Features two-photon microscopy for analysis fluorescent properties of elastin fibers rats in vivo.pdf Введение Применение нелинейных оптических методов в медицине - это перспективное направление физики, развивающееся в наши дни. Микроскопия с двухфотонным поглощением (двухфотонная микроскопия - ДФМ) - современный оптический метод, основанный на одновременном поглощении двух фотонов, что позволяет производить in vivo анализ морфологии и состава биотканей с субклеточным пространственным разрешением. Представим процесс двухфотонного поглощения для молекулы следующим образом: первый фотон переводит ее из основного состояния в некоторое виртуальное возбужденное состояние . После этого второй фотон, который попадает на молекулу следом за первым, переводит ее из виртуального возбужденного состояния в реальное возбужденное состояние . Данный сценарий можно описать при помощи следующего гамильтониана взаимодействия: , где - операторы электрических полей падающих на молекулу фотонов; и - атомные диполи, колеблющиеся на частотах соответствующих переходов , задающиеся в виде , . Здесь - матричные элементы соответствующих электродипольных переходов, Н.с - эрмитово-сопряженные величины. Когда волновой пакет, содержащий пару фотонов, взаимодействует с молекулой в основном состоянии , амплитуду вероятности двухфотонного возбуждения можно описать как Из этого выражения можно получить вероятность двухфотонного возбуждения: Вероятность двухфотонного поглощения задается спектральной компонентой время-упорядоченной волновой функции на частотах перехода . Сравнивая вероятность двухфотонного поглощения с вероятностью однофотонного поглощения, которая задается формулой можно сказать, что вероятность двухфотонного поглощения много меньше вероятности однофотонного поглощения [1, 2]. Именно это свойство двухфотонного поглощения определяет преимущества метода ДФМ: сигнал флуоресценции регистрируется не по всему объему, через который проходит лазерный луч, а только в области его фокусировки. Это обеспечивает ограниченность потенциального фотоповреждения лишь фокальным объемом, и его отсутствие выше и ниже данного объема. Благодаря этому мы также имеем возможность проводить трехмерное сканирование образца и получать изображения с разных слоев. ДФМ - один из вариантов лазерной сканирующей микроскопии, при котором флуорохромы возбуждаются лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона с высокой интенсивностью, при этом испускание происходит на длине волны в 2 раза меньшей, чем длина волны падающего излучения. Ввиду того, что эмиссионные спектры многих флуоресцирующих молекул достаточно близки, анализ полученных изображений затрудняется в случае их совместного исследования. Метод оценки времени жизни флуоресценции (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) дает возможность различать отдельные флуорофоры на интервале, соответствующем времени жизни флуоресценции. Данный метод заключается в анализе кривой затухания флуоресценции для разных молекул. FLIM-флуоресценция тканей также обеспечивает высокий контраст с флуоресцентными изображениями, полученными при действии эндогенных флуорофоров в биологических тканях, позволяет исследовать взаимодействие белков и их конформационные превращения [3]. Двухфотонная флуоресцентная микроскопия в сочетании с FLIM позволяет контролировать содержание в ткани таких молекул, как, например, триптофан, тирозин, коллаген и эластин [4]. Возможность детектирования фотонов в очень короткие временные интервалы позволяет оценивать метаболический статус клеток путем анализа временной динамики флуоресценции. Другим важным эффектом, используемым при анализе биологических объектов, является эффект генерации второй гармоники (ГВГ) нецентросимметричными молекулами, такими как коллаген [2, 5, 6]. ДФМ перспективна в диагностике и изучении различных патологий, с помощью данного метода появляется возможность определять концентрацию и наличие различных биомаркеров в тканях [7-18]. Для исследований биологических процессов, изучения эффективности медикаментозного лечения и анализа прогрессирования различных заболеваний классической моделью являются лабораторные животные (крысы) [17-20]. Метаболические изменения в организме при различных патологиях напрямую связаны с изменением флуоресцентных свойств основных белков, таких как коллаген и эластин. Для того, чтобы убедиться, что флуоресцентные свойства эластических волокон человека и крыс имеют подобные флуоресцентные характеристики необходимо проанализировать распределения параметров флуоресценции, в частности времена жизни флуоресценции [21]. Настоящая работа посвящена использованию метода ДФМ для исследования флуоресцентных свойств эластических волокон дермы кожи крыс. Акцент сделан на анализе кривых затухания флуоресценции. В данной работе определены следующие флуоресцентные характеристики эластина дермы крыс: среднее время жизни флуоресценции, время жизни быстрой и медленной компоненты, отношение амплитуд медленной и быстрой компоненты. Проведено сравнение вышеперечисленных параметров с параметрами волокон эластина дермы человека, взятых из литературных источников. Полученные распределения позволяют оценить возможность сопоставления флуоресцентных характеристик эластина человека и крыс, а в дальнейшем обобщить на случай патологий, что позволит перейти к изучению патологий, связанных с изменениями параметров флуоресценции кожи человека на моделях мелких животных. Метод и объект исследования В данной работе исследование проводилось на беспородных половозрелых белых крысах линии Wistar массой 200-250 г (из вивария Института фармакологии СО РАН). Протокол исследования был одобрен Комитетом по биоэтике НИ ТГУ. Крысы содержались в изолированном вентилируемом помещении вивария Института биологии и биофизики Томского государственного университета. Перед экспериментом все животные были промаркированы и содержались в течение 7 сут на карантине по 1 крысе в каждой клетке, при свободном доступе к воде и пище (стандартный рацион для крыс). В помещении поддерживалась температура (20 ± 2.0) °C, влажность воздуха 60%, 12 ч свет/12 ч темнота. Экспериментальная часть проводилась по следующей методике [22]: крысу анестезировали (золетил внутримышечно). Расчет дозы препаратов выполнялся в соответствии с массой животного. После введения наркоза крыса размещалась на пенопластовой подложке в горизонтальном положении. Далее проводили депиляцию на внутренней стороне бедер кремом, после чего участки кожи протирали влажными салфетками для удаления остатков крема. С помощью подвижного кронштейна двухфотонного микроскопа лазер устанавливался на подготовленную область исследования. Для регистрации сигнала флуоресценции использовался двухфотонный томограф JenLab MPTflex [10] с перестраиваемой длиной волны в ближней ИК-области от 710 до 920 нм. Прибор включает в себя два фильтра, разделяющих сигналы флуоресценции и ГВГ на длины волн 406-610 и 373-387 нм соответственно. При использовании длины волны 760 нм и фильтров для изучения сосочкового слоя дермы появляется возможность одновременно изучать коллаген (который дает сигнал ГВГ, ~ 380 нм), эластин и другие компоненты кожи. В литературе показано, что излучение эластина осуществляется на длинах волн в диапазоне 450-550 нм [23]. Исходя из этих соображений в качестве зондирующего излучения выбрана длина волны лазера равная 760 нм. Мощность лазерного излучения равнялась 15 мВт и при необходимости корректировалась в зависимости от глубины и количества фотонов, полученных из области. Для определения необходимого слоя проведена следующая процедура: при помощи шагового двигателя происходил поиск рогового слоя клеток. Данный слой характеризуется явно выраженной чешуйчатой структурой и интенсивным сигналом флуоресценции, так как кератин, содержащийся в большом количестве в роговых чешуйках, является интенсивным флуорофором [2]. Далее, фокус лазерного луча перемещался на 30 и 40 мкм в глубь ткани, на FLIM-изображении появлялись флуоресцирующие эластические волокна, дающие устойчивый сигнал FLIM, и коллагеновые волокна, излучающие сигнал ГВГ [2]. Наличие данных оптических сигналов подтверждало то, что фокус лазерного излучения находится в одном из слоев дермы. Таким образом, для каждого пространственного положения шагового двигателя делалось два снимка, всего для каждой области внутренней поверхности бедра крысы проводилось изучение не менее пяти точек (различные значения шагового двигателя). Время сканирования каждого слоя составляло 12 с. Разрешение снимков - 70×70 мкм. Анализ FLIM-данных волокон эластина проводился в программном обеспечении SPCImage NG 8.1 [24, 25]. При рассмотрении сигнала зависимости интенсивности флуоресценции от времени, полагая, что аппаратная функция прибора автоматически учитывалась программным обеспечением при построении кривой затухания флуоресценции, применялась двухэкспоненциальная аппроксимация, согласно которой где - взвешенные амплитуды аппроксимальных компонент, такие, что ; - времена жизни флуоресценции двух компонент аппроксимации. Данная аппроксимация хорошо согласуется с тем, что в эластических волокнах присутствуют как минимум два флуорофора, представляющих собой различные межмолекулярные сшивки (ферментативные и неферментативные), предположительно имеющие разное время жизни и разные амплитуды флуоресценции [26]. В рамках данного подхода информативными параметрами являются: , отношение медленной и быстрой амплитуд флуоресценции и среднее время жизни флуоресценции , определяемое формулой Результаты и их обсуждение При анализе флуоресцентных свойств волокон эластина дермы крыс с помощью двухфотонной микроскопии получено шесть снимков на разной глубине сканирования: 30 мкм (рис. 1, а-в) и 40 мкм (рис. 1, г-е). На снимках флуоресценции изображен сосочковый слой дермы, хорошо различимы волокна эластина, имеющие ветвистую структуру. Рис. 1. Изображения волокон эластина дермы крыс, полученные методом ДФМ на глубине 30 мкм (а, б, в), и на глубине 40 мкм (г, д, е) В результате анализа FLIM для каждого изображения получены гистограммы распределения фотонов по времени жизни первой и второй экспоненциальных компонент, распределение фотонов по среднему времени жизни и распределение по отношению амплитуд медленной и быстрой компоненты а1/а2. Данный вид гистограмм свидетельствует о множестве флуоресцирующих компонент в пределах одного волокна, что соответствует теории о наличии в волокнах множества флуоресцирующих межмолекулярных сшивок, являющихся источниками эндогенной флуоресценции. На рис. 2 показаны средние значения и дисперсия параметров флуоресценции ( , , , а1/а2) волокон сосочкового слоя дермы крысы. Рассчитанные экспериментальные данные флуоресцентных параметров волокон эластина дермы крыс (таблица) сравнивались с литературными данными флуоресцентных характеристик волокон человека [21]. На основе полученных данных следует вывод, что в пределах среднеквадратичного отклонения значения исследуемых параметров для крысы и человека пересекаются. Таким образом, при аппроксимации двумя экспонентами были получены гауссовы распределения и для быстрой, и для медленной компоненты, это, вероятно, свидетельствует о различных межмолекулярных сшивках (ферментативных и неферментативных) [21-26], что согласуется с результатами, полученными нами для эластических волокон крыс. Рис. 2. Распределение фотонов по времени жизни первой τ1 (а) и второй τ2 (б) экспоненциальной компоненты; по среднему времени жизни τm (в); по отношению амплитуд медленной и быстрой компоненты а1/а2 (г) Сравнение FLIM характеристик волокон эластина крысы и человека Объект исследования , пс , пс , пс а1/а2 Человек 1300±100 400±70 2300±200 1.20±0.20 Крыса 1230 ±87.6 368.2 ±68.3 2360 ±169 1.46±0.37 Заключение Использование оптических методов в медицине - это перспективное и успешное направление физики, развивающееся в наши дни. Физический метод ДФМ, основанный на анализе данных FLIM, успешно применяется для анализа биологических образцов, в частности, для анализа флуоресцентных характеристик сложных волокон слоев дермы. В данной работе произведен анализ эластиновых волокон внутренней поверхности бедра крысы, расположенных на глубине 30 и 40 мкм, с использованием двухфотонной микроскопии в совокупности с методом анализа FLIM. Изображения, полученные на двухфотонном микроскопе, демонстрируют две основные морфологические структуры сосочкового слоя дермы: волокна коллагена и эластина. Определены флуоресцентные характеристики эластического волокна дермы крысы: времена жизни флуоресценции экспоненциальных компонент при аппроксимации двухэкспоненциальной моделью: , отношение амплитуд флуоресценции медленной и быстрой компоненты: а1/а2 = 1.46±0.37 и среднее время жизни флуоресценции волокна: . Произведенный анализ кривой затухания флуоресценции для волокон эластина был сопоставлен с результатами других исследователей для кожи человека. Флуоресцентные характеристики волокон эластина крыс имеют схожие распределения с флуоресцентными характеристиками волокон эластина человека, что позволяет сделать предположение о возможности использования крыс в качестве модели для изучения человеческих патологий, связанных с изменением флуоресцентных свойств эластина. По гистограммам распределения флуоресцентных параметров мы предполагаем, что эластические волокна представляют собой совокупность флуоресцирующих компонент: ферментативные и неферментативные межмолекулярные сшивки. Найденные флуоресцентные параметры эластина могут быть использованы в дальнейшем для создания программного обеспечения, предназначенного для автоматического поиска данных волокон на изображениях, полученных методом ДФМ. Методы, использованные в настоящей работе, наглядно показывают преимущества применения физических методов в медицине, такие как неинвазивность при изучении in vivo, скорость исследования, точность полученных численных результатов с минимизацией человеческого фактора, возможность многократного неразрушающего контроля, значительная автоматизация диагностического процесса.

Скачать электронную версию публикации