The influence of nanocrystalline gadolinium-doped ceria (Cei_,Gd,O₂_y) on the functional status and viability.pdf Введение Диоксид церия находит широкое применение во многих промышленных приложениях, в том числе в составе абразивов [1], катализаторов [2] и топливных элементов [3]. Высокий уровень кислородной нестехиометрии и связанная с этим редокс-активность, а также низкая токсичность и биосовместимость делают нанокристаллический диоксид церия весьма перспективным материалом и для биомедицинских приложений. Показано, что наночастицы диоксида церия обладают антиоксидантными [4], кар-диопротекторными [5], гепатопротекторными [6], геропротекторными [7], генопротекторными [8], радиопротекторными [9] свойствами, способны выступать в качестве эффективных УФ-фильтров [10] и стимулировать пролиферацию клеток in vitro [11-12]. Допирование диоксида церия различными металлами, в частности гадолинием, приводит к изменению физико-химических характеристик наночастиц и придает им новые функциональные свойства. Как известно, ион Gd3+ имеет 7 неспаренных электронов (8S7/2) и обладает высоким магнитным моментом (7,94 цВ), что позволяет использовать гадолинийсодержащие соединения в качестве контрастирующих агентов в магнитно-резонансной томографии (МРТ). Оксид гадолиния в нанокристаллическом состоянии является одним из перспективных контрастирующих агентов для МРТ, поскольку он характеризуется более высоким значением констант продольной релаксации по сравнению с хе-латными комплексами Gd3+ [13]. Следует отметить, что оксид гадолиния существенно менее токсичен, чем соли гадолиния [14-15]. Допирование диоксида церия ионами Gd3+ позволяет повысить его кислородную нестехиометрию [16], а следовательно, и антиоксидантную активность, что открывает новые направления использования данного соединения в биомедицинских целях. В связи с этим возникает необходимость комплексного исследования влияния диоксида церия, допированного гадолинием, на функциональное состояние и жизнеспособность клеток. В настоящей работе было впервые проведено исследование влияния стабилизированных водных золей наночастиц Ce1-xGdxO2-y на функциональное состояние мышиных фибробла-стов линии NCTC clone L929. Экспериментальная часть Синтез золя Ce1-xGdxO2-y (x = 0,2) был выполнен по методике, описанной ранее [17], включающей дополнительную стабилизацию цитратом аммония. Для очистки от примесей 1 мл золя (0,01 М) смешали с 2 мл изо-пропилового спирта (70%) и нагревали в течение 30 мин при температуре ~80°С при перемешивании. Далее раствор центрифугировали при 9 000 g в течение 10 мин при 20°С и полученный осадок редиспергировали в 500 мкл изопропилового спирта (99,9%). Эту процедуру повторили трижды. Полученный осадок высушили в сушильном шкафу при 50°С, а затем редиспергировали в 500 мкл деионизованной воды. Золь довели до рН 7.2 10%-ным водным раствором аммиака. Определение гидродинамического диаметра наночастиц в золях проводили методом динамического светорассеяния на анализаторе N5 Submicron Particle Size Analyser «Beckman Coulter». Оценку проводили для дисперсий на основе деионизованной воды, культуральной среды F12 (HEPES) и культуральной среды F12 (HEPES), содержащей 5%-ную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). ^-потенциал золей измеряли с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK). Спектры поглощения водного золя наночастиц Ce1-xGdxO2-y регистрировали с использованием УФ-спектрофотометра Lambda-45 (Perkin Elmer, USA). Анализ цитотоксичности проводили на линии клеток из коллекции клеточных культур Института биофизики клетки РАН: NCTC clone L929 -фибробласты, полученные из клеток подкожной соединительной ткани мышей СЗН/An (Flow Laboratories, Великобритания, J. Nat. Cancer Inst. 1948, 9, 229). Клетки высевали в 96-луночные планшеты в плотности 20 тыс/см2 в среде ДМЕМ^12 (1:1) с добавлением 5%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина и культивировали в условиях 5%-ной СО2 и температуре 37°С. Уровень дегидрогеназной активности клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 и 72 ч в атмосфере, содержащей 5% СО2 при 37°С. Через 6 ч после посева клеток среда заменялась на среду, содержащую наночастицы Ce1-xGdxO2-y в концентрациях 10-4-10-9 М. В качестве контроля использовали клетки со средой, но без добавления Ce1-xGdxO2-y. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с клетками, в которые вносили 10% ДМСО (10 мкл). Через 24 и 72 ч после внесения наночастиц Ce1-xGdxO2-v среду во всех лунках заменяли на среду, содержащую 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразол (5 мкг/мл), а затем проводили МТТ-тест по стандартной методике [18]. Оптическую плотность определяли на длине волны X = 540 нм с использованием фотоколориметра «BIO-RAD model 680». Концентрацию свободной лактатдегидрогеназы, которая обнаруживается в культуральной среде в случае повреждения клеточной мембраны, оценивали колориметрически. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 ч в атмосфере, содержащей 5% СО2 при 37°С. Через 6 ч после посева клеток среду заменяли на среду, содержащую нано-частицы Ce1-xGdxO2-y в концентрациях 10-4-10-9 М. В качестве положительного контроля использовали клетки со средой, но без добавления Ce1-xGdxO2-y. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с клетками, в которые вносили Тритон Х-100 (10 мкл). Через 24 ч после внесения наночастиц Ce1-xGdxO2-3, определяли уровень лактатдегидрогеназы в культуральной среде в соответствии с протоколом производителя (The Thermo Scientific™ Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit). Оптическую плотность растворов определяли на длине волны X = 490 нм и X = 640 нм с использованием фотоколориметра Microplate Reader Thermo Multiskan Ascent 96 & 384 (Thermo Fisher Scientific, United Kingdom). Анализ уровня АФК проводили с помощью 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетата - красителя, который диффундирует через липидную мембрану в клетку и впоследствии окисляется внутриклеточными АФК, образуя сильнофлуоресцирующий дихлорфлуоресцеин. Клетки предынкубировали с наночастицами Ce1-xGdxO2-y в различных концентрациях в течение 24 ч в 96-луночном планшете, после чего среду заменяли на раствор Хэнкса, содержащий 2,7-DCFH-DA (100 мкМ) (Sigma, USA). В качестве отрицательного контроля использовали 1 мМ раствор перекиси водорода (Sigma, USA). Анализ проводили по окрашиванию клеток специфическим флуоресцентным красителем дигидроэтидиумом (60 мкМ) (Sigma, USA). Интенсивность флуоресценции детектировали с использованием планшетного ридера FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH (Offenburg, Germany) при 485 нм/520 нм для 2',7'-дихлорфлуресцеин диацетата и 370 нм/420 нм для дигидроэтидиума. Конфокальную микроскопию проводили с использованием микроскопа LSM 510 META (Zeiss, Германия). Клетки высевали в чашки Петри ц-35 mm (Ibidi, Germany) при плотности 25 тыс/см2 Через 24 ч после посева в культуру клеток вносили золь наночастиц Cei-xGdxO2-y в концентрации 10-6 М путем замены культуральной среды. После 6 ч инкубации клеток с наночастица-ми проводили микрофотосъемку, перед этим трижды промыв клетки фос-фатно-солевым буфером. Для оценки соотношения живых и мертвых клеток в культуре использовали набор L-7007 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen), содержащий красители SYTO 9 (окрашивает все клетки, X = 485/498 нм), и про-пидий йодид (окрашивает ядра мертвых клеток, X =535/617 нм). Окраску клеток осуществляли путем замены культуральной среды DMEM/F12 с 5% ЭТС на среду, содержащую смесь красителей в концентрации 1 мкл/мл. Наблюдение за морфологией и флуоресцентной окраской проводили на инвертированном микроскопе LSM-510 (Carl Zeiss). Микрофотосъемку осуществляли с использованием цифрового фотоаппарата Power Shot A620 (Canon). Подсчет окрашенных клеток проводили с использованием программы Image J. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики. Определяли среднее значение величин и среднеквадратичное отклонение от среднего значения. Достоверность различий между группами оценивали по ^-критерию Манна-Уитни. Результаты и обсуждение Перспективы использования наночастиц диоксида церия в биомедицинских приложениях определяются его особыми физико-химическими характеристиками, в первую очередь высоким уровнем кислородной нестехиометрии, что обусловливает активность данного соединения в окислительно-восстановительных реакциях в клетке [19]. При этом, в отличие от классических антиоксидантов, наночастицы диоксида церия через определенный промежуток времени после взаимодействия с субстратом способны восстанавливать степень своей кислородной нестехиометрии, что позволяет им многократно участвовать во внутриклеточных редокс-процессах, инактивируя широкий спектр свободных радикалов и активных форм кислорода (АФК) [20, 21]. Редокс-активность наночастиц CeO2 определяется многочисленными факторами: методом синтеза, природой использованных прекурсоров и поверхностно-активных веществ и т.д. Существует ряд работ, демонстрирующих в определенных условиях токсические эффекты наночастиц диоксида церия в моделях in vitro и in vivo, что связывает с их способностью генерировать АФК [22, 23]. Поведение CeO2 в живых системах определяется такими физико-химическими характеристиками, как размер частиц, заряд их поверхности, присутствие на поверхности тех или иных лигандов [24]. В частности, взаимодействие наночастиц диоксида церия с компонентами культуральной среды может кардинально влиять на процессы проникновения частиц в клетку и дальнейшие биологические эффекты внутри клетки [25]. Из-за своего небольшого размера наночастицы имеют высокое соотношение поверхности к объему, что придает им большую адсорбционную емкость в отношении молекул, таких как аминокислоты, белки, сахара, присутствующих в биологических средах. Вполне возможно, что взаимодействие с этими молекулами может блокировать участки на поверхности наночастиц. Как показали Сингх и соавт. [26], каталитическая активность наночастиц диоксида церия сильно зависит от состава культуральной среды или используемых буферов. Так, использование фосфатного буфера для диспергирования наночастиц диоксида церия приводит к значительному снижению СОД-миметической активности и дозозависимому возрастанию каталазоподобной активности наночастиц диоксида церия. При этом использование сульфатных и карбонатных буферов не оказывает влияния на энзимоподобную активность наночастиц диоксида церия. Из-за большого соотношения площади поверхности к объему наночасти-цы склонны к агломерации, особенно в биологических средах. Это нередко приводит к изменению физико-химических характеристик и биологической активности наночастиц. Для оценки влияния состава среды на коллоидно-химические характеристики золей (гидродинамический диаметр, распределение по размерам и агрегативная устойчивость) в настоящей работе были приготовлены суспензии наночастиц Ce1-xGdxO2-y в деионизованной воде, культуральной среде F12, а также в культуральной среде F12, содержащей 5%-ную эмбриональную телячью сыворотку. Было установлено, что в де-ионизированной воде (рН 7.2) гидродинамический диаметр частиц Ce1-xGdxO2-y составляет 3,2 нм (88,9% в пробе) и 11,1 нм (6,4% в пробе). ^-потенциал золей Ce1-xGdxO2-y составил около -55 мВ (рис. 1, г), что указывает на их высокую стабильность. Использование в качестве растворителя культуральной среды F-12 приводит к некоторому увеличению гидродинамического диаметра частиц (до ~6-7 нм), а также к появлению в пробе небольшого количества агрегатов размером от 45 до 60 нм, при этом их процентное содержание весьма незначительно: 1-2% (рис. 1, а-в). Альбумин, являющийся основным белковым компонентом сыворотки, предположительно адсорбируется на поверхности наночастиц диоксида церия и формирует так называемую «белковую корону». Другие компоненты культуральной среды также вносят свой вклад в агрегативную устойчивость наночастиц допированного диоксида церия. МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий) тест использовали для анализа жизнеспособности клеточной линии NCTC clone L929 в присутствии наночастиц Ce1-xGdxO2-y. Данный анализ основан на восстановлении в живых клетках митохондриальными дегидрогеназами растворимого желтого тетразолия с образованием нерастворимых фиолетовых кристаллов формазана. Таким образом, скорость образования кристаллов формазана прямо пропорциональна числу жизнеспособных клеток. среднии размер 6.8 ± 10.7 нм 15 41 i 1 11 117 Ml »I UJ Размер (нм), log а Размер (нм), log б -> 0.9-, |[ » и и и ш ш 111

Скачать электронную версию публикации