Влияние импульсно-периодическогорентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах | Вестн. Том. гос. ун-та. 2010. № 333.

Влияние импульсно-периодическогорентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах

Исследовано влияние импульсно-периодического рентгеновского (частота повторения 8-25 имп./с, доза в импульсе от 0,003 до 0,02 мГр) и микроволнового (частота повторения 8-25 имп./с, пиковая плотность потока мощности от 120 до 1520 Вт/см) излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах мышей с использованием флуоресцентного зонда 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетата. Характер и величина эффекта зависят от интенсивности/дозы воздействия и от частоты повторения импульсов. При использованных режимах воздействия импульсно-периодическое микроволновое излучение проявляет более выраженное влияние на изменение уровня перекисей по сравнению с импульсно-периодическим рентгеновским излучением.

Repetitive pulsed x-rayand microwaves effect on peroxide level in isolated hepatocytes.pdf В живых организмах в результате окислительно-восстановительных реакций постоянно происходит генерация активных форм кислорода (АФК), которые, обладая высокой реакционной способностью, могут вызывать окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов и нуклеиновых кислот [1, 2]. Внутри-клеточная продукция и элиминация АФК обеспечивает развитие деструктивных процессов и выполняет важ-ную сигнальную функцию в организме [3, 4]. Ранее высказывалось предположение о том, что одним из механизмов реализации эффектов биологического дей-ствия импульсно-периодических микроволнового (ИПМИ) и рентгеновского (ИПРИ) излучений может быть модуляция уровня активных форм кислорода в тканях, о чем свидетельствовало изменение уровня супероксид-аниона кислорода в клетках в течение пер-вого часа после воздействия [5, 6]. Известно, что в ре-зультате дисмутации супероксид-аниона образуется пероксид водорода, который является более стабиль-ной активной формой кислорода [7-10]. Внутрикле-точный уровень перекисей можно определять с исполь-зованием флуоресцентного зонда 2,7-дихлорфлуорес-цеиндиацетата (ДХФДА), который способен проникать в клетки в виде ацетилового эфира. В цитоплазме зонд деэстерифицируется под действием внутриклеточных эстераз, и это исключает возможность его выхода из клеток. Дихлорфлуоресцеин (ДХФ) способен флуорес-цировать при взаимодействии с АФК преимущественно с гидропероксидами и, главным образом, гидроперок-сидом водорода [11], что позволяет оценивать содер-жание этих АФК флуориметрически.В настоящей работе с помощью флуоресцентного зонда ДХФДА исследовано модулирующее влияние импульсно-периодических микроволнового (ИПМИ) и рентгеновского (ИПРИ) излучений на уровень переки-сей в изолированных гепатоцитах мышей.Методика исследованияГепатоциты мышей выделялись общепринятым ме-тодом [12] с соблюдением всех правил и рекомендаций гуманного обращения с животными [13]. Клетки по-мещали в ДМЕМ/F-12 среду (без глутамина и феноло-вого красного) и промывали трехкратно с использова-нием низкоскоростного центрифугирования (60 g).Жизнеспособность клеток, определенная с использова-нием теста с трипановым синим, составляла 85-95% во всех экспериментах.Изолированные гепатоциты (0,2 мл суспензии, со-держащей 1Ч106 клеток/мл) нагружались 2,7-дихлор-флуоресцеиндиацетатом (ДХФДА, «Sigma-Aldrich») при инкубировании с 5 мкМ зонда в течение 30 мин в СО2-инкубаторе. После этого клетки трижды отмыва-лись в ДМЕМ/F-12 среде, затем подвергались воздей-ствию 4000 импульсов ИПМИ или ИПРИ с частота-ми повторения 8-25 имп./с.В качестве источника ИПРИ использовался ускори-тель Синус-150 (Россия, длительность импульса на по-лувысоте 4 нс, ускоряющее напряжение 300 кВ, ток электронного пучка 2,5 кА, спектр энергии фотонов с максимумом 100 кЭв). Источником ИПМИ служил ла-бораторный генератор на основе магнетрона МИ-505 (несущая частота 10 ГГц, длительность импульсов 100 нс, пиковая мощность генератора до 180 кВт). Ру-порная антенна обеспечивала однородное распределе-ние СВЧ-полей на объекте с регулируемым импульс-ным потоком мощности в диапазоне 120-1520 Вт/см2.Интенсивность флуоресценции внутриклеточного зонда измерялась с помощью Rotor Gene 6000 фирмы «Corbett Reseurch» (Австралия) при длинах волн воз-буждения 470 нм и эмиссии 510 нм через 30 мин после облучения ИПМИ или ИПРИ. Для проверки состояния антиоксидантной системы в облученные образцы до-бавлялся прооксидант (0,5 мМ Н2О2), затем проводи-лось повторное измерение интенсивности флуоресцен-ции. При обработке данных интенсивности флуорес-ценции облученных образцов выражались в относи-тельных единицах по отношению к флуоресценции ложнооблученных образцов (ЛО), принимавшихся за единицу. Полученные данные усреднялись по 6 по-вторностям рассчитанного показателя для каждого из исследованных режимов воздействия. Значимость раз-личий между сравниваемыми выборками оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни.Результаты исследованияВлияние ИПРИ на содержание пероксида водорода в гепатоцитах. Полученные результаты показывают, что однократное воздействие 4000 импульсов ИПРИ на161изолированные гепатоциты мышей изменяет уровень внутриклеточных перекисей, о чем свидетельствуетизменение интенсивности флуоресценции ДХФ (рис. 1, а).1,50,5-^0,003 мГр/имп.-♦ -0,011 мГр/имп. - 0,02 мГр/имп. *W*Wf'-тшгтштщ/-'.*1013161925Частота повторения, имп./с0,003 мГр/имп. ■0,011 мГр/имп. -0,02 мГр/имп.1013161925Частота повторения, имп./сРис. 1. Влияние разных доз ИПРИ: а - на интенсивность флуоресценции ДХФ в изолированных гепатоцитах мышейв зависимости от частоты повторения импульсов; б - на интенсивность стимулируемой Н2О2 (0,5 мМ) флуоресценции гепатоцитов,нагруженных ДХФДА. * Различия по отношению к ЛО образцам статистически значимы, р ≤ 0,05Влияние ИПРИ с разными частотами повторения импульсов имеет разный характер и зависит от дозы. Из всех использованных режимов облучения ИПРИ наиболее эффективными оказались воздействия с до-зами 0,011 и 0,02 мГр/имп. При сравнительном анализе полученных результатов выяснилось, что облучение в дозе менее 0,011 мГр/имп. при всех использованных частотах повторения импульсов значимо не отличается от интенсивности флуоресценции внутриклеточного зонда ЛО образцов. Увеличение дозы ИПРИ до 0,011 мГр/имп. снижает уровень перекисей в гепатоци-тах после воздействия с частотами повторения 10 и 19 имп./с. Воздействие ИПРИ с дозой 0,02 мГр/имп. увеличивает уровень перекисей в клетках при частоте 13 имп./с и снижает этот показатель при более высокой частоте повторения 25 имп./с.Добавление прооксидантов к клеткам позволяет выявить состояние их антиоксидантного потенциала. В качестве прооксиданта в настоящей работе исполь-зовалась перекись водорода, экзогенно добавляемая к облученным и ложнооблученным образцам. Добавле-ние Н2О2 к гепатоцитам, облученным ИПРИ с часто-той повторения 13 имп./с и дозой 0,02 мГр/имп., со-провождается резким увеличением интенсивности флуоресценции ДХФ. Это свидетельствует о сниже-нии антиоксидантного потенциала клеток, обуслов-ленного воздействием ИПРИ (рис. 1, б). Снижение уровня перекисей в гепатоцитах может быть опосредо-вано усилением антиоксидантных возможностей кле-ток после воздействия ИПРИ в дозе 0,011 мГр/имп. и с частотами 10 и 19 имп./с (рис. 1, а). В пользу этого предположения свидетельствует то, что добавление прооксиданта в эти образцы значимо не увеличивает интенсивность флуоресценции ДХФ в сравнении с ложнооблученными гепатоцитами (рис. 1, б). Умерен-ное увеличение стимулированной прооксидантом флуоресценции образцов, предварительно облучен-ных ИПРИ в дозе 0,02 мГр/имп. с частотой повторе-ния 13 имп./с (рис. 1, б), а также увеличение флуорес-ценции облученных образцов до добавления перекиси (рис. 1, а) могут указывать на снижение антиперекис-ной защиты после действия ИПРИ с таким режимом генерации.Влияние ИПМИ на содержание пероксида водорода в гепатоцитах. Однократное воздействие ИПМИ с некоторыми режимами на изолированные гепатоциты сопровождается существенным изменением интенсив-ности флуоресценции ДХФ, что свидетельствует о влиянии этого фактора на продукцию перекисей в клетках. При этом эффект зависит как от интенсивно-сти (пиковой ППМ) ИПМИ, так и от частоты повторе-ния импульсов (рис. 2, а).После облучения клеток ИПМИ с пППМ 120 Вт/см2 интенсивность флуоресценции зонда на АФК значимо не отличается от таковой в ложнооблученных образ-цах. Увеличение ППМ до 960 мкВт/см2 с частотами повторения 10, 13 и 16 имп./с повышает уровень пере-кисей в гепатоцитах. Дальнейшее повышение пППМ до 1520 Вт/см2, наоборот, снижает интенсивность флуо-ресценции, и этот эффект более выражен после воздей-ствия с частотой повторения 13 имп./с. Такое сниже-ние уровня перекисей может быть обусловлено либо ингибированием активности прооксидантных фермен-тов, в частности ксантиноксидазы, генерирующей су-пероксид анион кислорода и пероксид водорода, либо активацией антиоксидантного фермента каталазы, вос-станавливающей Н2О2. По-видимому, баланс скорости генерации АФК и скорости их утилизации будет опре-делять разнонаправленное действие некоторых режи-мов облучения. Эти процессы могут быть в разной сте-пени чувствительны к определенным уровням интен-сивность/доза и частотам повторения импульсов. Воз-можно, способность генерировать перекиси в водных растворах является общим свойством микроволнового излучения.В экспериментах с прооксидантом добавление Н2О2 к клеткам, облученным ИПМИ с ППМ 120 Вт/см2, ин-тенсивность флуоресценции зонда не отличается от таковой у ложнооблученных образцов. Однако в клет-ках, облученных с пППМ 960 и 1520 Вт/см2 с частота-ми повторения в диапазоне 10-19 имп./с, наблюдается увеличение стимулированной флуоресценции ДХФ162(рис. 2, б). Особенно ярко этот эффект проявляется по-сле воздействия с пППМ 1520 Вт/см2 и частотой по-вторения 13 мип./с. Это может быть обусловлено сни-жением мощности антиперекисных систем (истощение анитаперекисного пула) в гепатоцитах, вызванным предшествующим воздействием.120 Вт/см2 960 Вт/см2 1520 Вт/см213161925Частота повторения, имп./с...120 Вт/см21,5i** 960 Вт/см 2 1520 Вт/см2и, отн. е lltttTTllLU-ШШ,U I'll%UIWhценWmmtmmimwmftiiФлуорес1013161925Частота повторения, имп./сРис. 2. Влияние ИПМИ с разными ППМ на: а - интенсивность флуоресценции ДХФ в изолированных гепатоцитах мышейв зависимости от частоты повторения импульсов; б - интенсивность стимулируемой Н2О2 (0,5 мМ) флуоресценции гепатоцитов,нагруженных ДХФДА. * Различия по отношению к ЛО образцам статистически значимы, р ≤ 0,05Таким образом, полученные результаты свидетельст-вуют о том, что однократное воздействие ИПМИ и ИПРИ на изолированные гепатоциты сопровождается изменени-ем уровня пероксидов непосредственно в клетках, а не только в воде под влиянием непрерывных КВЧ и СВЧ [9, 14]. Направленность и выраженность эффекта зависит от интенсивности/дозы воздействия и частоты повторения импульсов. Наиболее эффективным оказалось воздейст-вие ИПРИ с дозами 0,011 и 0,02 мГр/имп. и ИПМИ с ин-тенсивностями 960 и 1520 Вт/см2 и частотами повторения в диапазоне 10-19 имп./с. При использованных режимах воздействия ИПМИ более выраженно изменяет уровень перекисей в изолированных гепатоцитах по сравнению с ИПРИ. В случае повышения уровня перекисей в гепато-цитах после действия ИПМИ и ИПРИ могут запускаться процессы окислительной модификации липидов и белков, которые могут быть причиной некоторых биологических эффектов ИПРИ и ИПМИ [3, 4].

Ключевые слова

рентгеновские и микроволновые импульсы, гепатоциты, перекиси, x-ray and microwave pulses, hepatocytes, peroxide

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Жаркова Любовь ПетровнаТомский государственный университетИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)аспирант кафедры физиологии человека и животныхинженер отдела физической электроникиZharkova_Lubov@mail.ru
Князева Ирекле РашидовнаСибирский государственный медицинский университетИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)кандидат биологических наук, доцент кафедры нормальной физиологиивед. инженер отдела физической электроникиkir@rubl.tomsk.ru
Иванов Владимир ВладимировичСибирский государственный медицинский университетНИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск)кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимиистарший научный сотрудникiseivv@mail.ru
Большаков Михаил АлексеевичТомский государственный университетИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животныхстарший научный сотрудник Отдела физической электроникиmbol@ngs.ru
Кутенков Олег ПетровичИнститут сильноточной электроники СО РАН (г. Томск)ведущий инженер-электроник Отдела физической электроникиKutenkov@lfe.hcei.tsc.ru
Ростов Владислав ВладимировичИнститут сильноточной электроники СО РАНТомский государственный университетдоктор физико-математических наук, зав. отделом физической электроникипрофессор кафедры физики плазмыrostov@lfe.hcei.tsc.ru
Всего: 6

Ссылки

Вакс В.Л, Домрачев Г.А., Родыгин Ю.Л. и др. Диссоциация воды под действием СВЧ-излучения // Известия ВУЗов. Радиофизика. 1994. Т. 37, № 1. С. 149-154.
Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. (Based on the revised Appendix A of the European Convention ETS 123) FELASA: Federation of European Laboratory Animal Science Associations, London, UK. 2007. 17 с. URL: www.felasa.eu
Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? // Neurochemistry journal. 2006. Vol. 97. P. 1634-1658.
Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц. и др. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова, И.А. Хлусова, Г.Ц. Дамбаева. Томск: STT, 2004. 386 с.
Halliwell B., Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? // British Journal of Pharmacology. 2004. Vol. 142. P. 231-255.
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 12. С. 13-19.
Gudkova O.Yu., Gudkov S.V., Gapeyev A.B. et al. Study of mechanisms of formation of reactive oxygen species in aqueous solution exposed to high-peak-power pulsed electromagnetic radiation of extremely high frequencies // Biophisics. 2005. Vol. 50, № 5. P. 679-684.
Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона // Успехи физиологических наук. 2003. Т. 34, № 3. С. 21-34.
Князева И.Р., Большаков М.А., Жаркова Л.П. и др. Исследование окислительных процессов в тканях белых мышей после кратковременного воздействия импульсно-периодических микроволнового и рентгеновского излучений // Нейрогуморальные механизмы регуляции органов пищеварительной системы в норме и при патологии. Томск: СибГМУ, 2007. C. 89-94.
Bolshakov M.A., Knyazeva I.R., Rostov V.V. et al. Initiation of Free Radical Oxidation in Albino Mice by Exposure to Pulse Periodic Microwaves and X-rays // Biophysics. 2005. Vol. 50. Suppl. 1. P. 104-109.
Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. Р. 47-95.
Михайлов В.Ф., Мазурик В.К., Бурлакова Е.Б. Сигнальная функция активных форм кислорода в регуляторных сетях ответа клеток на повреждающие воздействия: участие в реализации радиочувствительности и нестабильности генома // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 1. С. 5-18.
Fridovich I. Oxigen toxicity: a radical explanation // Journal of Experimental Biology. 1998. Vol. 201. P. 1203-1209.
Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. СПб.: Наука, 2003. 327 с.
 Влияние импульсно-периодическогорентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах | Вестн. Том. гос. ун-та. 2010. № 333.

Влияние импульсно-периодическогорентгеновского и микроволнового излучений на уровень перекисей в изолированных гепатоцитах | Вестн. Том. гос. ун-та. 2010. № 333.

Полнотекстовая версия