Method for evaluating thrombin concentration based on the data of monitoring the viscoelastic properties of native blood.pdf Введение Гемостаз является сложной иерархически соподчиненной системой, регулирующей поддержание оптимального функционального состояния гемостатического потенциала (ГП) - интегративной составляющей полного цикла гемокоагуляции, обеспечивающей необходимую текучесть крови и предупреждение ее экстравазации при повреждении сосудистой стенки. Расстройства системы гемостаза, изменяющие вязкоупругие характеристики циркулирующей крови, чрезвычайно опасны и могут привести к фатальным осложнениям: кровотечению или тромбозу, что придает особую значимость фундаментальным и прикладным исследованиям свертывания крови [1-4]. Среди методов изучения системы свертывания крови особый интерес представляют «глобальные» методы, позволяющие интегративно и ex tempore оценивать ГП [2, 5-7]. Такая оценка состояния системы гемостаза предусматривает два чрезвычайно важных момента: - работу с нативной кровью (начало анализа непосредственно после забора), образцом, содержащим продуценты эндотелия, факторы свертывания, ингибиторы/активаторы гемостаза и фибринолиза, лекарственные средства и т.д., влияющие на процесс коагуляции; - регистрацию процесса свертывания в условиях стандартизированной контактной активации и графическое отражение его характеристик по изменению вязкоупругих свойств крови при изменении ее агрегатного состояния. Действительно, определяющую роль в изменении вязкоупругих свойств крови играет фибрин, образующийся в результате взаимодействия тромбина и фибриногена [8, 9]. Следовательно, наработка тромбина в результате конкурирующих ферментативных реакций задает динамику образования фибрина, обеспечивая изменение агрегатного состояния крови. По этой причине при анализе состояния ГП особое внимание уделяется оценке кинетики образования и инактивации тромбина как триггеру гемокоагуляции. При этом методика выполнения существующего теста генерации тромбина достаточно сложна, требует специального оборудования и дорогостоящих расходных материалов [10]. С учетом сказанного предполагается возможность оценки генерации тромбина по результатам исследования кинетики конечного продукта свертывания крови - фибрина, наработка которого определяет динамику ее вязкоупругих характеристик при коагуляции. Наиболее подходящей для такой оценки является отечественная технология низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ), в основе которой лежит резонансно-акустический метод определения вязкоупругих характеристик крови при коагуляции в условиях действия периодических сдвиговых деформаций, получаемых с помощью ультразвуковых преобразователей [11-13]. В связи с этим целью исследования явилась разработка физических основ для оценки концентрации тромбина по динамике вязкоупругих характеристик нативной крови в процессе свертывания, вычисленной резонансно-акустическим методом на основе технологии НПТЭГ. Методика исследования В методе НПТЭГ результатом измерения динамики агрегатного состояния крови является кривая интегративного состояния полного цикла гемокоагуляции - зависимости амплитуды электрического сигнала пьезоэлектрического датчика от времени Ai(t). На рис. 1 [13] приведена типичная зависимость от времени амплитуды Ai(t) в процессе коагуляции нативной крови, где каждая точка кривой (Ai) определяется состоянием системы в конкретный момент времени исследования (ti). При измерении регистрируются и определяются следующие параметры: A0 - начальное значение амплитуды в момент времени t0, отн. ед.; t1 - период реакции (время от начала исследования до достижения максимального снижения амплитуды A1); t2 - время достижения амплитуды A2; A2 - увеличение амплитуды на 100 отн. ед.; t3 - время свертывания крови (точка желирования), определяется автоматически при измерении тангенса угла наклона кривой на 50%; A3 - величина амплитуды в точке желирования; A4 - значение амплитуды через 10 мин после достижения точки желирования; t5 - время достижения максимальной амплитуды (A5) (время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры сгустка). Рис. 1. Динамика амплитуды А колебаний сигнала пьезоэлектрического датчика пьезотромбоэластографа в процессе коагуляции нативной крови Указанные на рис. 1 значения амплитуд А0 - А5 являются реперными точками в процессе свертывания крови, характеризуют изменение агрегатного состояния крови на всех этапах фибриногенеза и позволяют количественно оценить вязкоупругие свойства крови [11]. Принцип действия аппарата основан на регистрации изменения сопротивления исследуемой крови резонансным колебаниям иглы-резонатора пьезоэлектрического датчика, закрепленной на пьезоэлектрическом элементе, представляющем собой латунное основание, на котором размещен слой пьезокерамики, разделенный на два круговых сегмента, и опущенной вторым концом в кювету с кровью пациента. На один из пьезоэлектриков подается напряжение, изменяющееся по гармоническому закону. Под действием этого напряжения пьезоэлектрик совершает механические колебания, которые передаются на иглу. При погружении конца иглы-резонатора в жидкость амплитудно-фазовые характеристики напряжения на регистрирующем пьезоэлементе будут изменяться. Это связано с влиянием вязкоупругих свойств жидкости на амплитудно-фазовые характеристики механических колебаний иглы-резонатора. Следовательно, по изменению амплитудно-фазовых характеристик напряжения на регистрирующем пьезоэлементе можно получить информацию о величине вязкоупругих характеристик жидкости. Расчет вязкоупругих свойств крови проводился резонансно-акустическим методом [12] с использованием комплексного представления коэффициента вязкости , где - коэффициент вязкости и коэффициент упругости, связанный с модулем сдвига : , где - частота сдвиговых напряжений. Необходимые амплитудно-частотные и фазовые характеристики в зависимости от вязкоупругих параметров жидкости и частоты вынужденных колебаний иглы-резонатора пьезоэлектрического датчика измерялись на пьезотромбоэластографе АРП-01М (ООО «Меднорд-Техника», РФ). Для нахождения этой зависимости мы использовали теорию вынужденных механических колебаний стержня в вязкой жидкости перпендикулярно его оси в приближении ламинарного обтекания [11]. В итоге модуль комплексного коэффициента вязкости с учетом соотношений , можно вычислить по формуле (1) Основной причиной изменения вязкоупругих характеристик крови в процессе коагуляции является увеличение концентрации фибрина. В соответствии с кинетическим уравнением прямой трансформации фибриногена в фибрин изменение концентрации фибрина будет определяться уравнением [14] , (2) где и - концентрации активированного тромбина, фибриногена и фибрина; - скорость соответствующей биохимической реакции; - коэффициент пропорциональности между кривой сигнала НПТЭГ и скоростью изменения вязкости крови . Из формулы (2) следует . (3) Для определения коэффициента необходимо провести сравнение вычисленного коэффициента вязкости как функции времени с измеренной зависимостью от времени амплитуды (А(t)) колебаний сигнала пьезоэлектрического датчика (рис. 1). Формула (3) лежит в основе метода оценки генерации тромбина на этапах фибриногенеза цельной крови. Результаты исследования На рис. 2 приведены результаты эксперимента по измерению амплитуды электрического сигнала пьезоэлектрического датчика А, представленные кривой 1. Относительное уменьшение амплитуды в начальные моменты времени происходит за счет сдвига собственной частоты колебания иглы-резонатора от ее резонансного значения, которое можно выразить формулой , (4) где - собственная частота колебания иглы-резонатора в воздухе; - безразмерная величина. Кривая 2 на рис. 2 отражает изменение электрического сигнала A1 пьезоэлектрического датчика во времени с поправкой на сдвиг собственной частоты колебания иглы-резонатора. Как показывают расчеты, влияние сдвига частоты существенно в первые моменты времени до мин, когда наработка фибрина незначительна и его количество несущественно влияет на увеличение коэффициента вязкости крови. Рис. 2. Изменение вязкости цельной крови в зависимости от времени: кр. 1 - измеренные значения электрического сигнала пьезоэлектрического датчика А; кр. 2 - учет поправки на уменьшение электрического сигнала пьезоэлектрического датчика А1 с учетом сдвига собственной частоты; кр. 3 - первая производная от кр. 2 по времени Очевидно, момент времени t1, отмеченный на рис. 1, соответствует ситуации, когда два конкурирующих процесса, участвующих в формировании сигнала пьезоэлектрического датчика, - уменьшение амплитуды сигнала пьезоэлектрического датчика вследствие понижения собственной частоты колебаний иглы-резонатора и увеличение амплитуды сигнала вследствие повышения концентрации фибрина, становятся равными по величине в этот момент времени. При t > t1 рост концентрации фибрина оказывает преобладающее влияние на увеличение коэффициента вязкости . Из рис. 2 видно, что кривые 1 и 2 при t > 10 мин практически совпадают. Кривая 3 на рис. 2 показывает изменение концентрации тромбина в отн. ед., определенное из формулы (3). Из рисунка видно, что в первые моменты времени увеличение концентрации тромбина незначительно и линейно зависит от времени, определяясь начальными концентрациями протромбина и фибриногена, но после приблизительно 3 мин наблюдается нелинейный рост (генерация) тромбина, что соответствует включению положительной обратной связи в каскаде ферментативных химических реакций. Максимум концентрации тромбина достигается в момент времени t2 (см. рис. 1), при котором, как следует из формулы (3), вторая производная по времени равна нулю: . (5) Таким образом, точка t2 на рис. 1 является точкой перегиба, после которой экспоненциальный рост концентрации фибрина начинает замедляться за счет уменьшения концентрации тромбина. В точке t2 концентрация тромбина достигает величины начальной концентрации протромбина , это условие позволяет определить коэффициент . С учетом формулы (5) , (6) где - производная в точке t2, в которой . Таким образом, с учетом формулы (6) выражение (3) позволяет определить концентрацию тромбина в абсолютных единицах по известной начальной концентрации протромбина и измеренной зависимости амплитуды колебаний электрического сигнала пьезоэлектрического датчика пьезотромбоэластографа. На рис. 3 приведено сравнение нашего метода оценки концентрации тромбина с применением метода НПТЭГ с тестом генерации тромбина (ТГТ) [10, 15, 16]. Измеряемой характеристикой для метода ТГТ [12] является концентрация тромбина, который образуется при рекальцификации цитратной плазмы крови в присутствии фиксированной концентрации тканевого фактора и флюорогенного субстрата. Для этого метода характерно наличие времени задержки на начальном этапе фибриногенеза, т.е. промежутка времени от внесения смеси флюорогенного субстрата с ионизированным кальцием в емкость с образцом плазмы крови и активатором до момента появления значимого отклонения сигнала, которое не превышает 2 мин. Кроме того, в результате процессов инактивации тромбина происходит уменьшение его концентрации. Следовательно, ТГТ не описывает также и финальный этап образования сгустка - наработку фибрина и его полимеризацию. Таким образом, метод ТГТ, в силу заложенных в него физических принципов, не может описывать весь цикл коагуляции крови на всех этапах фибриногенеза. Напротив, наш метод дает информацию о генерации тромбина на всех звеньях гемокоагуляции в цельной крови [6]. Рис. 3. Графическое представление результатов глобальных тестов системы гемостаза: ТГТ (кр. 1), НПТЭГ (кр. 2) Заключение Предложенный метод оценки концентрации тромбина опирается на постулат о прямо-пропорциональной зависимости изменения концентрации тромбина и скорости изменения комплексного коэффициента вязкости крови, определяемой по результатам измерений динамики вязкоупругих характеристик на основе низкочастотной пьезотромбоэластографии в процессе коагуляции. Метод основан на знаниях о вязкоупругих свойствах крови, изменение которых в процессе ее свертывания определяется наработкой тромбина, вызывающего трансформацию фибриногена в фибрин в результате каскада ферментативных реакций. Данный метод дает информацию о кинетике образования тромбина и фибрина в нативной крови на всех фазах фибриногенеза.

Скачать электронную версию публикации