Simulation of electronic spectra of eosin and erythrosin ionic forms.pdf Введение Флуоресцеин и его замещенные галогенами (Br, I) гомологи (эозин, эритрозин) используются для маркирования и визуализации бесцветных систем (клеток, белков и т.д.) [1, 2], а также в качестве акцепторов и преобразователей энергии электронного возбуждения [3, 4] благодаря интенсивному поглощению в видимой области и своим флуоресцентным, фосфоресцентным и фотохимическим свойствам. В результате протекания трехступенчатой диссоциации в водных растворах флуоресцеиновые красители могут пребывать в дианионной, моноанионной, нейтральной и катионной формах и дополнительно иметь ряд таутомеров одного и того же ионного состояния. Из-за того, что протонирование/депротонирование зачастую происходит в хромофорной группе, подобные изменения самым радикальным образом сказываются на спектрах поглощения и испускания. В отличие от хорошо изученных спектров поглощения ионных форм флуоресцеиновых красителей [5-7], сложная структура спектров испускания в широком диапазоне pH еще не до конца понятна из-за многообразия этих форм, перекрытия широких спектров, а также переноса протона в электронно-возбужденных состояниях [8]. Наименее изученными являются красители (эозин, эритрозин), содержащие тяжелые атомы, у которых плохо растворима нейтральная форма и близки значения констант дианион-моноанионного и моноанион-нейтрального равновесия [5]. Один из способов изучения энергетической структуры молекул, когда экспериментальное исследование затруднено, - это квантовохимический расчет. Цель настоящей работы - определение геометрии и спектральных свойств ряда ионных и таутомерных форм эозина и эритрозина. Результаты квантовохимических расчетов с использованием нестационарной теории функционала плотности (TD-DFT) были сопоставлены с экспериментальными данными, полученными методом абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии в широком диапазоне pH. Анализ параметров линейной регрессии между расчетными и экспериментальными значениями позволил впервые предсказать значения пиков флуоресценции моноанионной, нейтральной и катионной форм эозина и эритрозина. Проведено сравнение спектральных свойств красителей, отличающихся заместителями-галогенами с позиции изменения пространственной структуры молекул при возбуждении. Методы Расчет атомной и электронной структуры, распределения электронной плотности, спектров поглощения и испускания, сил осцилляторов для ионных и молекулярных форм эозина и эритрозина с учетом растворителя производился с помощью теории функционала плотности (DFT). Были проведены расчеты для дианионной, катионной, двух таутомеров нейтральной (хиноидной и лактонной) и двух таутомеров моноанионной форм эозина и эритрозина (рис. 1). Для молекулы флуоресцеина [8, 9], которая является базовой структурой для изучаемого ряда красителей, существует также цвиттерионная нейтральная форма, однако в расчетах его галагензамещенных производных не удалось выявить стабильную конфигурацию этой формы. Все расчеты проводили с использованием B3LYP-функционала [10, 11]. Для расчета ионных форм эозина применялся aug-cc-PVDZ-базис, содержащий, помимо поляризационных, диффузные функции. Из-за отсутствия параметризации этого базиса для йода для эритрозина использовался ADZP-базис, максимально близкий по характеристикам к aug-cc-PVDZ. Спектры поглощения для всех ионных и молекулярных форм получены с помощью времязависимой TD-теории [12, 13]. Рис. 1. Ионные и молекулярные формы эозина (R = Br) и эритрозина (R = I): C - катион; Q - нейтральный хиноид; L - нейтральный лактон; MI - моноанион 1; MII - моноанион 2; D - дианион. Кружком отмечены фрагменты, содержащие отличия от нейтральной хиноидной формы Ранее было показано [8, 9], что при учете растворителя лучше всего использовать модель поляризованного континуума (PCM) с учетом неравновесной сольватации [14, 15]. Как правило, в стационарных условиях для диэлектрической проницаемости растворителя используются значения, которые зависят только от температуры и давления. Тем не менее при изучении динамических процессов необходимо учитывать время релаксации поляризации растворителя. Тогда при характеристическом времени, меньшем, чем время релаксации растворителя, наблюдается задержка в отклике растворителя. Для описания этого процесса можно использовать термин «быстрой» диэлектрической постоянной, которая находится в равновесии с растворенным веществом, в то время как остальная часть является «медленной» по сравнению с изменением электронной плотности растворенного вещества. Данный подход получил название TD-DFT расчета с учетом неравновесной сольватации [15]. Далее для данной геометрии с помощью TD-DFT получали спектр испускания. Все расчеты проводились в программе GAMESS [16]. При расчете спектральных характеристик важно знать, сопровождаются ли оптические переходы переносом заряда, что, в свою очередь, влияет на выбор вида функционала. Критерием для разделения локальных переходов от переходов с переносом заряда и ридберговских переходов является анализ так называемого -параметра [17]. Для локальных возбуждений (0.45 <  < 0.89) характерно большое перекрытие молекулярных орбиталей. Это указывает на подобие пространственных областей занятых и виртуальных орбиталей молекулы, участвующих в возбуждении. В наших расчётах для всех ионных форм -параметр был в пределах 0.51 <  < 0.71, что означает отсутствие существенной роли переноса заряда в поглощении и испускании. Результаты и их обсуждение Спектры поглощения и испускания В процессах поглощения света молекулами органических соединений первостепенное значение имеет разность энергий их высшей занятой молекулярной орбитали (ВЗМО) и низшей вакантной молекулярной орбитали (НВМО). Именно этот переход обуславливает длинноволновую полосу поглощения. Важным фактором влияния заместителей на электронный спектр поглощения и вероятность электронных переходов является снятие запретов по симметрии. Введение заместителей в общем случае снимает запрет и увеличивает интенсивность поглощения света, что наблюдается при галогензамещении водорода на бром и йод для флуоресцеиновых красителей. Рассчитанные силы осцилляторов переходов в поглощении подтвердили существование интенсивных полос в видимой области спектра для всех ионных и молекулярных форм, кроме лактонной (табл. 1). При этом, в целом, спектр поглощения эритрозина сдвинут в красную область (на 2-27 нм для разных форм) по сравнению с эозином. Наблюдается хорошая корреляция расчетных значений энергий переходов в поглощении с энергией, соответствующей положению максимума электронно-колебательного спектра поглощения для обоих красителей (рис. 2 и 3). Для построения линейной регрессии дополнительно были использованы экспериментально доступные значения максимумов испускания дианионной формы D* рассматриваемых красителей (536 нм для эозина и 547 нм для эритрозина [6]). Таблица 1 Спектральные характеристики ионных и молекулярных форм эозина и эритрозина в воде Ионные формы Поглощение Испускание Стоксов сдвиг Расчет Эксперимент [5] Расчет Расчет  S0 → S1, нм f S0 → S1 max, нм max10-3, лмоль-1см-1  S1 → S0, нм f S1 → S0 , см-1 Эозин D 493 1,.20 515 96,.7 510 1,.17 710 MI 471 0,.76 517-519 81,.9 518 0,.33 1930 MII 507 1,.24 576 0,.83 2340 L 288 0,.11 480-485 8,.5 295 0,.07 770 Q 478 0,.77 584 0,.47 3820 C 442 0,.89 453-455 44,.5 461 0,.80 950 Эритрозин D 498 1,.21 525 94,.6 522 1,.13 920 MI 477 0,.75 530 91,.9 526 0,.57 1930 MII 512 1,.25 596 0,.76 2740 L 296 0,.09 500 11,.4 298 0,.07 260 Q 491 0,.69 556 0,.38 2370 C 469 0,.82 462 45,.2 487 0,.70 810 Примечание. S0 → S1 и fS0 → S1 - соответственно длина волны поглощения и сила осциллятора перехода S0 → S1 (расчет); max и max - длина волны максимума спектра поглощения и молярный коэффициент экстинкции на этой длине волны (эксперимент); S1 → S0 и fS1 → S0 - соответственно длина волны испускания и сила осциллятора перехода S1 → S0 (расчет). Как видно из рис. 2 и 3, точка MII расположена близко к линии регрессии - признак того, что форма MII присутствует в растворе, тогда как точка MI выпадает из регрессии как для эозина, так и для эритрозина. Как было неоднократно показано [5], именно моноанион MII, диссоциированный по гидроксильной группе (рис. 1), реализуется в эксперименте. Длина волны поглощения для нейтральной молекулы, которая представлена двумя таутомерами Q и L, судя по расчетам, соответствует хиноидной форме Q. Рис. 2. Линейная регрессия между расчетной и экспериментальной длинами волн в спектрах поглощения для D-, MII-, Q-, C-форм и испускания для D*-формы эозина. Показаны теоретические прогнозы для случаев, когда экспериментальные значения недоступны (испускание форм MII*, Q* и C*). На вставке - положение максимума дианиона и предсказанных MII*-, Q*-форм в спектрах флуоресценции Рис. 3. Линейная регрессия между расчетной и экспериментальной длинами волн в спектрах поглощения для D-, MII-, Q-, C-форм и испускания для D*-формы эритрозина. Показаны теоретические прогнозы для случаев, когда экспериментальные значения недоступны (испускание форм MII*, Q* и C*). На вставке - положение максимума дианиона и предсказанных MII*-, Q*-форм в спектрах флуоресценции Характеристики для D-, MII-, Q- и C-форм, связанные с вероятностью переходов (сила осциллятора поглощения и молярный коэффициент экстинкции, табл. 1), также имеют высокую линейную корреляцию (R2 = 0.96-0.98 для обоих красителей), что говорит об адекватности выбранных методов расчета. Полученную линейную регрессию для расчетных и экспериментальных энергий переходов по D-, D*-, MII-, Q- и C-формам можно использовать для прогнозирования спектров флуоресценции ионных и молекулярных форм, экспериментальное определение которых невозможно. Для этого по найденным уравнениям регрессии с учетом расcчитанных энергий испускания были определены значения максимумов в спектрах флуоресценции. Для эозина и эритрозина они составили соответственно 614 и 613 нм для Q*-формы, 473 и 494 нм для С*-формы, 604 и 690 нм для MII*-формы. Черты этих пиков прослеживаются в сложных контурах флуоресценции красителей в кис¬лой среде, которые представляют собой смесь различных ионных и/или молекулярных форм (вставки на рис. 2 и 3). Самые коротковолновые переходы соответствуют катионной C*-форме красителей и не обнаруживаются в спектрах флуоресценции вплоть до pH 0.5-0.6. Как было показано в работе [5], константа катион-нейтрального равновесия составляет около -2 для эозина и -2.4 для эритрозина, что указывает на область существования этой формы за пределами исследованного диапазона кислотности растворителя. Обращает на себя внимание высокое значение стоксова сдвига для моноанионной и нейтральной хиноидной форм красителя при достижении максимального значения для хиноида эозина 3820 см-1 (106 нм). Большая разница между энергией поглощения и испускания может быть обсуждена в терминах существенного изменения геометрии молекул вследствие возбуждения и последующей релаксации в равновесное возбужденное состояние. Молекулярные орбитали и геометрия молекул в основном и возбужденном состояниях На рис. 4 представлены геометрии молекул в основном состоянии (S0) и ВЗМО-орбитали для него и геометрии молекул в возбужденном состоянии ( ) и соответствующие молекулярные орбитали, с которых идет процесс испускания - НВМО. Так как эозин и эритрозин - близкие по строению молекулы, то у них близкие по форме орбитали. Рис. 4. Молекулярные орбитали для основного S0- и возбужденного -состояния ионных форм эритрозина Из рис. 4 видно, что верхние занятые молекулярные орбитали имеют π-характер связывания для атомов углерода и несвязывающий характер для атомов кислорода и галогенов. Нижние вакантные орбитали также расположены на трицикле и имеют аналогичную природу. Для дианиона при переходе с ВЗМО- на НВМО-орбиталь не происходит перемещения электронной плотности, а значит, не наблюдаются процессы с переносом заряда. В основном S0-состоянии моноанион MII и дианион D имеют высокую силу осциллятора (> 1), что также говорит о локальности оптических переходов и потенциально высоком квантовом выходе. У всех рассчитанных структур наблюдается заметная разница в геометрии основного и возбужденного состояния. Для описания изменения геометрии молекул при электронном возбуждении был использован ряд двугранных углов (рис. 5). Углы 1 и 2 отражают поворот плоскости трицикла 2-4 при переходе от основного S0- к возбужденному -состоянию красителя. Углы 1 и 2 показывают прогиб плоскости трицикла 2-4 в состоянии S0 или , а угол  характеризует поворот плоскости кольца 1 относительно хромофорного трицикла 2-4 в состоянии S0 или . Наибольшая разница между геометрией молекулы в основном и возбужденном состояниях наблюдается у хиноидной Q- и моноанионной MII-форм (табл. 2). При релаксации данных форм происходит поворот и карбоксильной группы относительно моноцикла 1, и моноцикла 1 относительно трицикла. Это проявляется в большом стоксовом сдвиге для данных форм. В меньшей степени изменение геометрии при переходе в возбужденное состояние проявляется у катиона C и моноаниона MI, еще меньше у дианиона D (табл. 2). Для лактонной формы L как для эозина, так и для эритрозина не наблюдается сильного изменения геометрии при переходе в возбужденное состояние (табл. 2), поэтому эта форма характеризуется наименьшим стоксовым сдвигом. Рис. 5. Углы, характеризующие изменение пространственной структуры красителей при возбуждении Таблица 2 Изменение геометрии ионных и молекулярных форм эозина и эритрозина при электронном возбуждении (расчет) Угол, град D MI MII Q L C Эозин 1 0.9 0.7 5.7 4.1 0.2 2.6 2 1.1 2.3 4.1 2.9 0.3 1.8  8.1 14.7 26.2 18.4 0.5 12.2 1 0.2 0.5 2.6 2.8 1.5 1.4 2 0.8 1.6 3.1 3.3 1.7 0.8 Эритрозин 1 1.4 0.67 6.9 5.2 0.3 0.5 2 1.8 3.4 4.6 5.7 0.8 1.5  10.4 18.1 29.3 28.2 0.8 2.8 1 0.8 0.3 1.9 0.3 1.6 0.5 2 0.7 0.7 2.7 0.6 1.7 1.4 Примечание. , 1 и 2 показывают изменение углов , 1 и 2 соответственно при переходе красителя из основного в возбужденное состояние. Изменение плоскости трицикла для хиноидной формы эозина характеризуется 1 = 2.8 и 2 = 3.3, в то время как для эритрозина 1 = 0.3 и 2 = 0.6. Достаточно тяжелые и малоподвижные атомы йода способствуют слабой конформационной подвижности хромофорного трицикла эритрозина, что может служить причиной меньшего стоксова сдвига у эритрозина (2380 см-1) по сравнению с эозином (3800 см-1). Заключение Квантовохимические расчеты спектров ионных и молекулярных форм галогензамещенного флуоресцеина - эозина и эритрозина - были реализованы с использованием теории функционала плотности. Эффективность расчетов была продемонстрирована путем сравнения полученных энергий переходов в поглощении и сил осцилляторов с экспериментально измеряемыми максимумами спектров поглощения и коэффициентами молярной экстинкции дианионной, моноанионной, хиноидной и катионной форм. С использованием найденной линейной регрессии между расчетными и экспериментальными данными были впервые спрогнозированы для эозина и эритрозина положения пиков флуоресценции для катионной (473 и 494 нм), моноанионной (604 и 690 нм) и нейтральной хиноидной (614 и 613 нм) форм. Показано, что, несмотря на схожий набор ионных и молекулярных форм, спектральные свойства исследованных флуоресцеиновых красителей существенно зависят от типа галогена, влияющего на «жесткость» хромофорного трицикла.

Скачать электронную версию публикации