The effect of polymeric biodegradable materials on the cell-mediated immune response.pdf Введение Роль макрофагов в обеспечении тканевого гомеостаза и физиологического ремоделирования существенна и определяется их способностью приобретать М1 или М2 иммунофенотипы в ответ на различные медиаторы [1]. Преобладание провоспалительной активности макрофагов приводит к формированию хронического воспаления. Обладая пластичными свойствами, макрофаги способны влиять как на интегративные процессы в тканях, так и на их разрушение. М1 субпопуляция макрофагов относится к воспалительному типу и первой обнаруживается в участке повреждения. М1 макрофаги активируются бактериальными липополисахаридами и IFN-y, а также экспрессируют высокие уровни CCR7, индуцибельную форму NO-синтазы, HLA-DR и ряд провоспалительных цитокинов -TNF-a, IL-1P, IL-6 и IL-12 [2]. М1 субпопуляция макрофагов является ответственной за клеточную пролиферацию в очаге воспаления, тем самым обеспечивается дальнейший процесс репарации. Альтернативно активированные М2 макрофаги преобладают во второй фазе воспаления в условиях воздействия IL-4. Противовоспалительная активность данной субпопуляции отвечает за тканевое ремоделирование и обеспечивается экспрессией 49 Е. Шаповалова, Е.Э. Иванюк, Л. В. Домрачева CD206, Ym1, CD163, CCL1, CCL18, FIZZ1, Argi и ChT [3]. Кроме того, показано, что макрофаги могут приобрести М2а фенотип посредством секреции IL-4 и IL-13, характеризующийся экспрессией низких уровней ко-стимуляторных молекул и повышением секреции VEGF. В совокупности все эти факторы, секретируемые М2а субпопуляцией макрофагов, обеспечивают профибротический и ранозаживляющий эффект [4]. Воспаление, как острое, так и хроническое, является основной клинической проблемой при применении имплантируемых материалов. И в этом случае ключевыми клетками, которые могут как стимулировать, так и подавлять воспалительные реакции в микроокружении имплантата, являются тканевые макрофаги. По реакции макрофагов на материалы имплантата можно сделать вывод об отторжении или принятии имплантата организмом пациента, чтобы предсказать реакцию иммунной системы. Цель настоящей работы - исследование влияния моноцитарных макрофагов индивидуальных доноров человека на материалы на основе гидроксиапатита и сополимера лактида и гликолида. Экспериментальная часть В соответствии с разработанной нами модельной системой были исследованы реакции первичных человеческих макрофагов на материалы на основе гидроксиапатита и сополимера лактида и гликолида. Каркасы изготовлены на основе полилактид-ко-гликолида (PLGA; соотношение лактида и гликолида = 80/20) и керамического наполнителя (Hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2, P-tricalcium phosphate Са3(РО4)). В качестве основных параметров, характеризующих провоспалительный ответ макрофагов, были выбраны ключевые цитокины М1 макрофагов: TNF-a, IL-1Р, IL-6 и IL-8. Моноцитарные макрофаги выделяли методом магнитной сепарации из лейкотромбослоя индивидуальных доноров и культивировали на поверхности материалов в течение 20 дней. Для достижения условий, наиболее приближенных к среде живого организма, и наибольшей выживаемости клеток клетки ресуспендировали в клеточной среде X-VIVO (Lonza, США) с добавлением дексаметазона (Sigma Aldrich) 1 х 10-8 М и M-CSF (Sigma Aldrich) в концентрации 1 нг/мл [5]. В каждую лунку с образцом добавляли 2 мл суспензии макрофагов в концентрации 1 х 106 клеток в 1 мл (всего 2 х 106 клеток). В качестве контроля исследовали клетки, культивированные на пластике без образцов модельных каркасов. Клетки инкубировали при 37°C и 7,5% CO2. Результаты и обсуждение Альтернативой классическим материалам для трансплантологии являются биомедицинские клеточные и тканеинженерные продукты для замещения тканей и органов. Применение скаффолдов обеспечивает эффективное взаимодействие между тремя компонентами: самим каркасом (отвеча-50 Влияние полимерных биоразлагаемых материалов ет за пространственное расположение клеток), клетками, которые образуют новую ткань на каркасе, и сигнальными молекулами (факторы роста, направляющие процесс дифференцировки клеток). Отсутствие воспаления и аллергических реакций иммунной системы способствует успешной интеграции скаффолда. Первостепенное значение среди клеток иммунной системы отводится макрофагам, благодаря их высокой пластичности и способности переключать фенотип в зависимости от внешних факторов. В качестве основных параметров, характеризующих провоспалительный ответ макрофагов, в настоящей работе были выбраны ключевые цитокины М1 макрофагов: TNF-a, IL-1Р, IL-6 и IL-8. На рис. 1 показан анализ экспрессии ILip при разной длительности культивирования. Выявлено, что в первые три дня после начала инкубации концентрация цитокина при культивировании донорских клеток 1 и 2 на поверхности образцов выше, чем при нанесении клеток на пластик. Но при длительном культивировании концентрация изучаемого цитокина снижается, что свидетельствует о снижении провоспалительного действия каркасов. Рис. 1. Анализ экспрессии IL1P при разной длительности культивирования макрофагов На рис. 2 продемонстрированы данные секреции IL-6 при разной длительности культивирования. Анализ экспрессии указывает на специфичную для донора реакцию макрофагов на образцы каркаса: у доноров 2 и 3 каркас не стимулирует повышенную секрецию IL-6, т.е. не вызывает провоспалительного эффекта. Исследование секреции IL-8 в разных временных промежутках показано на рис. 3. Нами продемонстрировано, что при длительном культивировании данный цитокин экспрессируется при нанесении клеток как на пластик, так и на поверхности каркасов. 51 Е. Шаповалова, Е.Э. Иванюк, Л. В. Домрачева Рис. 2. Анализ экспрессии IL-6 при разной длительности культивирования макрофагов Экспрессия IL-8 2500 -| 2000 -I 1500 контроль скаффолд контроль скаффолд контроль скаффолд контроль скаффолд 3 дня Ѳ дней 11 дней 20 дней ■ донор 1 "донор 2 "донор 3 Рис. 3. Анализ экспрессии IL-8 при разной длительности культивирования макрофагов В первые дни после начала культивирования повышенная экспрессия IL-8 объясняется острой воспалительной реакцией, но образцы каркасов стимулируют секрецию цитокинов на уровне, сопоставимом с контрольными клетками. При длительном культивировании высокая концентрация IL-8 может быть объяснена его свойствами вызывать миграцию клеток и способствовать их адгезии в местах имплантации материала. Из литературы известно, что присутствие тканеинженерного матрикса потенциально 52 Влияние полимерных биоразлагаемых материалов способно изменять соотношение М1 и М2 субпопуляций макрофагов в ту или иную сторону. Продолжительное присутствие М1 макрофагов может вести к обширному воспалению и формированию фиброзной капсулы вокруг материала. В результате в месте имплантации формируется хроническое воспаление, что в конечном счете может привести к отторжению имплантата и необходимости его извлечения [6]. Длительное присутствие М2 макрофагов также может приводить к отрицательным последствиям, таким как появление гигантских клеток и макрофагов, находящихся в состоянии фрустрированного фагоцитоза, вызванного невозможностью деградировать чужеродное тело [7]. Нами установлено, что секреция TNF-a, IL-6, IL-ір при культивировании первичных макрофагов на поверхности исследуемого полимерного материала не превышает уровня здоровых доноров в сыворотке крови, т. е. не вызывает хронической воспалительной реакции (рис. 4). Рис. 4. Анализ экспрессии TNF-a при разной длительности культивирования макрофагов Г идроксиапатит является основной минеральной составляющей кости и широко применяется в биомедицине в связи с хорошей биосовместимостью и биодоступностью. Матриксы на основе гидроксиапатита с соответствующей структурой, биоразлагаемостью и механическими свойствами способны инициировать адгезию, пролиферацию и дифференцировку остеобластов [8]. Рядом научных групп показано, что совместное культивирование макрофагальной линии RAW264.7 мышей с гидроксиапатитовыми покрытиями HA-10Ce и HA-30Ce приводило к изменению экспрессионного профиля макрофагов в сторону М2 фенотипа и характеризовалось повышением экспрессии поверхностных маркеров CD163 и CD206, 53 Е. Шаповалова, Е.Э. Иванюк, Л. В. Домрачева генов, ответственных за остеобластогенез (BMP2 и TGF-P1), а также увеличением продукции противовоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6. При этом наблюдалось подавление маркеров М1 субпопуляции макрофагов (CCR7 и CD 11c), снижение провоспалительных цитокинов (IL-10 и IL-1ra) и активных форма кислорода [9]. В нашей работе продемонстрировано, что каркасы существенно не влияют на стимуляцию TNF-a и IL-1Р макрофагами всех трех доноров, но секреция IL-6 является специфичной для донора реакцией. При длительном культивировании наблюдается высокая концентрация IL-8, что можно объяснить не только его провоспалительным действием, но и его особенностями вызывать миграцию клеток и способствовать их адгезии в местах имплантации материала. Выводы В ходе выполнения настоящей работы продемонстрировано, что скаф-фолды незначительно влияют на стимуляцию TNF-a и IL-1Р макрофагами от всех трех доноров, но секреция IL-6 указывает на донор-специфический ответ. При длительном культивировании наблюдается высокая концентрация IL-8, что можно объяснить не только его провоспалительным эффектом, но также его свойствами вызывать миграцию клеток и способствовать их адгезии в местах имплантации материала.

Скачать электронную версию публикации