Composition and physicochemical properties of copper-modified hydroxyapatite obtained by the liquid-phase method under m.pdf Введение Гидроксиапатит (ГА), как аллогенный, так и синтетический, является биосовместимым и биоактивным веществом, которое широко используется в качестве составляющей минеральной части материалов для костных имплантатов в медицине, включая стоматологию и ортопедию [1]. При проведении операций по имплантации существует возможность занесения инфекции в организм. Модифицирование гидроксиапатита ионами, проявляющими бактерицидное или бактериостатическое действие, может быть альтернативой назначению антибиотиков пациенту, перенесшему подобную операцию. Такими неорганическими противомикробными агентами могут выступать ионы серебра, цинка, меди, церия. Установлено [2-3], что антибактериальная активность гидроксиапатита, частично замещенного этими катионами, выше, чем у немодифицированного гидроксиапатита. Ионы меди(П), помимо проявления антибактериальной активности, в составе различных ферментов выполняют такие важные функции, как клеточное дыхание, кроветворение и коллагенообразование. Последний процесс необходим для успешного заживления костной ткани, так как основную ее органическую часть составляет коллаген. Коллаген также входит в состав кровеносных сосудов, рост которых возле имплантата может облегчить транспорт ионов кальция и фосфат-анионов для дальнейшего роста костной ткани. Кроме того, недостаток в организме меди приводит к деструкции кровеносных сосудов, патологическому росту и дефектам костной ткани. В связи с этим синтез и исследование свойств медь-модифицированного гидроксиапатита (CurA) представляет особый интерес. Цель работы - изучение фазового состава, физико-химических, бактерицидных свойств медь-модифицированного гидроксиапатита в зависимости от содержания ионов Cu2+, взятых при проведении синтеза CurA. Методы В данной работе образцы СиГА были получены методом осаждения из водных растворов с последующей обработкой СВЧ-излучением согласно методике [4]. Процесс синтеза описывается уравнением: 62 Состав и физико-химические свойства медь-модифицированного гидроксиапатита (10 - x)Ca(NO3)2 + xCu(NOb)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH = = Ca0o-x)Cux(PO4)6(OH)2 + 2ONH4NO3 + 6H2O где x - количество (моль) ионов меди (0,01; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1). Для синтеза 3 г ^ГА стехиометрически необходимое количество нитрата меди(ІІ) растворяли в определенном объеме раствора нитрата кальция из расчета, что суммарная концентрация ионов меди и кальция составляет 0,5 моль/л. Затем прибавляли определенный объем раствора гидрофосфата аммония (См = 0,3 моль/л) при интенсивном перемешивании, после чего pH смеси реагентов доводили до 10-11 концентрированным раствором аммиака (р = 0,903 г/мл). Полученный осадок вместе с раствором подвергали обработке микроволновым излучением мощностью 110 Вт и частотой 2 450 МГ ц в течение 30 мин с постоянным контролем и поддержанием pH среды. Осадок отстаивали 48 ч, после чего его отделяли от маточного раствора фильтрованием, а затем высушивали 20 ч в сушильном шкафу при 90°С. Далее осадок измельчали в ступке и прокаливали в течение 4 ч в муфельной печи при 900°С. Фазовый состав синтезированных порошков СиГА определен методом рентгенофазового анализа (РФА) на дифрактометре XRD-6000 с CuKa-излучением с использованием баз данных PDF 4+, а также программы полнопрофильного анализа POWDER CELL 2.4. Исследование морфологии поверхности и элементный анализ синтезированных образцов CurA проводили с помощью методов сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и рентгеноспектрального микроанализа (РСМА) на электронном микроскопе HitachiTM-3000 в режиме высокого вакуума с ускоряющим напряжением 15 кэВ с анализатором Quantax 70. Степень вхождения ионов меди(П) в образцы CurA определяли по концентрации ионов Cu2+, оставшихся в маточном растворе после синтеза образцов медь-модифицированного гидроксиапатита, методом спектрофо-томерии. Растворимость порошков CurA в 0,9%-ном (мас.) растворе хлорида натрия при 25°С оценивали по результатам комплексонометрического титрования ионов кальция в насыщенных растворах стандартизированным раствором ЭДТА концентрации 2,5 ммоль/л до изменения окраски раствора из винно-красной в голубую в присутствии индикатора эриохрома черного Ти аммиачного буфера (pH 10). Исследование антибактериальных свойств синтезированных образцов СиГА проводили in vitro на твердых средах против S.aureus методом Коха. Результаты Результаты рентгенофазового анализа образцов № 1-5 ^ГА представлены на рис. 1 и в табл. 1. Из вида дифрактограмм порошков ^ГА можно сделать вывод о высокой кристалличности синтезированных образцов. 63 Н.М. Коротченко, А.А. Шнайдмиллер, А.С. Гигилев Рис. 1. Дифрактограммы образцов СиГА Таблица 1 Результаты рентгенофазового анализа образцовСиГА № п/п X, моль Обнаруженные фазы Содержание, масс.% Параметры решетки, А Объем ячейки, (А3) 1 0,01 Ca5(PO4)3OH 91,8 a = 9,412; c = 6,872 527,2 Ca18Cu3(P04)14 8,2 a = 10,335; с = 36,992 3 421,8 2 0,025 Ca5(PO4)3OH 95,7 a = 9,406; c = 6,867 526,2 Ca19Cu1.36H2.24(P04)14 4,3 a = 10,326; с = 37,109 3 426,6 3 0,05 Ca5(PO4)3OH 92,7 a = 9,429; c = 6,883 529,1 Ca19Cu1.36H2.24(P04)14 4,0 a = 10,476; с = 37,030 3 519,6 Ca18Cu3(P04)14 3,3 a = 10,350; с = 37,202 3 451,5 4 0,075 Ca5(PO4)3OH нет данных a = 9,423; c = 6,881 529,1 Ca19Cu1.36H2.24(P04)14 a = 10,517; с = 36,721 3 517,6 Ca18Cu3(P04)14 a = 10,350; с = 37,128 3 444,5 5 0,1 Ca5(PO4)3OH нет данных a = 9,413; c = 6,871 527,2 Ca19Cu1.36H2.24(P04)14 a = 10,546; с = 36,191 3 485,6 Ca18Cu3(P04)14 a = 10,332; с = 37,085 3 428,2 Согласно результатам РФА, во всех образцах СиГА основной фазой (91,8-95,7%) является гидроксиапатит Са5(Р04)з0Н; обнаружены медь-содер-жащие фосфаты (3,3-8,2%), такие как Саі8Сиз(Р04)14 и Саі9Сиі.збН2.24(Р04)і4. Значительное отличие радиусов ионов Са2+ (0,104 нм) и Си2+ (0,080 нм) позволяет утверждать, что замещение ионов кальция ионами меди в кристаллической решетке гидроксиапатита маловероятно, о чем свидетельствует сохранение параметров элементарной ячейки фазы Са5(Р04)з0Н. 64 Состав и физико-химические свойства медь-модифицированного гидроксиапатита Из микрофотографий поверхности образцов СиГА (рис. 2) видно, что порошки полидисперсные, с агломератами неправильной угловатой формы. 30 urn Рис. 2. Микрофотографии поверхностей образцов СиГА: № 1 (a); № 2 (b); № 3 (с); № 4 (d); № 5 (е) Распределение элементов по поверхности образцов № 1-5 СиГА, полученное в результате рентгеноспектрального микроанализа, приведено на рис. 3 на примере образца № 5. В остальных образцах СиГА распределение элементов по поверхности существенно не отличается. Совместное распределение кальция, фосфора и кислорода по поверхности образцов СиГА подтверждает образование фосфатов кальция. Также видно, что медь в целом равномерно распределена по поверхности образца, но при этом присутствует несколько пятен сосредоточения данного элемента, которые на области съемки имеют более светлый оттенок. Вероятнее всего, данные светлые пятна являются более тяжелой фазой совместного медно-кальциевого фосфата, найденного при помощи РФА. 65 Н.М. Коротченко, А.А. Шнайдмиллер, А.С. Гигилев Рис. 3. Распределение элементов по поверхности образцов СиГА: a - область съемки; b - кальций; c - фосфор; d - кислород; e - медь; f - углерод По результатам количественного анализа на содержание элементов в образцах СиГА было рассчитано мольное соотношение (Ca + Cu)/P. Оно представлено в табл. 2. Т аблица 2 Результаты количественного РСМА образцов медь-модифицированного ГА № X Ca + Cu ю (М), % теор ю (М), % РСМА Д, % Юср(С)? % P 1 0,01 1,83 ± 0,12 0,06 0,05 83,33 9,55 2 0,025 1,83 ± 0,25 0,16 0,12 75,00 - 3 0,05 1,80 ± 0,08 0,32 0,17 53,13 10,37 4 0,075 1,77 ± 0,03 0,47 0,18 38,29 8,61 5 0,1 1,86 ± 0,18 0,63 0,21 33,33 10,51 Данное соотношение находилось через пересчет с последующей статистической обработкой массовых долей элементов из областей с одинаковой 66 Состав и физико-химические свойства медь-модифицированного гидроксиапатита площадью накопления сигнала. Кроме того, было проведено сравнение массовой доли меди, обнаруживаемой методом РСМА (юРСМА) с теоретическим содержанием, обусловливаемым синтезом (ютеор). Для большей наглядности нами была рассчитана степень модифицирования, которая обозначается Д: Д = ^РСМА х 100% . ® теор Спектрофотометрическое определение ионов меди, оставшихся в маточных растворах По характерному ярко-синему цвету маточных растворов после отделения осадков СиГА было очевидно, что некоторое количество ионов меди осталось в фильтрате в виде аммиачных комплексов. Поэтому было принято решение определить количество ионов меди, оставшихся в растворе после синтеза, по методике спектрофотометрического определения ионов меди [5]. Результаты определения концентрации ионов меди в маточных растворах (стандартный раствор сульфата меди(ІІ) См = 0,02 моль/л; 5 мл 5%-го раствора аммиака; Хэф = 610 нм; l = 1 см) представлены в табл. 3. Т аблица 3 Результаты определения количества ионов меди(П) № х Иисх(Си2+)104, моль йост(Си2+)104, моль ЙГА(Си2+)104, моль Д, % 1 0,01 0,30 0,22 0,08 26,8 2 0,025 0,75 0,39 0,36 48,1 3 0,05 1,49 0,61 0,88 58,9 4 0.075 2,23 1,06 1,17 52,5 5 0,1 2,98 1,64 1,34 45,0 Согласно данным табл. 3, степень модифицирования гидроксиапатита ионами меди, рассчитанная по результатам спектрофотометрии, преимущественно составляет около 50% и в целом меньше степени модифицирования, рассчитанной по результатам РСМА (см. табл. 2). Определение растворимости порошков СиГА Для оценки растворимости образцов ГА, СиГА определяли концентрацию ионов Са2+ в физиологическом растворе (ra(NaCl) = 0,9%) при температуре 25°С, в котором образцы массой порядка 0,13 г выдерживались в течение 7 суток при перемешивании для достижения полного насыщения раствора относительно твердой фазы. Для каждого из образцов ГА, СиГА было проведено по два независимых опыта по растворимости, результаты которых статистически обрабатывали, находя средние значения и доверительные интервалы. Результаты оценки растворимости образцов СиГА в физиологическом растворе при 25°С представлены на рис. 4. 67 Н.М. Коротченко, А.А. Шнайдмиллер, А.С. Гигилев Рис. 4. Результаты определения растворимости порошков СиГА в 0,9% (масс.) растворе NaCl (25°С) Как видно из гистограммы, растворимость образцов модифицированного ГА находится в пределах растворимости для ГА. При этом растворимость СиГА в среднем ниже, чем у ГА. Антибактериальные свойства Для изучения влияния образцов на раневую грамположительную микрофлору в качестве тест-объекта использованы бактерии Стафилококк золотистый (Staphylococcusaureus). Эксперимент проведен в одной повторности (1 образец - 1 колба) с каждым образцом. Т аблица 4 Влияние состава образцов СиГА на численность S.aureus № Образец Численность, КОЕ/мл Контроль (1,68 ± 0,13) х 108 ГА (1,57 ± 0,09) х 108 1 СиГА (х = 0,01) (1,73 ± 0,13) х х108 3 СиГА (х = 0,05) (1,40 ± 0,13) х 108 5 СиГА (х = 0,1) (1,12 ± 0,05) х 108 Образцы СиГА (х = 0,01) и СиГА (х = 0,05) не оказали подавляющего воздействия на численность золотистого стафилококка. Численность бактерий 68 Состав и физико-химические свойства медь-модифицированного гидроксиапатита в жидкой среде с этими образцами несколько отличается от отрицательного и положительного контролей, но статистически достоверность различий не установлена (р > 0,05). При этом с увеличением содержания ионов меди численность бактерий уменьшается. Образцы СиГА (х = 0,1), напротив, проявили антибактериальную активность небольшой интенсивности (р < 0,05). При этом образец СиГА (х = 0,1) показал наибольшую антибактериальную активность из всей серии образцов. Поскольку антибактериальная активность модифицированных гидроксиапатитов обеспечивается выходом из них ионов металлов, можно предположить, что концентрации ионов металлов недостаточно для эффективного подавления тестового штамма. Поскольку при содержании 0,1 моль ионов меди образцы СиГА показали небольшую антибактериальную активность, в дальнейшем можно несколько увеличить их количество для проявления большей антибактериальной активности образцов. Следует отметить, что проблема стафилококковой инфекции приобрела особую актуальность в последние годы. Золотистый стафилококк часто образует устойчивые к антибиотикам формы - «госпитальные штаммы», что представляет опасность для пациентов хирургических стационаров. Особенно эта опасность высока в период восстановления после операций, в частности после остеосинтеза. Штаммы стафилококков отличаются довольно высокой жизнеспособностью: до 6 месяцев они могут сохраняться в высушенном состоянии, не погибают при замораживании и оттаивании, устойчивы к действию прямых солнечных лучей. Посторонней микрофлоры на питательной среде не выявлено: все колонии по морфологическим признакам отнесены к исследуемому тест-объекту. Заключение Синтезированные образцы медь-модифицированного гидроксиапатита с различным содержанием ионов Си2+ (0,01; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 моль), согласно результатам РФА, являются высококристалличными, основной фазой в них выступает гидроксиапатит Са5(Р04)30Н, в качестве примесей присутствуют фосфаты состава CaisCu3(P04)i4 и Саі9Сиі.збН2.24(Р04)і4. Растворимость образцов СиГА в физиологическом растворе при 25°С незначительно отличается от растворимости ГА (~ 10-4 моль/л). Из данных РСМА мольное соотношение Ca/P, рассчитанное для всех образцов СиГА (~ 1,8) выше, чем в стехиометрическом ГА (1,67), однако полученные величины укладываются в диапазон Ca/P для биогенного ГА (1,5-2,0). Образцы СиГА (х = 0,01) и СиГА (х = 0,05) не оказали подавляющего воздействия на численность золотистого стафилококка. С увеличением содержания ионов меди численность бактерий уменьшается. Образцы СиГА (х = 0,1) проявили антибактериальную активность небольшой интенсивности (р < 0,05). При этом образец СиГА (х = 0,1) показал наибольшую антибактериальную активность из всей серии образцов. Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Скачать электронную версию публикации