структур ВКМ при сохранении удовлетворительного качества децеллюляризации. Предложенная методика по ряду оцениваемых параметров является более эффективной, чем известные аналоги.

APPLICATION OF EXTRACELLULAR CRYOPROTECTANTS FOR OBTAINING ORGAN MATRIX.pdf ВВЕДЕНИЕ воздействия на состав, биологическую актив ность и биомеханические свойства ВКМ. Даль Дефицит донорских органов остается ос-нейшие перспективы развития данного направновной проблемой в клинической транспланто-ления нам видятся в разработке методик децеллогии. Кроме того, не до конца решен вопрос люляризации целых органов, оказывающих иммуносовместимости органов донора с орга-минимальное воздействие на химический состав низмом реципиента. Одним из перспективных и объемную структуру ВКМ, а также минимизанаправлений решения указанных проблем явля-ции побочных эффектов, вызванных заморажиется выращивание иммуносовместимых донор-ванием органокомплексов [6-8]. ских органов посредством культивирования Цель исследования: оценить влияние внеклесобственных стволовых клеток реципиента на точных криопротекторов на микроструктуру и каркасе внеклеточного матрикса (ВКМ) донор-состав внеклеточного матрикса при перфузионских органов [1, 2]. ной децеллюляризации целых органов. В тканевой инженерии ВКМ являются не только формообразующим фактором, но и кон-МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ тролируют функции клеток, стимулируют образование новых тканей [3]. При этом трехмерные Эксперимент выполнен на 34 крысах-самцах каркасы должны быть биосовместимыми, биоде-линии Long-Evans, средней массой тела (300 ± градируемыми, а также способными регулиро-± 50) г. Все животные были разделены на тривать клеточную пролиферацию, морфогенез и группы по 10 крыс в каждой. Четыре крысы осдифференцировку клеток [4, 5]. тавлены в группе контроля. Главным недостатком существующих мето-Под общей анестезией в стерильных условидов получения ВКМ являются неблагоприятные ях выполняли канюлирование нижней полой и № 1 (56) март’2016 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Новые технологии 69 воротной вен. Для предотвращения свертывания крови в сосудистую систему печени под постоянным давлением со скоростью 2 мл/мин нагнетался раствор гепарина (0,2 ЕД). Это значительно облегчало ход последующей децеллюляризации, обеспечивая ее равномерность. Печень отделяли от фиксирующего ее связочного аппарата и выделяли вместе с иссеченным сухожильным центром диафрагмы. Перфузию печени выполняли с помощью специально разработанной системы, включающей роторный насос, обеспечивающий циркуляцию по замкнутой системе трубок. Печень помещали непосредственно в емкость с децеллюляризирующим раствором, который по заборной трубке с помощью роликового насоса через воздушную ловушку поступал в канюлю, введеную в воротную вену. Проходя сквозь сосудистое русло печени, перфузат естественным путем изливался обратно в емкость через просветы нижней полой вены и общей печеной артерии. Стандартная схема перфузионной децеллюляризации включала в себя 24-часовую перфузию 1%-м раствором лаурилсульфата натрия (SDS, додецилсульфат натрия), приготовленным на основе фосфатного буфера с добавлением 0,02% ЭДТА, с частичной заменой раствора спустя 1, 8 и 16 ч. После окончания перфузии для очищения сосудистого русла органа от децеллюляризирующих агентов, литических ферментов и тканевого детрита, органокомплекс в течение 15 мин подвергался перфузии физиологическим раствором. В качестве контроля выполнена децеллюляризация двух органокомплексов по предложенной схеме без предварительного цикла замораживания-оттаивания органокомплекса, а также проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование двух свежеизъятых печеней, не подвергавшихся обработке. В первой серии экспериментов органокомплексы после изъятия из раны подвергались 30минутной перфузии фосфатным буфером для поддержания нормального кислотно-щелочного баланса. Затем органокомплексы замораживались при температуре -20 °С. Спустя 24 ч после замораживания, органокомплекс подвергался размораживанию при температуре 37 .С на водяной бане. Во второй серии экспериментов перед замораживанием органокомплексы перфузировались в течение 30 мин 10%-м раствором глицерина (проникающего криопротектора) в фосфатном буфере. Третья серия экспериментов отличалась тем, что перед заморозкой органокомплексы перфузировались в течение 30 мин 5%-м раствором трегалозы (непроникающего криопротектора) вфосфатном буфере. Во всех сериях экспериментов после размораживания выполнялась децеллюляризация по вышеописанной схеме. Субъективно результаты перфузии оценивались по специально разработанному протоколу, включающему следующие параметры: окраска органа, прозрачность ткани, степень видимости сосудистого русла, сохранность объемной структуры органа. Для объективной оценки полученных результатов выполнялось гистологическое исследование препаратов, предварительно окрашенных гематоксилином, эозином и по ВанГизону. Это позволяло оценить степень децеллюляризации и сохранность структуры элементов ВКМ. При этом учитывались наличие клеток в срезе, сохранность структуры сети матрикса, наличие его разрывов, внутритканевого отека. Для определения степени презервации функционально важных гликопротеидов ВКМ (фибронектин, эластин, ламинин) на заключительном этапе работы было выполнено ИГХ исследование. При выполнении исследований и оформлении результатов работы были учтены «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Приказом Минвуза СССР № 742 от 13.11.1984 г. РЕЗУЛЬТАТЫ При выполнении гистологического исследования препаратов крыс контрольной группы установлено, что на фоне межклеточного отека отмечались локусы удовлетворительно децеллюляризированной ткани, расположенной преимущественно у ворот печени, а также участки с клеточным детритом и отдельные островки с сохранившимися гепатоцитами. Для контроля ИГХ исследования взяты две свежеизъятые печени. Отмечены хорошая экспрессия элементов матрикса, целостность сети, отсутствие разрывов. В первой серии экспериментов перед децеллюляризацией органокомплексы подвергались циклу замораживания-оттаивания без предварительной перфузии криопротекторами. При визуальном осмотре обнаружено, что объем печени снижен, объемная структура нарушена; на поверхности долей при микроскопии выявлены повреждения (разрывы капсулы и паренхимы). Ткань печени в области ворот прозрачная, белая, в толще видны сосуды, однако дистальнее разрывов ткань печени светло-коричневая, непрозрачная, сосуды не видны, что свидетельствует о низком качестве децеллюляризации (рис. 1). Это подтверждено и результатами гистологического исследования. При микроскопии выявлены внеклеточный отек, наличие большого количества клеточного детрита и островки с гепатоцитами (рис. 2). Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 1 (56) март’2016 70 Черных А.В., Малеев Ю.В., Шевцов А.Н. и др. Рис. 1. Серия экспериментов № 1. Общий вид Рис. 2. Серия экспериментов № 1. Микрофотограпечени фия. Окраска по Ван-Гизону. Ув. 20 а б в Рис. 3. Серия экспериментов № 1. ИГХ реакция: а - на эластин (ув. 40); б - эндостатин (ув. 40); в - фиб ронектин (ув. 40) При выполнении ИГХ исследования срезов на уровне ворот печени элементы ВКМ сохранены, однако его структура нарушена: матрикс значительно разрежен, отмечаются разрывы, нарушена объемная структура, что объясняется наличием внеклеточного тканевого отека и отсутствием презервации матрикса перед замораживанием (рис. 3). Во второй серии экспериментов органокомплекс перед замораживанием перфузировали 10%-м раствором глицерина. При визуальном осмотре: ткань без разрывов, светло-коричневая, не прозрачная, сосуды не контурируются, что свидетельствует о низкой степени децеллюляризации (рис. 4). Рис. 4. Серия экспериментов № 2 При микроскопии срезов, сделанных на уровнях светло-коричневой и неизмененной ткани, на фоне интактных гепатоцитов присутствуют участки клеточного детрита, структура ВКМ сохранена, выражен межклеточный отек (рис. 5). Рис. 5. Серия экспериментов № 2. Микрофотография. Окраска по Ван-Гизону. Ув. 10 При ИГХ исследовании выявлена сниженная экспрессия гликопротеидов (рис. 6). Вероятно, при децеллюляризации ВКМ был значительно поврежден. № 1 (56) март’2016 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Новые технологии 71 аб в Рис. 6. Серия экспериментов № 2. ИГХ реакция: а - на фибронектин, гепатоциты окрашены гематоксилином (ув. 20); б - эластин (ув. 40); в - эндостатин (ув. 40) В третьей серии экспериментов перед вы-При микроскопии срезов, выполненных на полнением перфузии по стандартной схеме нескольких уровнях, установлено, что структура печень подвергалась циклу замораживания-ВКМ сохранена, отмечаются единичные микрооттаивания с предварительной перфузией 5%-м разрывы структуры матрикса. Отек не выражен раствором трегалозы. Визуально ткань печени (рис. 8). Обращает на себя внимание полное отбелая, прозрачная, однородная. В толще ткани сутствие гепатоцитов и тканевого детрита, что контурируются сосуды. Объемная структура позволяет оценить степень децеллюляризации органа сохранена (рис. 7). как хорошую. Рис. 7. Серия экспериментов № 3 Рис. 8. Серия экспериментов № 3. Микрофотография. Окраска по Ван-Гизону. Ув. 63 Степень презервации гликопротеинов, образующих ВКМ, оценивали при помощи ИГХ реакции. При визуальном сравнении с контрольным образцом установлено, что фибронектин и эндостатин сохранились (рис. 9, а, б). а б в Рис. 9. Серия экспериментов № 3. ИГХ реакция: а - на фибронектин; б - эластин; в - эндостатин. Ув. 40 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 1 (56) март’2016 72 Черных А.В., Малеев Ю.В., Шевцов А.Н. и др. Эластин при ИГХ исследовании обнаружен в гораздо меньших количествах, чем в контрольном образце, однако нарушения трехмерной структуры образуемой им сети не выявлено (рис. 9, в). ОБСУЖДЕНИЕ На наш взгляд, факт наличия большого количества клеточного детрита и островков с гепатоцитами в образцах первой серии обусловлен тем, что децеллюляризирующий раствор не попадает на периферию долей печени из-за нарушения целостности сосудов в области повреждений ткани печени. Низкая степень децеллюляризации во второй серии эксперимента предположительно объясняется защитным действием глицерина на клетки образца на стадии замораживания; для компенсации этого может потребоваться пролонгирование перфузии децеллюляризирующим агентом. С целью подтверждения гипотезы, вне рамок эксперимента, перфузия была продолжена до 36 ч от начала опыта. Полученные результаты в целом повторяют результаты третьей серии эксперимента, что свидетельствует о положительном влиянии на результаты децеллюляризации предварительной перфузии органокомплекса любыми криопротекторами. Тем не менее, основываясь на результатах эксперимента, можно утверждать, что преддецеллюляризационная перфузия раствором непроникающего криопротектора (трегалозы) увеличивает скорость децеллюляризации примерно в 1,5 раза по сравнению с методикой, в которой используется проникающий криопротектор (глицерин). Это объясняется различиями в механизмах действия внеклеточных (непроникающих) и внутриклеточных (проникающих) криопротекторов. Внутриклеточныекриопротекторы, проникая сквозь клеточную мембрану, образуют водородные связи с молекулами воды, препятствуя как вне-, так и внутриклеточному формированию кристаллов льда. Внеклеточные криопротекторы действуют только в межклеточном пространстве, не предохраняя клетки от образования внутриклеточного льда, что обеспечивает более быструю децеллюляризацию. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработана и применена на практике оценка результатов децеллюляризации, позволяющая определить качество получаемых в лабораторных условиях ВКМ каркасов. Установлено, что предварительная заморозка органокомплекса, перфузированного раствором криопротектора, положительно влияет на результаты децеллюляризации. При этом преддецеллюляризационная перфузия внеклеточными криопротекторами сокращает время последующей перфузии примерно в 1,5 раза. Предложен способ перфузионной децеллюляризации печени крыс, основанный на использовании в качестве действующего агента 1%-го раствора додецилсульфата натрия с предварительной заморозкой органа, перфузированного 5%-м раствором трегалозы. Предложенная методика по ряду оцениваемых параметров является более эффективной, чем известные аналоги, позволяя в короткие сроки получать качественные внеклеточные матричные каркасы с максимальной презервацией матричных гликопротеидов.

Ключевые слова

тканевая инженерия, печень, внеклеточный матрикс, децеллюляризация, замораживание, криопротекторы, tissue engineering, liver, extracellular matrix, decellularization, freezing, cryoprotective agents

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Черных Александр ВасильевичГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко»
Малеев Юрий ВалентиновичГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко»
Шевцов Артём НиколаевичГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко»тел.: +7 (920) 456-20-51shan-87@yandex.ru
Пульвер Александр ЮрьевичООО «Институт биологии старения»
Лейбович Борис ЕфимовичНУЗ «Дорожная областная клиническая больница на станции “Воронеж-1”»
Всего: 5

Ссылки

Griffith L.G., Naughton G. Tissue engineering - current challenges and expanding opportunities // Science. - 2002. - № 295. - P. 1009-1023.
Langer R. Perspectives and challenges in tissue engineering and regenerative medicine // Adv. Mater. - № 21. - 2009. - P. 3235-3241.
Badylak S.F., Freytes D.O., Gilbert T.W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function // Acta Biomater. - 2009. - № 5. - P. 1-13.
Giancotti F.G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression // Curr. Opin. Cell. Biol. - 1997. № 9. - P. 691-700.
Giancotti F.G., Ruoslahti E. Integrin signaling // Science. 1999. - № 285. - P. 1028-1032.
Ott H.C. [et al.] Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart // Nat. Med. - 2008. - № 14. - P. 213-234.
Ott H.C. [et al.] Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung // Nat. Med. - 2008. - № 16. - P. 927-933.
Petersen T.H. [et al.] Tissue-engineered lungs for in vivo implantation // Science. - № 329. - P. 538-541.
 ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННЫХ МАТРИКСОВ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2016. № 1 (56).

ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННЫХ МАТРИКСОВ | Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2016. № 1 (56).