Development of spectral techniques for the analysis of biological objects of animal origin.pdf Введение С появлением новых лекарственных препаратов возникает необходимость проведения их испытаний. При этом ни одно исследование нового препарата не может обойтись без испытания на животных. Это позволяет определить фармакологические эффекты, механизм действия и локализацию действующих веществ, а также процессы, происходящие с лекарственным средством в организме. Помимо этого, такие опыты помогают выявить различные неблагоприятные побочные эффекты, связанные с применением лекарственных препаратов, во избежание проявления их у пациентов в будущем. Наиболее часто для этих целей используют альбиносов норвежских крыс, или, по-другому, «лабораторных» крыс. Они используются в поведенческих, физиологических, медицинских и других видах исследований уже более века [1]. В работе проводилось определение элементного состава тканей внутренних органов (мозг, сердце, печень, почки, а также кровь) лабораторных крыс для оценки распределения химических элементов в организме животных [2]. Для элементного анализа объектов растительного и животного происхождения целесообразно использовать метод дуговой атомно-эмиссионной спектроскопии, позволяющий проводить определение элементного состава более чем на 30 элементов с погрешностью, не превышающей 20 отн. % [3-7]. Количественное определение макро- и микроэлементов в различных органах подопытных животных проводили методом дуговой атомно-эмиссионной спектроскопии (ДАЭС) с использованием комплекса «Гранд», включающего спектроаналитический генератор «Везувий-3», по-лихроматор «Роуланд» и многоканальный анализатор эмиссионных спектров - МАЭС (НПО «Оптоэлектроника», Россия), и методом пламенной фотометрии (ПФ) с использованием атомно-абсорбционного спектрометра Solaar серии S. Экспериментальная часть Анализируемые образцы тканей подопытных крыс высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре (105 ± 5)°С. Предварительно взвешенные сухие пробы растирали во фторопластовой ступке и переносили в предварительно прокаленные кварцевые чашки. Для анализа методом ДАЭС с МАЭС проводили озоление до полного разрушения исследуемого образца. Установив кварцевые чашки в холодную муфельную печь, постепенно нагревали их до температуры (550 ±5)оС. Выдерживали пробы при такой температуре до постоянной массы. Полученную золу тканей крыс разбавляли графитовым порошком в соотношении 1:10 и 1:100, навески полученной смеси по 15 мг помещали в графитовый электрод. Затем в стандартные образцы при анализе пробы, разбавленной 1:10, в каждый электрод вводилась корректирующая добавка в соответствии с содержанием в анализируемой пробе преобладающего элемента, при введение корректирующей добавки учитывался ее анионный состав. При разбавлении пробы 1:100 добавляли легко ионизуемый носитель NaCl - 3% по катиону для стабилизации условий поступления элементов в дуговой разряд. Определение основных жизненно необходимых (эссенциальных) элементов осуществлялось при разбавлении пробы 1:100, определение токсичных микроэлементов проводилось при разбавлении 1:10. Съемку спектров проводили при условиях: I = 13 A, т = 20 c. Для определения щелочных металлов методом ПФ зольные остатки растворяли в 0,2 мл HCl (См = 6 М) при умеренном нагревании на электрической плите. Полученный раствор отфильтровали от осадка через фильтр «красная лента» в пробирку объемом 5 мл и доводили раствор до метки бидистил-лированной водой. Скрининговый анализ по основным компонентам, проведенный методами ДАЭС с МАЭС и ПФ, приведен в табл. 1. Из таблицы видно, что содержание калия и натрия на порядок и более превосходит содержание других элементов. Соответственно остальные элементы не будут оказывать значительного влияния на правильность проведения спектрального анализа на регламентируемые примеси. Так же известно, что значительное матричное влияние может оказывать и анионный состав присутствующих в золе макроэлементов. Т аб л иц а 1 Содержание макроэлементов в золе тканей крыс, определенное методом ДАЭС с МАЭС (разбавление 1:100) и ПФ (n = 5, P = 0,95) Определяемый ПФ ДАЭС с МАЭС элемент / орган K, мг/г Na, мг/г P, мг/г Mg, мкг/г Ca, мкг/г Мозг 135 ± 12 60 ± 5 10 ± 9 480±110 290 ± 60 Сердце 131 ± 12 46 ± 4 8 ± 2 960 ± 190 190 ± 40 Кровь 246 ± 20 200 ± 22 2,0 ± 0,6 200 ± 40 270 ± 60 Печень 207 ± 25 23 ± 3 12 ± 2 900 ± 180 100 ± 20 Почки 203 ± 25 107 ± 11 10 ± 3 450±100 200 ± 40 Для установления молекулярной составляющей зольного остатка тканей подопытных крыс использовали метод ИК-спектроскопии с использованием Фурье-спектрометра Nicolet 380 фирмы Thermo Electron Corporation (США). Отобранные пробы объектов помещали в агатовую ступку, перетирали с KBr и прессовали в таблетку диаметром 2 мм. Спектр снимали в режиме «пропускание», количество сканирований - 32. Полученные спектры представлены на рис. 1. Мозг Сердце Рис. 1. Анионный состав золы органов подопытных крыс. Обозначения см. на с. 40 Печень Кровь Почки Рис. 1. Анионный состав золы органов подопытных крыс: - CO32--mnbi; ^^ - PO43--ионы; - SO42--ионы; - NOз--ионы Рис. 2. Обобщенная модель распределения примесей в органах крыс Таким образом, при разработке методик спектрального анализа органов подопытных животных на микропримеси необходимо учитывать матричные влияния солей для каждого конкретного органа. Для этого следует строго рассчитать концентрацию по катиону в анализируемом образце и добавить в соответствии с анионным составом в стандартные образцы на графитовой основе. Содержание катиона в анализируемом образце и стандартах на графитовой основе должно строго соответствовать. Для проверки эффективности данного способа учета матричного влияния был использован стандартный образец состава ткани трески (MODAS-4 Cormorant Tissue, Польша). Выбор стандартного образца обусловлен близостью по химическому составу и биологическому происхождению с анализируемыми образцами. Предварительный анализ стандарта показал, что основа зольных остатков преимущественно состоит из K3PO4 с примесями (K/Na)2SO4, (K/Na)2CO3. Спиртовый раствор фосфата калия вводился в стандартные образцы на графитовой основе в строгом соответствии с содержанием его в стандартном образце состава ткани трески. Полученные результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что корректирующая добавка существенно улучшает правильность проведения анализа. По критерию Стьюдента расхождение результатов незначимо на фоне случайного разброса. Результаты, представленные в табл. 1 и рис. 1, можно отобразить в виде обобщенной модели распределения примесей в органах крыс (рис. 2). Таблица 2 Содержание микроэлементов в стандартном образце состава ткани трески MODAS-4 Cormorant Tissue с учетом введения корректирующей добавки K3PO4 в стандартные образцы (P = 0,95, n = 10, Uаб = 2,28) Элемент Аттестованное значение, мкг/г Определенное содержание без добавки K3PO4, мкг/г /эксп Определенное содержание c добавкой K3PO4, мкг/г tэксп Ca 258 170 ± 50 5,56 263 ± 33 0,48 Zn 63,4 45 ± 13 4,47 58 ± 10 1,71 Cu 19,5 11 ± 3 8,95 18 ± 2 0,79 Rb 13,4 18 ± 5 2,91 12 ± 3 1,47 Pb 2,33 3,8 ± 1,9 2,44 2,6 ± 0,5 1,71 Mn 2,16 2,8 ± 0,8 2,53 2,0 ± 0,3 1,69 Co 0,041 0,08 ± 0,04 3,08 0,05 ± 0,02 1,42 Таблица 3 Содержание элементов в тканях органов подопытных крыс, определенное методом ДАЭС с МАЭС и ПФ (n = 5, P = 0,95) Метод Орган / определяемый элемент Мозг Сердце Кровь Печень Почки K, мг/г 15 ± 1,5 15 ± 1,5 26,6 ± 2,7 24,7 ± 2,5 24,3 ± 2,4 ПФ Na, мг/г 6,6 ± 0,7 3,6 ± 0,4 22 ± 2 3,3 ± 0,3 12 ± 1 Li, мкг/г 8,8 ± 0,9 3,6 ± 0,4 20 ± 2 5,2 ± 0,5 11 ± 1 P, мг/г 19 ± 8 11 ± 2,2 3,0 ± 0,7 24 ± 5 14 ± 3 Ca, мкг/г 390 ± 80 290 ± 60 390 ± 80 0,21 ± 0,04 240 ± 50 Mg, мкг/г 580±120 1 060±210 270 ± 50 1,4 ± 0,3 550±110 Si, мкг/г 130 ± 30 230 ± 50 28 ± 6 0,038 ± 0,008 180 ± 40 Fe, мкг/г 260 ± 50 50 ± 10 200 ± 40 0,06 ± 0,01 26 ± 5 ДАЭС с МАЭС Zn, мкг/г 50 ± 10 60 ± 13 35 ± 7 0,17 ± 0,03 90 ± 20 Al, мкг/г 29 ± 6 0,014 ± 0,003 8 ± 2 0,022 ± 0,004 1,2 ± 0,2 Mn, мкг/г 6 ± 1 5 ± 1 0,10 ± 0,02 0,020 ± 0,004 6 ± 1 Cd, мкг/г 3,6 ± 0,7 3,7 ± 0,7 0,14 ± 0,03 14 ± 3 2,3 ± 0,5 Ni, мкг/г 6 ± 1 6 ± 1 - - - Ba, мкг/г 0,9 ± 0,2 3,3 ± 0,7 0,6 ± 0,1 1,8 ± 0,4 0,13 ± 0,03 Co, мкг/г 0,18 ± 0,04 0,14 ± 0,03 0,04 ± 0,01 0,30 ± 0,06 0,7 ± 0,1 Cr, мкг/г 0,06 ± 0,01 4,6 ± 0,9 11 ± 2 0,13 ± 0,03 0,037 ± 0,007 Cu, мкг/г 0,20 ± 0,04 2,3 ± 0,5 7 ± 2 0,005 ± 0,001 30 ± 6 С учетом данных рекомендаций проведен полный спектральный анализ органов подопытных крыс, результаты представлены в табл. 3. Заключение С целью оптимизации условий проведения спектрального анализа для устранения матричных влияний на стадии пробоподготовки методами ДАЭС с МАЭС и ПФ проведен скрининговый анализ на содержание основных элементов в зольном остатке органов подопытных крыс. Показано, что основными элементами зольного остатка являются калий, натрий и фосфор, причем содержание калия на порядок и более превосходит содержание других элементов. Методом ИК-спектроскопии установлен анионный состав зольных остатков анализируемых объектов. Показана возможность устранения матричных влияний путем непосредственного введения корректирующей добавки в стандартные образцы на графитовой основе перед проведением анализа. Разработанные подходы устранения матричных влияний при проведении спектрального анализа путем введения корректирующих добавок положены в основу создания методик количественного химического анализа биологических объектов животного происхождения. По разработанным методикам проведен анализ тканей подопытных крыс, используемых при создании лекарственных препаратов ритмомодулирующего действия.

Скачать электронную версию публикации