Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий рода Pseudomonas на прорастание, морфогенез и рост Dactylorhiza incarnata (L.) Soo (Orchidaceae) в культуре in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2020. № 51. DOI: 10.17223/19988591/51/1

Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий рода Pseudomonas на прорастание, морфогенез и рост Dactylorhiza incarnata (L.) Soo (Orchidaceae) в культуре in vitro

Установлено, что штаммы бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 и P. brassicacearum GRT221, ассоциированные с подземными органами пальчатокоренника мясокрасного (Dactylorhiza incarnata (L.) Soo), тубероидной орхидеей средней полосы европейской части России, синтезируют и выделяют в культуральную жидкость индолил-3-уксусную кислоту в концентрациях от 18,2±1,30 до 31,1±1,94 мг/л. Внесение культуральной жидкости ассоциативных бактерий в питательную среду для культивирования D. incarnata in vitro способствовало ускорению прорастания зрелых семян и повышению их всхожести, увеличению темпов развития проростков, линейных размеров формирующихся ортотропного побега и придаточных корней, накоплению сырой массы. Наиболее выраженное стимулирующее действие отмечено для штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225.

Effect of supernatant of associative bacteria of the genus Pseudomonas on germination, morphogenesis and growth o.pdf Введение Бактерии рода Pseudomonas являются типичными представителями почвенных микроорганизмов в составе ассоциированных с растениями микробных сообществ [1]. Они обладают способностью синтезировать фитогормоны [2], вторичные метаболиты [3], вещества с антибактериальной и фунгицидной активностями [4]. Эти бактерии также оптимизируют условия минерального питания растений [5]. Их используют в качестве основы биологических средств регуляции роста и защиты растений, рассматривают как перспективные агенты биоконтроля [1]. Бактеризация семян и проростков сельскохозяйственных культур суспензией на основе Pseudomonas увеличивает прирост линейных размеров и повышает урожайность [6]. Наряду с инокуляцией растений живыми клетками бактерий в культуре in vitro в ка- Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 7 честве компонента питательных сред используют культуральные жидкости (КЖ) микроорганизмов [7]. В исследовании на пшенице показано, что КЖ бактерий рода Pseudomonas способствовали увеличению энергии прорастания и всхожести семян до 15%, а также двукратному увеличению прироста линейных размеров проростков [8]. Известно, что применение КЖ бактерий может быть эффективнее, чем использование самих клеток, отмытых от КЖ [9]. Среди бактерий, ассоциированных с орхидными (Orchidaceae), также выявлены представители рода Pseudomonas. Они обнаружены на поверхности и внутри надземных и подземных органов как у тропических видов [10], так и у видов умеренного климата Северного полушария [11]. Исследования по симбиотическому проращиванию семян орхидных на искусственных питательных средах ранее проводились. Первая попытка инокуляции семян орхидных бактериальными культурами предпринята Кнудсоном в 1922 г. [12]. Он показал, что бактерии Bacillus radicicola увеличивали всхожесть семян эпифитных видов Epidendrum и Laelia-Cattleya. В 90-х годах было продемонстрировано, что Pseudomonas putida, Xanthomonas maltophilia и Bacillus cereus в комплексе с микоризными грибами способствовали прорастанию семян Pterostylis vittata [13]. Последние исследования показали, что бактеризация семян Dendrobium nobile Pseudomonas fluorescens штаммами бактерий Klebsiella oxytoca, выделенными из растения-хозяина, способствовала их прорастанию in vitro [10, 14, 15]. Однако при использовании живого инокулята возникает ряд сложностей: невозможность отследить конечную концентрацию ауксинов в культуральной среде, неустойчивое равновесие в моделируемой симбиотической системе, различный состав питательных сред для бактериальных и растительных культур. С практической точки зрения решением этих проблем может стать применение биостимуляторов микробного происхождения отдельно от клеток [7]. Однако исследования по влиянию КЖ ассоциативных бактерий на рост и развитие орхидных умеренного климата Северного полушария в культуре in vitro до настоящего времени не проводились. Между тем эти растения имеют особенности онтогенеза, связанные с длительным прорастанием семян, формированием специфических структур (протокормов, проторизомов), продолжительной подземной жизнью проростков, вторичным покоем, зависимостью в природных условиях от микосимбионта и др. [16]. Исследования влияния КЖ ассоциативных бактерий на эффективность прорастания семян, анатомо-морфологическую структуру и физиологические особенности проростков орхидных умеренного климата Северного полушария в культуре in vitro могут способствовать разработке технологий культивирования редких и охраняемых видов с использованием биологически активных компонентов питательных сред. Цель работы - оценка влияния двух культуральных жидкостей ассоциативных бактерий рода Pseudomonas, выделенных из ризосферы генеративных особей Dactylorhiza incarnata, на прорастание семян, морфогенез и рост А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев 8 проростков пальчатокоренника мясокрасного в культуре in vitro как одного из представителей орхидных средней полосы европейской части России. Материалы и методики исследования Dactylorhiza incarnata (L.) Soo (пальчатокоренник мясокрасный) относится к орхидным с тубероидной жизненной формой, широко распространен на территории средней полосы европейской части России [17], охраняется -включен в Европейский список краснокнижных сосудистых растений, Приложение II к конвенции CITES, а также в некоторые региональные Красные книги [18]. Бактерии рода Pseudomonas - Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 и P brassicacearum GRT221 выделены из ризосферы генеративных особей D. incarnata, произрастающих в осоково-разнотравном сообществе на дерново-подзолистой суглинистой почве (содержание гумуса в корнеобитаемом слое 5,7%, сумма поглощенных оснований - 14 мг/экв, pH - 6,3) на территории Ярославской области. Для идентификации штаммов использовали молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Геномная ДНК выделена с помощью набора ExtractDNA (Евроген) согласно инструкциям производителя. Гены 16S рРНК ам-плифицированы с использованием универсальных праймеров 9F(5>-GAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1512R(5>-ACGGCTACCTTGTTACGACTT). Режим проведения ПЦР: 95 °С - 4 мин; (95 °С - 1 мин; 55 °С - 1 мин; 72 °С -1 мин 30 с) - 30 циклов; 72 °С - 5 мин. Продукты амплификации разделяли в 1,5% агарозном геле. Фрагменты размером около 1,5 т.п.н. вырезали и очищали с помощью набора Cleanup Mini (Евроген) согласно инструкциям производителя. Амплифицированные фрагменты ДНК легировали с ДНК вектора pAL-TA (Евроген). Секвенирование клонированной последовательности ДНК проводили, используя универсальные М13-праймеры. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК депонированы в GenBank (MH469936, MH469937). Штамм Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером В-13158. Бактерии культивировали на среде LB в условиях постоянного перемешивания на роторном шейкере ES-20 (Biosan, Латвия) при температуре 30 °С в течение 5-7 суток. КЖ ассоциативных бактерий получали путем отделения бактериальной массы центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 20 мин при 4 °С (Eppendorf 5804R, Германия). КЖ стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр «Millipore» (США) с диаметром пор 0,22 мкм. Содержание индолил-3-уксусной кислоты (IAA) в КЖ исследуемых штаммов бактерий определяли колориметрическим методом с реактивом Сальковского [10]. Культуру бактерий вносили в питательную среду Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 9 Чапека с 5 мг/л триптофана и культивировали на роторном шейкере ES-20 (Biosan, Латвия) при 180 об/мин при температуре 28 °С, суспензию центрифугировали 15 мин при 7 000 об/мин. К полученной КЖ добавляли реактив Сальковского (1:1) и оставляли в темноте на 20 мин при 30 °С. Аналогично поступали в вариантах со средой Чапека и дистиллированной водой. Оптическую плотность жидкости определяли на спектрофотометре Unico-2802S/VIS (США) при 540 нм. Концентрацию IAA устанавливали по калибровочному графику, построенному на основе разведений стандартного раствора синтетической IAA. Изучение влияния КЖ ассоциативных бактерий на прорастание семян, морфогенез и рост проростков D. incarnata проводили в культуре in vitro с использованием модифицированной питательной среды Кнудсона с активированным углем и гуматом натрия [19]. В нее дополнительно вносили стерильные КЖ ассоциативных бактерий в количестве 10% от общего объема среды. Для сравнения использовали модифицированную питательную среду Кнудсона с IAA в концентрации 1,75 мг/л (10 мкМ), а также контроль - вариант с использованием модифицированной питательной среды Кнудсона без внесения КЖ и IAA. Посевы зрелых семян культивировали in vitro в течение 2 месяцев в темноте и 16 месяцев в климатической камере КС-200 (СКТБ, Россия) при интенсивности освещения 2000 лк и 16/8 фотопериоде. Для поддержании влажности питательной среды флаконы закрывали парафинизированной пленкой. Количество проросших семян определяли на 3-, 6-, 12- и 18-й месяцы культивирования. О прорастании судили по количеству образовавшихся протокормов. Полную всхожесть семян определяли по количеству проростков через 18 месяцев после посева. При описании морфогенеза D. incarnata в культуре in vitro выделяли протосому (на стадиях протокорма и проторизома) и ювенильное растение. Под протосомой понимали своеобразную форму постсеменного развития орхидных, представляющую собой метамерное или неметамерное тело, развивающееся из апикального полюса зародыша, состоящее из протокорма (1-я стадия развития протосомы) и проторизома (2-я стадия развития протосомы) с закладкой на его верхушке почки с зачатками первых листьев. Ювенильным растением называли комплексную структуру, состоящую из протосомы и первого одноосного побега с корнями и листьями [20]. Морфофизиологические параметры (линейные размеры протосом, побегов и придаточных корней, сырую массу проростков) определяли на 3-, 6-, 12- и 18-й месяцы культивирования. В каждом варианте проанализировано не менее 20 экземпляров. Повторность опыта трехкратная. Статистическая обработка результатов проведена по стандартным методикам [21]. Данные в таблицах приведены в виде средней арифметической со стандартной ошибкой (M±mM). Оценка различий выборочных средних проведена при значении доверительной вероятности 0,95. А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев 10 Результаты исследования и обсуждение Содержание ИУК в КЖ исследуемых штаммов. Ауксины - один из важнейших компонентов культуральной среды, необходимый для размножения растений в культуре in vitro. Индолил-3-уксусная кислота (IAA) - наиболее характерный ауксин, продуцируемый многими бактериями [1, 22]. Экзогенная IAA контролирует широкий спектр процессов роста и развития растений: низкие концентрации стимулируют первичное удлинение корней, высокие - образование боковых корней, уменьшают длину первичных корней и увеличивают образование корневых волосков [22, 23]. Известно, что бактерии, связанные с орхидными, способны продуцировать ауксины [2, 10, 24]. В наших предыдущих исследованиях впервые показано, что бактерии, ассоциированные с растениями рода Dactylorhiza, также способны продуцировать ауксины [25]. Нами проведен скрининг бактерий, ассоциированных с D. incarnata, по их способности синтезировать IAA. Наиболее активные штаммы-продуценты этого фитогормона были отобраны для дальнейших исследований. Сравнительный анализ последовательности генов 16S рРНК показал, что филогенетически эти штаммы относятся к роду Pseudomonas. При этом штамм Pseudomonas sp. GRP225 ближе всего к виду Pseudomonas chlororaphis, подвид aurantiaca (99,93%), штамм Pseudomonas sp. GRT221 - к виду Pseudomonas brassicacearum (99,73%). Максимальное количество IAA в КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 составило 18,2±1,30 мг/л, для P brassicacearum GRT221 - 31,1±1,94 мг/л. Ризобак-терии в основном синтезируют IAA из триптофана, который в различных концентрациях присутствует в корневых экссудатах [22]. В наших исследованиях добавление триптофана значительно увеличивало количество синтезируемого ауксина. Наивысший уровень продукции IAA получен при культивировании штаммов в среде Чапека, дополненной 5 мг/л триптофана при pH 7 и инкубировании на роторном шейкере ES-20 (Biosan, Латвия) (200 об/мин) при 30 °С в течение 5 дней. Прорастание семян. На прорастание зрелых семян орхидных оказывают влияние приемы их предпосевной обработки, составы питательных сред, режимы проращивания и др. [20]. Скрининг биостимуляторов микробного происхождения, способствующих семенному размножению D. incarnata в культуре in vitro, может оказаться полезным для выяснения факторов, влияющих на рост и развитие орхидных на ранних стадиях онтогенеза. В нашей работе показано, что к третьему месяцу прорастание зрелых семян D. incarnata связано с набуханием зародыша и формированием многочисленных ризоидов (рис. 1, а). При этом на среде с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 прорастание семян достигает максимума (21%) и превышает значение в контроле в 5 раз, в опыте с IAA - в 1,8 раза (рис. 2). Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 11 1 мм С 10 мм d 10 мм 10 мм e f Рис. 1. Прорастание и формирование проростков Dactylorhiza incarnata в культуре in vitro: а - протокорм (3-й месяц); b - протокорм (6-й месяц); c - проторизом (6-й месяц); d - протосомы с ортотропным побегом (12-й месяц); e - протосомы с придаточными корнями (18-й месяц); f - ювенильные растения (18-й месяц). Автор фото А.В. Сидоров [Fig. 1. Germination and seedling formation of Dactylorhiza incarnata in vitro: a - Protocorm (3rd month); b - Protocorm (6th month); c - Protorizom (6th month); d - Protosoms with orthotropic shoot (12th month); e - Seedlings with additional roots (18th month);/- Juvenile plants (18th month). Photo by Andrey Sidorov] Прорастание [Germination], % Месяц [Month] Рис. 2. Прорастание семян Dactylorhiza incarnata в культуре in vitro (%) [Fig. 2 Germination of Dactylorhiza incarnata seeds in vitro (%)]: □ - контроль (Control); □ - IAA; □ - Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225; ■ - P. brassicacearum GRT221. Примечание. ^Статистическая значимость различий (р < 0,05) по сравнению с контролем. [Note. Differences are statistically significant (p < 0,05) compared to the control] А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев 12 Ранее указывалась способность D. incarnata (до 15% зрелых семян) к прорастанию на безгормональных питательных средах в культуре in vitro [26]. В случае с использованием среды с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 этот показатель оказывается выше, что может свидетельствовать о ее стимулирующем действии. Аналогичная картина отмечена также для КЖ штамма P brassicacearum GRT221, наиболее выраженная с 6-го месяца (см. рис. 2). При этом эффективность ее стимулирующего влияния на 27% ниже, чем у КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225. КЖ двух штаммов в большей степени способствуют прорастанию семян D. incarnata в культуре in vitro по сравнению с контролем и вариантом с IAA. Известно, что внесение экзогенной IAA в питательную среду может способствовать увеличению всхожести семян тубероидных видов орхидных умеренных широт, характеризующихся трудным прорастанием в культуре in vitro [27]. По-видимому, IAA, содержащаяся в КЖ штаммов ассоциативных бактерий рода Pseudomonas, оказывает сходное влияние. В нашей работе максимальный стимулирующий эффект воздействия на семена D. incarnata во всех вариантах опыта с КЖ проявляется к 6-му месяцу. Таким образом, выявлено стимулирующее влияние КЖ штаммов Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225К и P brassicacearum GRT221 на прорастание зрелых семян D. incarnata в культуре in vitro. При этом действие первой на 27% эффективнее по сравнению со второй и выражается в увеличении количества проросших семян по отношению к контролю в 5 раз и к варианту с IAA в 1,8 раза. Морфогенез проростков. Начальные этапы роста и развития D. incarnata связаны с образованием из метаморфизированного апикального полюса зародыша протосомы, представленной на ранней стадии протокормом. Это утолщенное биполярное образование, способное к дальнейшему формированию структур проростка - ризоидов и проторизомов [20]. В исследованных вариантах опыта у протокормов D. incarnata в базальной части отмечались многочисленные ризоиды однорядного типа (см. рис. 1, b). На средах с IAA и КЖ штаммов ассоциативных бактерий протокормы к 3-му месяцу культивирования имели более вытянутую форму по сравнению с контролем, которая тяготеет к округлой. Известно, что форма протокормов орхидных определяется генетически, зависит от условий культивирования, активности метаболических процессов в их клетках и др. [28]. Способность ауксинов к полярному транспорту, созданию градиентов фитогормонов позволяет им по-разному изменять скорость деления и роста клеток в зависимости от органа и его положения в пространстве [29]. К 6-му месяцу большая часть посевов во всех вариантах опыта представлена проторизомами - образованиями с видоизмененными стеблями, развивающимися из апикальной зоны протокорма (см. рис. 1, c). Доля проторизомов к этому времени возрастает в следующем ряду: контроль - КЖ Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 13 штамма P brassicacearum GRT221 - IAA - КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 (рис. 3). Увеличение этого показателя свидетельствует о более быстрых темпах развития проростков. Дальнейшее развитие D. incarnata сопровождается ростом апекса и формированием ортотропного побега (см. рис. 1, d). К 12-му месяцу культивирования доля проростков с ортотропным побегом, в том числе имеющих уже придаточные корни, в вариантах опыта с КЖ исследуемых штаммов составляет 95-99%, в контроле - 70% (см. рис. 3). Придаточные корни к этому времени становятся хорошо различимы у проростков во всех вариантах опыта (см. рис. 1, e). При этом наибольшая доля (80%) развитых проростков на среде с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225. Минимальное количество (39%) проростков с корнями отмечено в контроле (см. рис. 3). К 15-му месяцу культивирования у проростков на среде с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 и IAA формируется второй придаточный корень, в то время как в контроле и варианте с КЖ штамма P brassicacearum GRT221 проростки имеют один придаточный корень. Необходимо отметить, что некоторые придаточные корни проростков на средах с КЖ исследуемых штаммов бактерий и IAA разрастаются, что, вероятно, связано с приобретением ими запасающей функции. Эти особенности не проявляются в контрольном варианте. К 15-16-му месяцам культивирования у D. incarnata отмечается образование первого настоящего листа (см. рис. 1, f), что свидетельствует о переходе в состояние ювенильных растений. Первые растения с шиловидно-линейным листом формируются на средах с исследуемыми КЖ на 1,5-2 месяца раньше, чем в контроле и варианте с IAA. К 18-му месяцу доля проростков с первым настоящим листом на среде с КЖ Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 максимальна и в 1,8-2 раза превышает этот показатель в вариантах с IAA и КЖ P. brassicacearum GRT221 (см. рис. 3). Менее развиты проростки в контроле, у которых к этому времени настоящие листья отсутствуют. Таким образом, у проростков D. incarnata на питательных средах с КЖ отмечены более высокие темпы развития. Это проявляется в более раннем и активном формировании проторизомов, ортотропного побега, первого и второго придаточных корней. У проростков на средах с КЖ выявлено формирование запасающих корней, отсутствующих в контроле. Влияние КЖ штамма P. brassicacearum GRT221 сопоставимо с действием IAA. На среде с КЖ Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 к 18-му месяцу культивирования формируется наибольшее число проростков с фотосинтезирующим листом - ювенильных растений. Рост проростков. Накопление сырой массы D. incarnata в культуре in vitro является интегральным параметром, отражающим наряду с водным статусом проростков содержание образующихся в них пластических соединений в процессе роста. 14 А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев % 100 90 S0 70 00 0 30 40 SO 20 10 о 100 90 80 70 00 % ѵ; 40 SO 20 10 о Контроль [Controll ІАА Р. chlororaphis subsp. aurartliaca GRP223 P. brazskaceamm GRT221 Месяц [M>n£h] Рис. 3. Влияние КЖ ассоциативных бактерий на морфогенез Dactylorhiza incarnata в культуре in vitro (%): □ - протокормы; □ - проторизомы; □ - проростки с ортотропным побегом; Н - проростки с придаточными корнями; I - ювенильные растения [Fig. 3. Effect of supernatant of associative bacteria on the morphogenesis of Dactylorhiza incarnata in vitro (%): □ - Protocorms; □ - Protorizoms; □ - Seedlings with orthotropic shoot; Ю ■ - Seedlings with additional roots; В - Juvenile plants] Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 15 на накопление массы увеличивается в следующем ряду: контроль - IAA -КЖ штамма P. brassicacearum GRT221 - КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 (табл. 1). Таблица 1 [Table 1] Влияние КЖ ассоциативных бактерий на темпы прироста сырой массы Dactylorhiza incarnata в культуре in vitro [Effect of supernatant of associative bacteria on the growth rate of Dactylorhiza incarnata wet weight in vitro], % Вариант [Sample] Месяц [Month] 3-й 6-й 12-й 18-й Контроль [Control] 100 289 1 117 1 644 IAA 100 310 1 519 2 048 Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 100 350 1 717 2 458 P. brassicacearum GRT221 100 314 1 648 2 386 Масса проростков, формирующихся к 18-му месяцу, составляет на среде с КЖ штамма P brassicacearum GRT221 - 50,1±3,11 мг и на среде с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 - 59,0±3,91 мг. При этом она на 14-27% выше, чем в варианте с IAA, и на 40-50% превышает аналогичный показатель в контроле. Проростки D. incarnata на среде с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 отличаются высокими значениями сырой массы и наибольшими темпами ее прироста в культуре in vitro. Что касается линейных размеров, то первые три месяца культивирования протосомы D. incarnata статистически значимо (р < 0,05) различались только длиной. Она превышает показатель в контроле на 40% у проростков на среде с КЖ исследуемых штаммов бактерий и на 18% у проростков на среде с IAA (табл. 2). Таблица 2 [Table 2] Влияние КЖ ассоциативных бактерий на линейные размеры Dactylorhiza incarnata в культуре in vitro [Effect of supernatant of associative Pseudomonas bacteria on Dactylorhiza incarnata linear parameters in vitro] (mm) (M±mM) Параметр [Parameter] Контроль [Control] IAA Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 P. brassicacearum GRT221 3-й месяц [Third month] Длина, мм [Length, mm] 1,0±0,08 1,4±0,12* 1,7±0,12* 1,7±0,11* Ширина, мм [Width, mm] 1,0±0,09 0,9±0,08 1,1±0,10 0,8±0,08 6-й месяц [Sixth month] Длина, мм [Length, mm] 3,1±0,16 3,4±0,19 3,7±0,19* 3,4±0,17 Ширина, мм [Width, mm] 2,1±0,13 2,3±0,13 2,9±0,16* 2,4±0,14 А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев Окончание табл. 2 [Table 2 (end)] Параметр [Parameter] Контроль [Control] IAA Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 P. brassicacearum GRT221 Длина побега, мм [Shoot length, mm] 1,1±0,11 1,1±0,12 2,3±0,14* 1,6±0,13* 12-й месяц [Twelfth month] Длина, мм [Length, mm] 9,4±0,82 14,3±1,41* 14,1±1,34* 16,2±1,15* Ширина, мм [Width, mm] 6,3±0,11 9,1±0,12* 12±0,11* 9,3±0,14* Длина побега, мм [Shoot length, mm] 29,1±1,93 35,8±2,18* 48,2±2,65* 36,1±2,42* Длина придаточных корней, мм [The length of adventitious roots, mm] 3,0±0,15 11,8±1,09* 12,1±1,03* 13,2±1,18* 18-й месяц [Eighteenth month] Длина, мм [Length, mm] 9,4±1,26 15,4±1,50* 14,6±1,69* 16,8±1,18* Ширина, мм [Width, mm] 7,2±1,34 9,2±1,17 9,3±1,08 11,2±1,25* Длина побега, мм [Shoot length, mm] 41,4±3,24 42,9±3,33 63,5±5,16* 44,3±3,15 Длина придаточных корней, мм [The length of adventitious roots, mm] 11,1±0,61 34,8±1,79* 36,2±1,32* 32,0±1,72* * Статистическая значимость различий (р < 0,05) по сравнению с контролем. [* Differences are statistically significant (p < 0.05) compared to the control]. 16 К 6-му месяцу культивирования у проторизомов появляются различия по ширине, которая в варианте с КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 оказывается больше на 28%, чем в контроле. Линейные размеры проторизомов не различаются на средах с КЖ штамма P brassicacearum GRT221 и с IAA, одновременно имея несколько большие значения по сравнению с контрольным вариантом. Длина формирующегося в это время ортотропного побега у проростков на среде с КЖ Р chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 оказывается максимальной и более чем в 2 раза превышает аналогичные показатели у проростков в контроле и варианте с IAA (см. табл. 2). Наиболее существенные различия линейных размеров проторизомов в исследуемых вариантах опыта отмечаются к 12-му месяцу (см. табл. 2). На среде с КЖ штамма P brassicacearum GRT221 их длина на 42%, а ширина на 32% больше по сравнению с контролем. Проторизомы на средах с КЖ штамма Р chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 и IAA не различаются по длине, однако их ширина на 24% больше в варианте с КЖ. К этому времени длина ортотропного побега у проростков существенно увеличивается и оказывается на среде с КЖ Р chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 на 40% выше, чем в контроле. При этом длина ортотропного побега у проростков на средах с IAA и КЖ P. brassicacearum GRT221 статистически значимо (р < 0,05) не различается. Придаточные корни у проростков формируются к Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий 17 12-му месяцу, и их длина на среде с КЖ исследуемых штаммов бактерий и IAA в 4 раза выше по сравнению с контролем. При дальнейшем культивировании (к 18-му месяцу) линейные размеры проторизомов в исследованных вариантах опыта меняются незначительно при активизации процессов органогенеза, связанных с активным формированием ортотропных побегов и придаточных корней. Так, у проростков на среде с КЖ Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 длина ортотропного побега оказывается максимальной и превышает более чем на 30% значения в других вариантах опыта (см. табл. 2). Темпы прироста и абсолютные значения длины придаточных корней во всех опытных вариантах являются довольно сходными, превышая контрольные значения в 3 раза. Таким образом, ризосферные микроорганизмы и соединения, которые они выделяют, представляют собой ценные биостимуляторы и имеют существенное значение в регуляции жизнедеятельности растений [1]. Использование ассоциативных бактерий и / или их экзометаболитов может быть эффективной стратегией для управления ростом и развитием растений в культуре in vitro. Нами впервые показано положительное влияние двух КЖ ассоциативных бактерий рода Pseudomonas, выделенных из ризосферы растения-хозяина, на прорастание семян, морфогенез и рост D. incarnata в культуре in vitro. Прорастание семян в этом случае происходило в отсутствие каких-либо экзогенных растительных гормонов или стимуляторов роста, которые обычно добавляют в среду. Можно предположить, что стимулирующее влияние КЖ бактерий рода Pseudomonas связано с присутствием в их составе ауксинов. Как известно, экзогенная обработка ауксинами вызывает целый ряд изменений показателей роста. Они участвуют в стимуляции образования придаточных корней, формировании разных типов их симметрии и проводящих систем [22, 23]. По-видимому, добавление в питательную среду КЖ ассоциативных штаммов бактерий, содержащих IAA, приводит к выявленному в работе разрастанию придаточных корней проростков D. incarnata и приобретению ими запасающей функции. При этом содержание IAA в КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 сопоставимо с концентрацией синтетической IAA в контроле. Использованные концентрации IAA соответствуют таковым в работах по семенному размножению in vitro других видов орхидных [30, 31]. Однако КЖ оказывала более выраженный эффект на рост и развитие D. incarnata в условиях in vitro. Выявленные эффекты могут быть связаны с наличием в КЖ бактерий и иных физиологически активных соединений, например сидерофоров, ацилгомосеринлактонов и др. [1, 3, 4, 32]. Данное исследование расширяет наши знания о взаимодействии орхидных и микроорганизмов, предоставляет новые возможности применения бактериальных биостимуляторов в системах культивирования, размножения и сохранения редких видов. IAA микробного происхождения обладает высоким потенциалом для стимуляции роста и развития растений в культуре in vitro, ее А.В. Сидоров, Ю.В. Зайцева, О.А. Маракаев 18 использование более рентабельно по сравнению с синтетическими гормонами. Заключение Таким образом, впервые проведено изучение влияния двух КЖ ассоциативных бактерий рода Pseudomonas, выделенных из ризосферы генеративных особей D. incarnata, на прорастание семян, морфогенез и рост пальчатоко-ренника мясокрасного в культуре in vitro. Использование КЖ ассоциативных бактерий - Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225 и P. brassicacearum GRT221, выделенных из ризосферы D. incarnata, в качестве дополнительных биологически активных компонентов модифицированной питательной среды Кнудсона можно считать эффективным для ускорения прорастания зрелых семян и повышения их всхожести, увеличения темпов развития проростков, линейных размеров формирующихся ортотропного побега и придаточных корней, накопления сырой массы. Наиболее выраженное стимулирующее действие отмечено для КЖ штамма Р. chlororaphis subsp. aurantiaca GRP225, что открывает перспективы его применения в технологии культивирования in vitro редких и охраняемых видов орхидных средней полосы европейской части России для их сохранения и воспроизводства.

Ключевые слова

Pseudomonas, орхидные, протокорм, ювенильное растение, супернатант, индолил-3-уксусная кислота, Pseudomonas, Orchidaceae, protocorm, juvenile plant, supernatant, indole-3-acetic acid

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Сидоров Андрей ВладимировичЯрославский государственный университет им. П.Г. Демидоваассистент кафедры ботаники и микробиологии, факультет биологии и экологииsidan43@yandex.ru
Зайцева Юлия ВладимировнаЯрославский государственный университет им. П.Г. Демидоваканд. биол. наук, доцент кафедры ботаники и микробиологии, факультет биологии и экологииzjv9@mail.ru
Маракаев Олег АнатольевичЯрославский государственный университет им. П.Г. Демидоваканд. биол. наук, доцент кафедры ботаники и микробиологии, факультет биологии и экологииmarakaev@uniyar.ac.ru
Всего: 3

Ссылки

Backer R., Rokem J.S., Ilangumaran G. et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture // Front Plant Sci. 2018. Vol. 9. P. 1473. doi: 10.3389/ fpls.2018.01473
Tsavkelova E.A., Cherdyntseva T.A., Netrusov A.I. Auxin production by bacteria associated with orchid roots // Microbiology. 2005. Vol. 74, № 1. PP. 46-53. doi: 10.1007/s11021-005-0027-6
Bhattacharya A. Siderophore mediated metal uptake by Pseudomonas fluorescens and its comparison to iron (III) chelation // Cey. J. Sci. (Bio. Sci.). 2010. Vol. 39, № 2. PP. 147155. doi: 10.4038/cjsbs.v39i2.3001
Бурова Ю.А., Ибрагимова С.А., Ревин В.В. Исследование содержания биологически активных веществ в культуральной жидкости бактерии Pseudomonas aureofaciens при хранении // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2012. Т. 8, № 3. С. 26-30.
Simons M., Bij A.J.I., Brand L.A.W., Wijffelman C.A., Lugtenberg B.J.J. Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria // MPMI. 1996. № 9. PP. 600-607. doi: 10.1094/mpmi-9-0600
Сидоренко О.Д. Действие ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйственных культур // Агрохимия. 2001. № 8. С. 56-62.
Ali B., Hasnain S. Potential of bacterial indoleacetic acid to induce adventitious shoots in plant tissue culture // Letters in Applied Microbiology. 2007. Vol. 45. PP. 128-133. doi: 10.1111/j.1472-765X.2007.02158.x
Бурова Ю.А., Ибрагимова С.А., Ревин В.В. Действие культуральной жидкости бактерий Pseudomonas aureofaciens на развитие семян пшеницы и фитопатогенных грибов // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2012. Вып. 3. С. 198-206.
Саламатова Ю.А., Минаева О.М., Акимова Е.Е. Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов в жидкой форме // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2010. № 1 (9). С. 20-28.
Tsavkelova E.A., Cherdyntseva T.A., Botina S.G., Netrusov A.I. Bacteria, associated orchid roots and microbial production of auxin // Microbiol. Res. 2007. Vol. 162. PP. 69-76. doi: 10.1016/j.micres.2006.07.014
Шеховцова Н.В., Первушина К.А., Маракаев О.А., Холмогоров С.В., Осипов Г.А. Микроорганизмы, ассоциированные с подземными органами орхидных средней полосы России // Проблемы агрохимии и экологии. 2010. № 4. С. 30-36.
Knudson L. Nonsymbiotic germination of orchid seeds // Bot Gazette. 1922. Vol. 73. PP. 1-25.
Wilkinson K.G., Dixon K.W., Sivasithamparam K. et al. Effect of IAA on symbiotic germination of an Australian orchid and its production by orchid-associated bacteria // Plant Soil. 1994. Vol. 159. PP. 291-295. doi: 10.1007/BF00009292
Teixeira J.A., Tsavkelova E.A., Zeng S., Tzi Bun Ng., Parthibhan S., Dobranszki J., Cardoso J., Rao M.V Symbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium: fungal and bacterial partners and their influence on plant growth and development // Planta. 2015. Vol. 242, № 1. PP. 1-22. doi: 10.1007/s00425-015-2301-9
Pavlova A.S., Leontieva M.R., Smirnova T.A., Kolomeitseva G.L., Netrusov A.I., Tsavkelova E.A. Colonization strategy of the endophytic plant growth-promoting strains of Pseudomonas fluorescens and Klebsiella oxytoca on the seeds, seedlings and roots of the epiphytic orchid, Dendrobium nobile Lindl. J // Appl Microbiol. 2017. Vol. 123, № 1. PP. 217-232. doi: 10.1111/jam.13481
Вахрамеева М.Г, Варлыгина Т.И., Татаренко И.В. Орхидные России (биология, экология и охрана). М. : Товарищество научных изданий КМК, 2014. 437 с.
Вахрамеева М.Г. Род Пальчатокоренник // Биологическая флора Московской области. М., 2000. Вып. 14. С. 55-86.
Маракаев О.А. Семейство Орхидные - Orchidaceae // В: Красная книга Ярославской области / под ред. М.А. Банковского. Ярославль : Академия 76, 2015. С. 114-138.
Черевченко Т.М., Кушнир Г.П. Орхидеи в культуре. Киев : Наукова думка, 1986. 197 с.
Коломейцева Г.Л., Антипина В.А., Широков А.И., Хомутовский М.И., Бабоша А.В., Рябченко А.С. Семена орхидей: развитие, структура, прорастание. М. : Геос, 2012. 352 с.
Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. вузов. М. : Высшая школа, 1990. 352 с.
Zhao Y. Auxin biosynthesis and its role in plant development // Annu Rev Plant Biol. 2010. Vol. 61. PP. 49-64. doi: 10.1146/annurev-arplant-042809-112308
Saini S., Sharma I., Kaur N., Pati P.K. Auxin: a master regulator in plant root development // Plant Cell Rep. 2013. Vol. 32, № 6. РР. 741-757. doi: 10.1007/s00299-013-1430-5
Faria D.C., Dias A.C., Melo I.S., de Carvalho Costa F.E. Endophytic bacteria isolated from orchid and their potential to promote plant growth // World J Microbiol Biotechnol. 2013. Vol. 29, № 2. PP. 217-221. doi: 10.1007/s11274-012-1173-4
Шеховцова Н.В., Маракаев О.А., Первушина К.А., Холмогоров С.В., Цапляева К.Г. Образование ауксинов эндофитными бактериями подземных органов Dactylorhiza maculata (L.) Soo (Orchidaceae) // Вестник Оренбургского государственного университета. 2011. № 12(131). С. 366-368.
Куликов П.В., Филиппов Е.Г. Прорастание семян и развитие проростков in vitro у некоторых орхидных умеренной зоны // Экология и интродукция растений на Урале. Свердловск: УрО АН СССР, 1991. С. 39-43.
Андронова Е.В., Батыгина Т.Б., Васильева Е.В. Протокорм // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции / под ред. Т.Б. Батыгиной, СПб., 2000. С. 324-329.
Иванников Р.В. Обусловленность морфогенеза первичного протокорма орхидных // Вестник Тверского государственного университета. Серия: Биология и экология. 2008. Вып. 9. С. 76-85.
Schaller G.E., Bishopp A., Kieber J.J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development // The Plant Cell. 2015. Vol. 27, № 1. РР. 44-63. doi: 10.1105/tpc.114.133595
Nongdam P, Tikendra L. Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol for rapid and mass propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. using seed culture // Scientific World Journal. 2014. Vol. 2014. PP 1-8. doi: 10.1155/2014/740150
Deb C.R., Temjensangba I. In vitro propagation of threatened terrestrial orchid, Malaxis khasiana Soland ex. Swartz through immature seed culture // Indian J. Exp Biol. 2006. Vol. 44, № 9. РР. 762-766.
Зайцева Ю.В., Сидоров А.В., Маракаев О.А, Хмель И.А. Растительно-микробные взаимодействия с участием Quorum Sensing регуляции // Микробиология. 2019. № 88 (5). С. 519-531. doi: 10.1134/S0026261719040131
 Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий рода<i> Pseudomonas</i> на прорастание, морфогенез и рост <i>Dactylorhiza incarnata </i>(L.) Soo (Orchidaceae) в культуре <i>in vitro</i> | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2020. №  51. DOI: 10.17223/19988591/51/1

Влияние культуральной жидкости ассоциативных бактерий рода Pseudomonas на прорастание, морфогенез и рост Dactylorhiza incarnata (L.) Soo (Orchidaceae) в культуре in vitro | Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 2020. № 51. DOI: 10.17223/19988591/51/1