Identification of the most specific volatile metabolites by gas chromatography in the exhaled breath of lung cancer pati.pdf Введение Бронхолегочные заболевания дают основной вклад в смертность от онкологических заболеваний. Это обусловлено тем, что 84% случаев диагностируется на поздних стадиях. Например, в мире в 2008 г. было выявлено 1,5 млн случаев заболеваний раком легких (РЛ) и 1,3 млн смертельных исходов от данной формы онкологии [1, 2]. Одной из главных проблем в данной области остается позднее выявление злокачественных опухолей в амбулаторно-поликлинических учреждениях. Наиболее эффективными считаются методы неинвазивной диагностики злокачественных новообразований, использующие рентгенологические, магнитно-резонансные, радионуклидные методы исследования [3]. Особые перспективы имеет неинвазивная диагностика бронхолегочных заболеваний на основе анализа компонентного состава проб выдыхаемого воздуха. Например, в работах [4-9] было выявлено статистически значимое повышение концентрации ЭТ-1 в конденсате выдыхаемого воздуха у больных с немелкоклеточным РЛ по сравнению со здоровыми добровольцами, обнаружено повышение концентрации бутанола-1 и 3-гидрокси-2-бутанона в выдыхаемом воздухе больных РЛ, которое свидетельствует об усилении окислительных процессов, характерных для рака, с помощью метода газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и дискрими-нантного анализа обнаружены десятки летучих соединений, концентрация которых существенно менялась в зависимости от заболевания. Также в работе [10] было установлено, что в сравнении с выдыхаемым воздухом здоровых людей [11] при раке легкого наблюдается повышенное содержание алканов, таких как гексан, метилпентан и производные бензола [10, 12], стирина, производных гептана, декана, производных циклопен-тана, октана, бутадиен циклогексана, гепатенала, нонана [13]. Данные результаты были получены методом ГХ-МС. В работе [12] при помощи метода ГХ-МС были зарегистрированы при раке легких повышенные концентрации смеси ацетона, метилкетона и n-пропанола. В данной работе с помощью метода ГХ-МС осуществлялся поиск наиболее специфических летучих метаболитов на основе компонентного состава проб выдыхаемого воздуха (ПВВ). Для реализации поставленной цели нужно было решить следующие задачи: 1. Разработать условия газохроматографического разделения летучих органических соединений в газовых биопробах. 2. Идентифицировать с помощью ГХ-МС летучие органические соединения (ЛОС) в выдыхаемом воздухе. 3. Перенести разработанные на ГХ-МС условия на газовый хроматограф. 4. Проанализировать серию образцов ПВВ. Экспериментальная часть Отбор проб. Выдыхаемый воздух отбирался при помощи пробоотборника Bio-VOC breath sampler объемом 100 мл (рис. 1). Условия отбора проб выдыхаемого воздуха от добровольцев заключались в следующем: 1) забор проб осуществлялся натощак, утром в одно и то же время, до приема пищи, для курящих - до курения в день отбора пробы; 2) перед взятием пробы выдыхаемого воздуха доброволец многократно прополаскивал ротовую полость кипяченой водой (при отсутствии - проточной водой). Во время отбора пробы доброволец трижды спокойно (до полного опустошения легких) выдыхал через одноразовый мундштук. Далее пробоотборник закрывался пробкой и вкручивался поршень, что обеспечивало стабильность хранения пробы при транспортировке. Пробоотборник Bio-VOC breath sampler использовался многократно с применением нового мундштука после обязательной процедуры очистки. Рис. 1. Пробоотборник Bio-VOC breath sampler Для осуществления транспортировки всех отобранных проб применялся специальный ящик для перевозки медицинских анализов, который поддерживает температуру, близкую к комнатной, внутри ящика во время транспортировки. Время транспортировки и хранения проб выдыхаемого воздуха составляло не более 4 ч. Микроэкстракция летучих органических соединений. Уровень концентрации летучих органических соединений в газовых биопробах очень мал, следовательно, используемый аналитический метод должен включать в себя этап концентрирования. Альтернативой этим методам является твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ), которая позволяет достичь пределов обнаружения летучих органических соединений в выдыхаемом воздухе на уровне 1 ppm и ниже. Адсорбцию ЛОС осуществляли из пробоотборника путем погружения иглы шприца Supelco, содержащей внутри нее для инжекции стержень, покрытый неподвижной жидкой фазой состава Carbox-en/Polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) 85 мкм, в анализируемый воздух. Для полноты извлечения веществ время адсорбции составляло 30 мин при комнатной температуре. Анализ данных. Качественное определение летучих органических соединений в выдыхаемом воздухе осуществляли с использованием комплекса, состоящего из газового хроматографа Finnigan Trace GS и масс-спектрометра Finnigan Trace DSQ при следующих оптимальных условиях: способ ионизации - электронный удар; колонка Supel-Q™ PLOT длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм (производитель Thermo Scientific); температура испарителя 200°C; температура интерфейса 200°C; температура термостата 40°С в течение 1 мин, увеличение температуры до 250°С со скоростью 10°С/мин; газ-носитель - гелий (марка «60»); диапазон сканирования масс 50-650 а.е.м. Обработку полученных данных проводили в программе Qual Browser программного обеспечения Xcalibur. Для идентификации летучих органических соединений полученные спектры веществ в анализируемой пробе сравнивали со спектрами веществ в библиотеке масс-спектров NIST MS ' Л Search 2.0. Соединение считалось идентифицированным на хроматограм-ме, если его сигнал превышал по высоте уровень шума в два раза, а вероятность присутствия составляла >90%. Однако некоторые компоненты не были идентифицированы, что связано с селективностью детектирования и идентификацией спектров и обусловлено совпадением величин M/z для соединений. Использование газохроматографического анализа позволяет довести технологию диагностики рака легких на основе исследования летучих метаболитов в выдыхаемом воздухе до уровня рутинных применений. Поэтому в рамках клинического исследования было решено перенести методику определения летучих метаболитов на газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором с целью понижения стоимости анализа и демонстрации возможности использования газохроматографического оборудования в этой области исследования. Идентификацию веществ методом газовой хроматографии осуществляли по временам удерживания компонентов. Для этого использовались индивидуальные вещества, которые представляли собой Государственные стандартные образцы (ГСО) и стандартные образцы предприятия (СОП). Образцы вводились с помощью газового микрошприца в количестве 0,2 мкл в устройство ввода пробы газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000.2» с пламенно-ионизационным детектором при следующих условиях анализа: колонка Supel-QTM PLOT длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм; температура термостата колонок 40°С в течение 1 мин, увеличение температуры до 250°С со скоростью 10°С/мин; температура испарителя 200°С; температура инжектора 200°С; газ-носитель - гелий (марка «А»). На рис. 2-3 приведены типичные хроматограммы анализа выдыхаемого воздуха больного раком легких и здорового добровольца соответственно. По временам удерживания на хроматограммах в условиях ГХ-анализа идентифицировано 19 компонентов. Из приведенных хроматограмм видно, что в выдыхаемом воздухе больного раком легких присутствует большее количество компонентов по сравнению с выдыхаемым воздухом здорового человека. Хочется отметить, что некоторые вещества (метиленхлорид, пентан и ацетонитрил), обнаруженные у онкологических больных, также присутствуют в газовых образцах здоровых людей с меньшим содержанием. Кроме того, в пробах группы контроля наблюдается присутствие в незначительных количествах толуола. Рис. 2. Хроматограмма выдыхаемого воздуха больного раком легких: 1 - метанол; 2 - этанол; 3 - ацетонитрил; 4 - ацетон; 5 - метиленхлорид; 6 - пентан; 7 - этилацетат; 8 - гексан; 9 - бензол; 10 - хлоропропиленоксид; 11 - N-этилформамид; 12 - октан; 13 - толуол; 14 - бутилацетат; 15 - хлорбензол; 16 - о-ксилол; 17 - декан Также были отсняты бланковые хроматограммы фазы шприца Supelco и воздуха, отобранного из аудитории, где проводился анализ. Проведенные испытания дали отрицательный результат, что свидетельствует о том, что все вещества, которые были зарегистрированы на хроматограммах анализа проб выдыхаемого воздуха, были извлечены непосредственно из выдыхаемого воздуха добровольцев. Фаза со шприца и пробоотборник погрешности в анализ не вносят. Результаты и их обсуждение При проведении количественного расчета измеряли отклик анализируемого компонента на регистрируемой хроматограмме и по построенной градуировочной зависимости рассчитывали его концентрацию. На основе полученных результатов выявлены наиболее специфические летучие метаболиты с точки зрения разделения пациентов, страдающих раком легких и здоровых добровольцев. В табл. 1-2 показаны площадь пика и соответствующие концентрации ЛОС в ПВВ больных РЛ и здоровых добровольцев по 10 человек в каждой группе. Из сравнения табл. 1-2 видно, что: - метиленхлорид, пентан, ацетонитрил, толуол присущи больным РЛ и здоровым с изменением вклада, следовательно, в качестве наиболее специфичных метаболитов они могут использоваться только с применением методов статистической обработки; - у всех больных раком легких обнаруживается О-ксилол, следовательно, его можно использовать как достаточное условие в качестве наиболее специфичного летучего метаболита с точки зрения разделения больных раком легких и здоровых добровольцев. Концентрации ЛОС в ПВВ больных РЛ Концентрации ЛОС в ПВВ здоровых добровольцев Т а б л и ц а 1 Наименование Площадь пика (концентрация, ppm) вещества 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Метанол 3,95 0 0,31 0,58 0 0 0 0 0,33 0,81 (1,09) (0,02) (0,10) (0,03) (0,17) Этанол 8,5 0 0 0 0 0 0 0 0,527 0 Ацетонитрил 4,04 0 0,57 1,05 2,18 1,28 2,34 1,47 2,43 2,50 (0,37) (0,20) (0,22) (0,28) (0,23) (0,29) (0,24) (0,29) (0,30) Ацетон 1,90 0 2,95 4,49 1,13 0 1,73 0,56 5,58 0 (0,04) (0,06) (0,08) (0,03) (0,04) (0,02) (0,10) Метиленхлорид 1,6 11,98 8,70 10,03 3,52 6,65 4,91 7,97 11,54 3,99 Пентан 3,13 3,51 1,25 1,18 4,74 4,13 1,29 5,35 1,05 4,88 Этилацетат 16,38 (0,07) 0 0,35 (0,02) 0,35 (0,02) 0 0 0 0 0 1,11 (0,02) Гексан 15,06 0 2,07 3,42 0,94 6,34 8,30 1,51 5,03 0 Бензол 82,34 0,43 14,64 13,13 0 5,16 5,57 1,19 228,7 0 Хлоропропиле-ноксид 4,513 0 0 0 35,57 2,77 10,96 3,563 0 1,11 N-этилформамид 20,04 0 0 0 0 0 0 0 0 Октан 2,35 0,32 6,32 9,29 0 0 0 0 0 0 Толуол 29,67 0,29 10,21 14,00 5,42 9,08 19,50 6,978 33,62 0,90 (0,13) (0,09) (0,10) (0,11) (0,10) (0,10) (0,12) (0,10) (0,13) (0,09) Бутилацетат 7,51 0,42 0 0 0 0 0 0 0 0 Хлорбензол 3,01 0 0 0,78 0 0 0 0 86,03 0,66 О-ксилол 4,32 (0,04) 0,37 (0,03) 3,486 (0,04) 4,80 (0,04) 6,59 (0,04) 7,59 (0,04) 38,55 (0,07) 10,72 (0,05) 68,68 (0,09) 0,66 (0,04) Декан 3,26 0 2,40 2,68 0 0 13,84 0 0 0 Т а б л и ц а 2 Наименование вещества Площадь пика (концентрация, ppm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Метанол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Этанол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ацетонитрил 0,52 (0,20) 0,44 (0,19) 0,58 (0,20) 0,52 (0,20) 0 0 0 0 0 0 Ацетон 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Метиленхлорид 0,92 1,03 0,94 1,29 1,19 3,24 3,46 12,72 3,23 3,11 Пентан 0,34 0,75 0,50 0,58 1,42 1,87 1,28 1,74 2,81 2,62 Этилацетат 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Гексан 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Бензол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Наименование вещества Площадь пика (концентрация, ppm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Хлоропропиле-ноксид 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N-этилформамид 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Октан 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Толуол 0 0 0 0 0 1,51 (0,1) 0,66 (0,09) 0,53 (0,09) 0 0 Бутилацетат 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Хлорбензол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 О-ксилол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Декан 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 С помощью данной методики было установлено, что в сравнении с выдыхаемым воздухом здоровых людей при раке легких наблюдается повышенное содержание алканов, таких как гексан, октан и декан, производных бензола, а также этилацетата и N-этилформамида. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования газовой хроматографии совместно с ТФМЭ в рамках клинического исследования состава выдыхаемого воздуха на уровне микроконцентраций детектируемых веществ. Количественное определение ЛОС в пробах выдыхаемого воздуха возможно осуществлять на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Такой анализ является актуальным и перспективным подходом для развития новых методов исследований и диагностики в биомедицине и может использоваться как в целях выявления заболевания на ранних стадиях, предсказания реакции организма на конкретный вид лечения, так и для мониторинга эффективности проводимой терапии.

Скачать электронную версию публикации