Цитологические и цитогенетические изменения Т-лимфоцитов крови человека при воздействии противоопухолевого препарата адриамицина на фоне введения экстрактов из мицелия грибов шиитаке (Lentinula edodes) в условиях in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. 2012. № 356.

Цитологические и цитогенетические изменения Т-лимфоцитов крови человека при воздействии противоопухолевого препарата адриамицина на фоне введения экстрактов из мицелия грибов шиитаке (Lentinula edodes) в условиях in vitro

Изучена способность экстрактов из мицелия гриба (Lentinula edodes), выращенного в течение 10 сут в темноте, оказывать протективное действие при воздействии на Т-лимфоциты человека в условиях in vitro противоопухолевым препаратом адриамицином. Установлена способность экстрактов стимулировать бласттрансформацию и митотическую активность Т-лимфоцитов. После воздействия адриамицином на фоне введения экстрактов мицелия гриба в культурах Т-лимфоцитов наблюдалось существенное снижение числа большинства патологически измененных клеток, индуцированных противоопухолевым препаратом.

Cytological and cytogenetic alterations of human blood T-lymphocytesin vitro induced by anti-cancer drug Adriamycin in combination with shiitake mushroom mycelium (Lentinula edodes) extract.pdf К числу наиболее грозных осложнений современ-ной химиотерапии опухолей относится токсическаягипоплазия кроветворения. Практически все известныев настоящее время цитостатики даже в терапевтиче-ских дозах оказывают угнетающий эффект на гемопоэз,что вынуждает клиницистов осуществлять химиотера-пию онкологических больных при постоянном контро-ле картины крови и в случае необходимости прерыватьлечение [1].Особое значение в указанном аспекте имеет исследо-вание механизмов повреждающего действия цитостати-ков на генетические структуры гемопоэтических клетокнормального (не пораженного опухолью) костного моз-га, поскольку известно, что большинство используемыхв клинике цитостатических лекарств обладают выра-женным цитогенетическим эффектом, который во мно-гом и определяет токсическое действие этих препаратовна нормальные органы и ткани организма [1, 2].Адриамицин (адриабластин, доксорубицин) отно-сится к группе антрациклиновых антибиотиков - пиг-ментов с индикаторными свойствами. По химическомустроению антрациклины являются гликозидами. Ки-слотные свойства соединению придает аминогруппасахара, а основные свойства антрациклинов обусловле-ны гидроксильными группами агликона.Хромофорная группа препарата представляет собойкрасный нерастворимый в воде агликон-антрациклинон.В молекуле адриамицина агликон соединен гликозиднойсвязью с аминосахаром даунозамином [2]. Адриамицинактивен при лечении 18 форм злокачественных опухо-лей: лимфосаркомы, ретикулосаркомы, лимфогрануле-матоза, острых лейкозов, рака молочной железы, ракалегкого, злокачественных опухолей яичника, саркоммягких тканей и некоторых костныех сарком, нейробла-стомы и опухоли Вильмса у детей, в отдельных случаяхпри раке щитовидной железы и переходно-клеточномраке мочевого пузыря и др. [3].Шиитаке (Lentinula edodes) - съедобный гриб, широ-ко используемый как лекарственное средство. Имеютсясведения о том, что потребление этого гриба снижаетартериальное давление, уровень холестерина в крови,развитие сердечно-сосудистых заболеваний и возникно-вение раковых трансформаций клеток [4]. Его такжестали использовать для предотвращения развития мета-стазов после хирургических операций раковых опухолей[5-7]. Экстракты из этого гриба в экспериментах на бак-териях не обладали мутагенной активностью [8]. Приэтом Лима с соавт. [9] установили, что экстракты из гри-ба обладают антимутагенной активностью при воздей-ствии на эукариотические клетки мутагенов циклофос-фамида и N-этил-N-нитрозомочевины [9].Известны факты иммуностимулирующего действиякомпонентов этого гриба. Лентинан - полисахарид (3-1,3-глюкагон), экстрагированный из грибов Lentinulaedodes, обладает выраженой иммуностимулирующейактивностью и применяется в клинической практикеСША и Японии начиная с 1986 г. [5-7]. Установлено,что лентиниан существенно стимулирует Т-системуиммунитета человека.В настоящее время широко дискутируется воз-можность применения экстрактов гриба шиитаке иотдельных его метаболитов в качестве лекарственно-го средства, позволяющего снизить генетическиеэффекты, которые вызывает химиотерапия больныхраком [10].Цель настоящей работы - изучение в условиях in vitroцитогенетических последствий воздействия на Т-лимфоциты человека противоопухолевого препаратаадриамицина на фоне введения в культуры экстрактовмицелия гриба шиитаке (Lentinula edodes).Материал и методики исследованияИз мицелия гриба Lentinula edodes был получен экс-тракт, который стерилизовали, пропуская через миллипо-ровый фильтр с диаметром пор 3 мк. Концентрация сухо-го вещества в 1 мл экстракта составила 20 мг.В культуры лимфоцитов периферической крови,полученные от здоровых доноров, вводили экстрактыгриба шиитаке (Lentinula edodes) в дозе 0,1 мл на 1 млкультуральной среды RPMI и инкубировали на протя-жении 72 ч в стандартных условиях [11].Предварительно в пробит-анализе было показано,что данная доза экстракта не вызывает цитопатическо-го эффекта в условиях культуры Т-лимфоцитов чело-века. В культуральные флаконы через 12 ч после нача-ла культивирования был введен цитостатический пре-парат адриамицин в дозе 1 мкг/мл. Эта доза цитостати-ка, по нашим данным, вызывает выраженный цитоге-нетический эффект, индуцируя повышение числа кле-ток с микроядрами [12].На 72-м часу культивирования Т-лимфоциты фик-сировали и готовили стандартные препараты по ранееописанному методу с анализом кариопатологическихизменений интерфазного ядра и делящихся Т-лимфо-цитов [13].В настоящей работе выполнено измерение площа-ди ядер Т-лимфоцитов по методу, описанному в [14],с использованием компьютерной программы ImageJ,разработанной Wayne Rasband, National Institutes ofHealth, USA, и микроскопа фирмы Zeiss Jena, обо-рудованного видеокамерой, а также проведен анализбласттрансформации и митотической активностикультур клеток.Статистическую обработку осуществляли с исполь-зованием пакета статистических программ STATISTICAv.6.0, BIOSYS-2, Microsoft Access, BIOSTAT(Primer of Biostatistic version 4.03).Все количественные показатели исследования обраба-тывали с применением t-критерия Стьюдента для незави-симых выборок, поскольку тестирование закона распре-деления при помощи критерия Колмогорова - Смирноване выявило отличий от нормального. Анализ статистиче-ских различий качественных признаков производили сиспользованием теста ƒ2 с поправкой Йейтса на непре-рывность [15].Различия сравниваемых результатов (X±m, где X - вы-борочное среднее арифметическое, m - ошибка среднегоарифметического) считались статистически значимымипри достигнутом уровне p < 0,05.Т а б л и ц а 1Частота клеток с различными морфологическими изменениями ядра в культурах Т-лимфоцитов кровипосле воздействия адриамицином на фоне введения экстрактов мицелия гриба шиитаке (Lentinula edodes), % (X±m)Число клеток в культуре с различными видоизменениями морфологии ядраРегистрируемый тип изменений морфологииядерного аппарата интерфазной клеткиИнтактныекультуры(контроль)Культурыс введениемадриамицинаКультурыс введениемэкстракта мице-лия шиитакеКультуры послевведения экстрактамицелия и последую-щего введенияадриамицинаКруглое ядро 28,13,1 13,93,2* 29,32,1 32,33,2Овальное ядро 34,02,8 24,22,5 23,22,2** 20,83,2*Бобовидное ядро 28,52,2 13,53,4* 36,82,3** 30,12,8*Угловатое ядро 3,00,8 4,70,9 3,30,8 5,30,9Ядро с единичнойпротрузией2,30,5 10,90,8* 1,90,3 4,10,5Ядро с большимчислом протрузий 1,50,6 6,80,8* 1,30,6 2,30,8Ядро с одним мик-роядром 1,30,3 5,70,6* 1,20,6 1,90,7Ядро с нескольки-ми микроядрами 0,80,3 4,50,5* 0,50,2 1,80,2Двуядерные имногоядерныеклетки0,10,1 3,80,5* 0,10,1 0,80,2*Кариорексис ядра 0,20,1 3,40,5* 0,20,1 1,50,2*Кариопикноз ядра 0,10,1 7,10,9* 0,50,4 1,40,4*Кариолизис ядра 0,20,2 5,30,9* 1,90,6 1,40,4*Примечание. Здесь и далее в таблицах звездочками отмечены значения, статистически отличающиеся от интактного контроля (одной приp < 0,01, двумя при p < 0,05). Подчеркнуты отличия показателей культур клеток, полученных после воздействия адиамицином на фоне воздей-ствия, от данных, наблюдаемых после воздействия только одним адриамицином.Результаты исследования и обсуждениеДля интактных культур (табл. 1) Т-лимфоцитов былохарактерно то, что подавляющее большинство клеток (око-ло 90%) имеет округлое ядро (круглое, овальное или бобо-видное). Анализ морфологических изменений ядер Т-лимфоцитов под влиянием введения адриамицина свиде-тельствует об изменениях отдельных классов клеток поэтому показателю. На фоне снижения числа клеток с ок-руглым ядром существенно возрастают патологическиеизменения морфологии ядер отдельных клеток: с протру-зиями, микроядрами и деструктивными изменениями, при-водящими к гибели клетки, такими как кариорексис, ка-риопикноз и кариолизис (во всех случаях p < 0,01).Наряду с этим отмечено также увеличение числадвуядерных клеток. Экстракты гриба шиитаке не вы-зывали появления патологических изменений ядер, нодостоверно увеличивали в культуре число клеток с бо-бовидным ядром, при этом снижалось количество кле-ток с овальным ядром (в обоих случаях p < 0,05). До-бавление в культуры адриамицина на фоне введенияэкстракта мицелия гриба существенно снижает, по срав-нению с культурами, где был введен адриамицин безпредварительного воздействия экстрактами, число кле-ток с патологиями ядра. Кроме того, снижается до ин-тактного уровня количество клеток с микроядрами, атакже с кариопикнозом и кариорексисом, при этом по-вышенным остается число двуядерных клеток и клетокс единичными протрузиями ядер и кариолизисом.Анализ патологий деления (табл. 2) при воздействииадриамицином показал, что более 40% изученных мито-зов имеют патологические изменения.Чаще всего наблюдались метафазы с отставаниямиотдельных хромосом, а также многогрупповые метафа-зы. Среди патологических ана-телофаз преобладаликлетки с отставаниями хромосом и мостами. Увеличениячисла клеток с колхициноподобными митозами (К-митозами) не отмечено.Т а б л и ц а 2Частота патологических митозов в Т-лимфоцитах периферической кровипосле воздействия адриамицином на фоне введения экстрактов мицелия гриба шиитаке (Lentinula edodes), % (X±m)Число клеток с патологиями деленияТипы патологий деления ядерТ-лимфоцитовВ интактномконтролеПосле введенияадриамицинаПосле введенияэкстракта мицелияПосле введенияэкстракта мицелия ипоследующего введе-ния адриамицинаОтставание хромо-сом в метафазе0,40,2 12,23,4* 0,40,4 0,70,3Трех- и многопо-люсная метафаза0,10,1 2,50,9* 0,30,2 0,30,2Многогрупповаяметафаза0,20,1 8,52,9* 0,20,2 0,40,3К-митоз 0,40,2 0,80,4* 0,40,1 0,50,3Отставание хромо-сом и их фрагментовв ана-телофазе0,20,1 5,31,5* 0,20,1 0,50,2Неравнополюснаяана-телофаза0,10,1 2,80,9* 0,10,1 0,80,4Трех- и многопо-люсная ана-телофаза0,10,1 3,81,2* 0,10,1 0,60,3Ана-телофазас мостами0,20,2 4,21,0* 0,20,2 0,40,3ИТОГО 1,7±0,5 40,2±6,9 1,9±0,7 4,2±0,9Если адриамицин существенно снижает митотиче-скую активность культур клеток, подавляя бласттранс-формацию Т-лимфоцитов, то экстракты гриба шиитакепри введении в культуры более чем в 2 раза усиливаютмитотическую активность этих клеток (табл. 3), приэтом достоверно увеличивая в культурах и процессыбласттрансформации Т-лимфоцитов.Установлено, что адриамицин индуцировал сниже-ние общей площади культивируемых клеток, при этомэкстракты гриба шиитаке, наоборот, способствовалирезкому возрастанию числа крупных клеток, площадькоторых достигает более 100 мк2 (рис. 1).Антимутагенные эффекты экстрактов мицелияшиитаке могут быть связаны с влиянием на следующиепроцессы в культурах Т-лимфоцитов:1) стимуляция ДНК-репаративных процессов;2) инактивирование мутагенных потенций адриа-мицина;3) защита цитогенетических структур клетки от му-тагенного действия адриамицина;4) стимуляция апоптотических процессов;5) активация лимфоцитов-киллеров по устранениюгенетически дефектных клеток [16].Известно, что механизм противоопухолевого действияадриамицина связан с индуцированием в клетках свобод-ных радикалов, что вызывает поражение ДНК на стадияхS и G2 [1, 13].Наличие ана-телофаз с мостами свидетельствует оспособности адриамицина к перестройкам с формиро-ванием дицентрических хромосом.Т а б л и ц а 3Показатели бласттрансформации и митотической активности Т-лимфоцитовпосле воздействия экстрактами мицелия шиитаке (Lentinula edodes) и адриамицином, % (X±m)Анализируемый показательИнтактные культуры(контроль)Культуры с введениемадриамицинаКультуры с введениемэкстрактов грибаКультуры после введе-ния экстрактов гриба ипоследующего введенияадриамицинаМитотическая активность 5,30,6 1,50,3** 12,61,2* 8,61,0**Бласттрансформация 58,62,1 17,32,4* 72,44,8* 56,32,9Рис. 1. Площадь ядер в культурах Т-лимфоцитов периферической кровипосле введения адриамицина и экстрактов мицелия из грибов шиитаке (Lentinula edodes)А Б В ГРис. 2. Патологические изменения Т-лимфоцитов под влиянием адриамицина:А - метафаза с отставшей хромосомой; Б - двуядерный Т-лимфоцит с протрузиями; В - анафаза с мостом;Г - двуядерный Т-лимфоцит с микроядрами. Увеличение 10 ок.  100 об. Окраска азур-эозиномИзвестна способность экстрактов шиитаке стиму-лировать лимфоциты-киллеры [18], и мы полагаем, чтоэто может способствовать устранению из культурыгенетически дефектных клеток [16].Появление после совместного воздействия экс-трактов и адриамицина клеток с кариорексисом икариопикнозом, по-видимому, свидетельствует впользу этой гипотезы, а наблюдаемое повышениечисла клеток с кариолизисом возможно объяснитьактивацией апоптотических процессов под влияниемкомпонентов экстрактов грибов шиитаке в условияхкультуры клеток.ЗаключениеТаким образом, полученные данные свидетельст-вуют, что в культурах Т-лимфоцитов, полученных отздоровых доноров, противоопухолевый препарат ад-риамицин способен индуцировать разнообразные ци-тологические и цитогенетические изменения. Некото-рые из них, такие как отставание хромосом, формиро-вание микроядер способствуют утрате части цитогене-тического материала, а кариорексис, кариопикноз икариолизис - гибели измененных клеток. Введениеадриамицина на фоне предварительного введения экс-трактов мицелия грибов шиитаке (Lentinula edodes)вызывает существенно меньшие цитопатический и ци-тогенетический эффекты, что свидетельствует о про-тективном действии некоторых компонентов гриба.

Ключевые слова

mitotic activity. Р, blast transformation, Adriamycin, mycelium Lentinula edodes, T-lymphocytes in vitro, митотическая активность, бласттрансформация, мицелий Lentinula edodes, адриамицин, Т-лимфоциты in vitro

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Карначук Раиса АлександровнаНациональный исследовательский Томский государственный университетдоктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой физиологии растений и биотехнологии Биологического институтаkarnach@mail.tsu.ru
Глухова Любовь БорисовнаНациональный исследовательский Томский государственный университетаспирант кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического институтаkarnach@mail.tsu.ru
Ильинских Екатерина НиколаевнаСибирский государственный медицинский университет (г. Томск)доктор медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологииnauka-tomsk@yandex.ru
Ильинских Николай НиколаевичСибирский государственный медицинский университет (г. Томск)доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биологии и генетики; профессор кафедры экологического менеджмента Биологического института Томского государственного университетаnauka-tomsk@yandex.ru
Всего: 4

Ссылки

Ильинских И.Н., Новицкий В.В., Ильинских Е.Н. и др. Инфекционная кариопатология. Томск : Изд-во Том. ун-та, 2005. 196 с.
Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М. : Филинъ, 1997. C. 608.
Ильинских Н.Н., Ильинских И.Н., Бочаров Е.Ф. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет. Новосибирск : Наука, 1986. 250 с.
Shah S.K., Walker P.A., Moore-Olufemi S.D. et al. An evidence-based review of a Lentinula edodes mushroom extract as complementary therapy in the surgical oncology patient // Journal of Parenteral. and Enteral. Nutrition. 2011. Vol. 35, № 4. P. 449-458.
Terakawa N., Matsui Y., Satoi S. Immunological effect of active hexose correlated compound (AHCC) in healthy volunteers: a double-blind, placebocontrolled trial // Nutrition and Cancer. 2008. Vol. 60, № 5. 643-651.
Засухина Г.Д. Репаративные механизмы клеток и проблемы окружающей среды. М. : Наука, 1979. 183 с.
Ильинских Н.Н., Васильев С.А., Кравцов В.Ю. Микроядерный тест в скрининге и мониторинге мутагенов. Saarbrucken : Lambert Academic Publishing, 2011. 524 c.
Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск : Изд-во Том. ун-та, 1992. 272 с.
Lindequist U., Niedermeyer T.H., Julich W.D. The pharmacological potential of mushrooms // Evid. Based. Complement. Alternat. Med. 2005. Vol. 2, № 3. Р. 285-299.
Moorhead P.S., Novel P.C., Mellman W.J. et al. Chromosome preparations of leukocyte cultured from human peripheral blood // Exptl. Cell Res. 1960. Vol. 20. P. 613-516.
Дудник Ю.В., Гаузе Г.Ф. Механизмы действия антрациклинов // Экспериментальная онкология. М., 1982. Т. 4, № 5. С. 18-22.
Переводчикова Н.И. Клиническая химиотерапия опухолевых заболеваний. М. : Медицина, 1976. 200 с.
Wasser S.P., Weis A.L. Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: a modern perspective // Crit. Rev. Immunol. 1999. Vol. 19, № 1. P. 65-96.
Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. М. : Медицина, 1999. 136 с.
Поливанов К.А. Предоперационная иммунокоррекция в хирургическом лечении заболеваний желудка : автореф. дис.  канд. мед. наук. М., 2005. 18 с.
Shah S.K., Walker P.A., Moore-Olufemi S.D. et al. An evidence-based review of a Lentinula edodes mushroom extract as complementary therapy in the surgical oncology patient // Journal of Parenteral. and Enteral. Nutrition. 2011. Vol. 35, № 4. P. 449-458.
Gruter A., Friederich U., Wurgler F.E. Antimutagenic effects of mushrooms // Mutat. Res. 1990. Vol. 231, № 2. Р. 243-249.
Lima P.A., Delmanto R.D., Sugui M.M. et al. Lentinula edodes (Berk.) Pegler (shiitake) modulates genotoxic and mutagenic effects induced by alkylating agents in vivo // Mutat. Res. 2001. Vol. 496. № 1. P. 23-32.
Новицкий В.В., Переверзева Э.Р., Пономарков В.И. и др. Экспериментально клинические аспекты некоторых токсических эффектов противоопухолевых препаратов. М. : Изд-во ВНИИМИ, 1987. Сер. Онкология. Вып. 2. 69 с.
 Цитологические и цитогенетические изменения Т-лимфоцитов крови человека при воздействии противоопухолевого препарата адриамицина на фоне введения экстрактов из мицелия грибов шиитаке (Lentinula edodes) в условиях in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. 2012. № 356.

Цитологические и цитогенетические изменения Т-лимфоцитов крови человека при воздействии противоопухолевого препарата адриамицина на фоне введения экстрактов из мицелия грибов шиитаке (Lentinula edodes) в условиях in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. 2012. № 356.

Полнотекстовая версия