Electrical explosion of wires for producing bimetallic Ti-Ag and Fe-Ag nanoparticles with antibacterial activity.pdf Введение Биметаллические наночастицы (БНч) в настоящее время активно исследуются в качестве перспективных антимикробных материалов [1]. Среди наночастиц-кандидатов наибольшей доказанной активностью обладают наночастицы серебра против широкого спектра микроорганизмов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы и грибы [2]. Применение серебросодержащих БНч вместо наночастиц серебра в асептических мазях и гелях позволяет снизить концентрацию в них серебра, а следовательно, стоимость и неэффективные потери ценного металла. Кроме того, наличие биологических активных металлов в БНч снижает выраженную цито- и генотоксичность серебра [3]. Так, наночастицы Ag/Ni более эффективно подавляли рост E. coli, S. pyogenes и C. albicans [4] по сравнению с серебряными наночастицами. Стабилизированные поливинилпирролидоном коллоидные растворы для пропитки волокон на основе БНч Ag-Cu, синтезированые авторами [5], обладали повышенной антибактериальной активностью против C. albicans, E. coli и S. aureus. Титан и железо - оптимальный выбор для второго компонента биметаллической частицы. Синергетический антибактериальный эффект проявляли бинарные системы на основе титана, содержащие Ag, Cu, Au [6]. Титановые импланты, содержащие серебро, были устойчивы к биообрастанию [7]. Наночастицы Fe-Ag, использованные в [8], инактивировали широкий спектр бактерий и грибков. Синтезированные при помощи «зеленого» метода БНч Fe-Ag проявляли значительную антибактериальную и антиоксидантную активность [9]. Синтезировать биметаллические наночастицы Ti-Ag и Fe-Ag можно методом совместного электрического взрыва титанового/железного и серебряного проводников в инертной атмосфере. Варьирование условий электрического взрыва проводников позволяет достаточно точно регулировать скорость расширения продуктов взрыва, степень перегрева диспергируемых металлов, соотношение металлических компонент и получать наночастицы требуемой структуры и фазового состава [10]. Целью настоящей работы является выбор параметров электровзрывного диспергирования титановой и серебряной и титановой и железной металлических проволочек для получения биметаллических наночастиц Ti-Ag и Fe-Ag и применение их в качестве модификаторов для создания антибактериальных препаратов. Методика эксперимента Синтез биметаллических наночастиц Ti-Ag БНч Ti-Ag и Fe-Ag получали электровзрывным диспергированием скрутки двух проволок в атмосфере аргона. Проволоки покупались у заводов-изготовителей, заявленное изготовителем содержание металлов в проволоках составляло не менее 99.9 мас. %. Перед использованием с поверхности проволок удаляли загрязнения с помощью органического растворителя. Металлы Ti (Fe) и Ag относятся к различным электрофизическим группам: Ti и Fe - металлы с высокой точкой кипения и высоким теплосодержанием при температуре плавления, а Ag - с низкой точкой кипения и малым теплосодержанием при плавлении. Поэтому взрыв проводников в скрутке происходит несинхронно. В этой связи для получения биметаллических частиц c заданным соотношением компонентов в частице были подобраны оптимальные электрофизические параметры, а именно величина емкости накопителя энергии (С), зарядное напряжение накопителя энергии (U0), давление буферного газа, диаметр и длина проволок. Электрофизические параметры должны были обеспечить реализацию режима диспергирования проволок, близкого к критическому, которому соответствует наибольшее значение энергии, вводимой в проволоку к моменту взрыва. Параметры электровзрывного диспергирования приведены в табл. 1. Таблица 1 Электрофизические параметры синтеза биметаллических наночастиц Образец Проволока Длина проволок, мм d, мм С, мкФ w, мас. % U0, кВ Давление газа 10-5, Па Ti76-Ag24 Ti 60 0.35 1.6 76 29 3.0 (Ar) Ag 0.15 24 Fe75-Ag25 Fe 60 0.30 2.4 75 29 3.0 (Ar) Ag 0.20 25 Синтез композитов Ti-Ag-ПМ и Fe-Ag-ПМ Перед введением в полимерную матрицу (ПМ) нанопорошки деагломерировали в обратноосмотической воде при температуре 25 °С, атмосферном давлении при помощи погружного ультразвукового диспергатора Hilscher UP-100M с частотой 30 кГц, до образования устойчивой суспензии, варьируя время обработки (t). Выбор полимерных матриц обусловлен возможностью создания на их основе мягких лекарственных форм в виде гелей, модифицированных наночастицами. Методика приготовления Ti-Ag-ПМ и Fe-Ag-ПМ включала формирование однофазной гидрофильной системы, хорошо сорбирующейся на поверхности ран, в которой равномерно распределены биметаллические наночастицы. В качестве гидрофильной основы были выбраны 1 мас. % водные растворы полимеров, обладающих низкой токсичностью, гипоаллергенностью, способствующие медленному высвобождению антимикробного компонента, не препятствующие газообмену кожи и не нарушающие деятельность желез. После выбора параметров деагломерации полученные суспензии наночастиц вводили при постоянном перемешивании в водные растворы соответствующих полимеров. Основные характеристики матриц для получения антимикробных гелей и мазей приведены в табл. 2. Таблица 2 Основные характеристики основ для получения антимикробных гелей и мазей Матрица Элементарное звено Применение в биомедицине Поливиниловый спирт В медицине применяется в качестве компонентов лекарственных препаратов, эмболизирующих агентов и заменителя плазмы крови Окончание табл. 2 Матрица Элементарное звено Применение в биомедицине Карбоксиметил-целлюлоза Входит в состав средств для капсулирования и таблетирования, мазей. Придает нужную консистенцию и держит форму на протяжении длительного времени Карбопол Используется в качестве основы для получения гелей, регулирует вязкость в кремах и гелях и стабилизирует эмульсии Глицерин В медицине широко применяется в качестве компонентов лекарственных препаратов Полиакриламид В качестве гелеобразователя применяется в пластической хирургии, в процессе производства контактных линз, в молекулярной биологии Вазелин Состоит из смеси минерального масла и твёрдых парафинов Вазелином широко используется для лечения травм, ожогов, трещин Приготовление экспериментальных составов производили механическим перемешиванием суспензии нанопорошков и водного раствора полимера или мазевой основы (в случае вазелина). В результате были получены составы в виде гелей или мазей, которые хорошо наносились на кожу и равномерно распределялись по ней. Гелевая текстура способствовала равномерному распределению биметаллических наночастиц в объеме основы и предотвращала их агрегацию. Характеристика наночастиц Морфологию и размер наночастиц и их агломератов определяли методом просвечивающей электронной микроскопии (JEOL-2000FX, «JEOL», Япония) и седиментационным методом (CPS 24000, США). Для определения среднего размера наночастиц по данным электронной микроскопии строились гистограммы распределения частиц по размерам (не менее 3000 частиц для построения каждой гистограммы). Фазовый состав определяли с помощью рентгенографического метода на CoKα-излучении (Дрон-7, Россия). Идентификацию фаз проводили с помощью программного комплекса PDF-2 Release 2014 database. Дзета-потенциал определяли методом микроэлектрофореза («ZetaSizer», Великобритания). Антимикробная активность Ti-Ag-ПМ и Fe-Ag-ПМ В работе использовали бактериальный штамм метициллин-устойчивого золотистого стафилококка (MRSA) ATCC 43300 («BioVitrum», Россия). Антимикробную активность определяли стандартным методом серийных микроразведений [11]. Данный метод широко используется для определения минимальной ингибирующей концентрации наночастиц для роста микроорганизмов. Для этого 20 мкл синтезированных гелей в концентрации 10 мг/мл вносили в лунки 96-луночного микропланшета, вводили в каждую 150 мкл бульона Мюллера - Хинтона (НИЦФ, Россия) и 30 мкл суспензии бактерий в концентрации 106 КОЕ/мл. Готовили не менее пяти параллельных проб (лунок). Рост микроорганизмов оценивали через 2, 4, 6, 8, 10 и 12 ч инкубирования культуры при 37 °C при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC («Thermo Fisher Scientific», США). Проводили не менее пяти параллельных измерений для каждой концентрации наночастиц. В качестве контрольного образца использовали лунки, содержащие только 10 мг/мл водного раствора соответствующего полимера и только полимер с наночастицами серебра, полученными методом ЭВП. Для устранения влияния светопоглощения наночастиц значение оптической плотности определяли по разности величины абсорбции образца до и после инкубации. Результаты и их обсуждение На рис. 1 и 2 приведены характерные ПЭМ-изображения и распределения элементов в режиме картирования биметаллических наночастиц Ti-Ag и Fe-Ag. Соотношение металлов в наночастицах сопоставимо с соотношением металлов в диспергируемых проволочках. По данным энергодисперсионного анализа образца Ti-Ag компоненты распределены по объему частиц неравномерно, образуя участки, обогащенные одним из компонентов. При этом наблюдается появление островков серебра на поверхности частиц без образования сплошной оболочки (рис. 1, а). Рис. 1. ПЭМ-изображение БНч Ti-Ag (а) и Fe-Ag (б) При исследовании частиц Fe-Ag (рис. 1, б) видно, что серебро и железо неравномерно распределены по частицам. Встречаются участки, обогащенные одним из компонентов с четкими границами разделения фаз. Формирование подобных наночастиц наблюдалось для системы Ag/Cu при импульсном лазерном осаждении в условиях сверхвысокого вакуума [12] или наночастиц Cu/Pb, как было показано в предыдущем исследовании [13]. Распределение биметаллических наночастиц по размерам, согласно данным статистической обработки ПЭМ-изображений, нормально-логарифмическое для всех образцов. Средний размер частиц Ti-Ag около 70 нм, у образца Fe-Ag - 70-90 нм. На дифрактограммах образцов наблюдается набор рефлексов, соответствующих фазам металлов Ti и Ag или Fe и Ag. Фазы, соответствующие твердым растворам или интерметаллидам, не обнаружены. Соотношение интенсивностей пиков на дифрактограммах хорошо согласуется с соотношением металлов в образцах. Все исследованные образцы Ti-Ag и Fe-Ag имеют отрицательный дзета-потенциал (-19.5±0.6) мВ и (-18.3±0.7) мВ соответственно. Для создания устойчивых суспензий наночастиц и последующего введения в полимерную матрицу проводили деагломерацию водных суспензий наночастиц при помощи ультразвукового (УЗ) излучения. Время обработки выбирали до 5 мин, при дальнейшем увеличении происходил разогрев суспензии при любой мощности воздействия, что приводило к спеканию обрабатываемых наноструктур. Оптимальное время ультразвуковой обработки составило 5 мин при мощности 50 Вт. В данных условиях суспензия нанопорошков не оседала в течение 180 с, достаточных для введения частиц в полимерную матрицу. Исследование обработанных агломератов наночастиц Ti-Ag, Fe-Ag и Ag седиментационным методом с фиксацией динамическим светорассеянием при помощи дисковой центрифуги CPS DC 24000 показало, что все наночастицы имеют бимодальное распределение по размерам (рис. 2). Рис. 2. Распределение агломератов наночастиц по размерам после УЗ-обработки Максимум первой моды лежит в интервале размеров 0.01-0.05 мкм и, вероятно, определяется размером наночастиц. Расположение второго максимума при 0.1-0.2 мкм, возможно, определяет размер агломератов, которые не удалось разрушить при приготовлении пробы. Агломерированность наночастиц является проблемой при введении их в полимерные матрицы. Монометаллические наночастицы с приблизительно одинаковым размером в зависимости от температуры, при которой они вступают в контакт, формируют как агрегаты (низкая температура), так и агломераты (высокая температура). В агрегатах наночастицы металлов связаны слабыми адгезионными силами Ван-дер-Ваальса, а в агломератах, как правило, частицы прочно связаны между собой «шейками», образуя твердые агломераты [14]. Агрегаты наночастиц легко разрушаются при внешних воздействиях, например, ультразвуковым диспергированием. Разрушить твердые агломераты из механически связанных между собой наночастиц является существенно более сложной задачей. Способность образовывать агломераты определяется поверхностной энергией наночастиц (размерным фактором) и температурой плавления металла. Вследствие небольшого размера наночастицы обладают большой удельной поверхностью и соответственно высокой поверхностной энергией, что определяет возможность их низкотемпературного плавления в точке контакта. Температура плавления металла в точке контакта определяется температурой плавления металла в массивном состоянии. Как правило, чем меньше температура плавления металла, тем сильнее агломерированы наночастицы. Кроме факторов, указанных выше, на способность образовывать твердые агломераты влияют оксидные слои, находящиеся на поверхности наночастиц. Рассмотрим формирование агломератов на примере системы Ti-Ag. При пассивации электровзрывного нанопорошка титана на поверхности наночастиц образуется плотный слой оксида, который препятствует образованию твердых агломератов (рис. 3, а), тогда как химически инертные наночастицы серебра образуют твердые агломераты (рис. 3, б). При совместном электрическом взрыве титановой и серебряной проволок наночастицы образуют агломераты и агрегаты. Агломерация наночастиц с образованием шеек происходит через серебряный компонент наночастиц: Ti-Ag-Ti. Агломератов наночастиц, соединенных между собой через титановую часть (Ag-Ti-Ag), обнаружить не удалось (рис. 3, в). Образование твердых агломератов наночастиц, соединенных между собой через их серебряную часть, объясняется тем, что температура плавления серебра (962 °С) ниже, чем температура плавления титана (1670 °С). Исследование физико-химических характеристик модифицированных БНч полимерных материалов показало, что приготовленные гели однородны по составу, показатель рН находится в диапазоне от 6.0 до 6.5, что близко к физиологическому значению рН кожи человека. Через 3 мес. хранения органолептические показатели и рН Ti-Ag-ПМ, Fe-Ag-ПМ Ag-ПМ не изменялись. Исследование спектров поглощения гелей показало, что гели остаются стабильными, смещения полос и снижения их интенсивности не наблюдалось в течение 3 мес. экспозиции при комнатной температуре. Рис. 3. TEM-изображения агломератов наночастиц титана (а), серебра (б) и Ti-Ag (в) Для определения антибактериальной активности гелей использовали суспензионный метод. Исследования проводили на бактериальной культуре S. aureus, устойчивой к метициллину MRSA (клинический штамм). Антимикробная активность Ti-Ag-ПM приведена на рис. 4. Рис. 4. Антимикробная активность мазей и гелей, модифицированных наночастицами Ti-Ag в концентрации 0.1 мг/мл, на основе: а - поливинилового спирта; б - карбоксиметилцеллюлозы; в - карбопола; г - глицерина; д - полиакриламида и е - вазелина Все образцы БНч-ПМ в форме мазей и гелей проявляли высокую антимикробную активность в отношении MRSA, превышающую активность Ag-ПМ. Из исследованных составов наибольшую эффективность проявили гели Fe-Ag-ПМ с карбоксиметилцеллюлозой и гели Ti-Ag-ПМ и Fe-Ag-ПМ с карбополом. Выводы Методом совместного электрического взрыва двух проводников в атмосфере аргона синтезированы нанопорошки из биметаллических наночастиц Ti-Ag и Fe-Ag, которые представляют собой слабо связанные агрегаты янус-наночастиц и твердые агломераты, в которых частицы связаны «шейками» из серебра. Отрицательный заряд частиц и способность к дезагрегации под действием ультразвука позволяют использовать нанопорошки в качестве антимикробных модификаторов ряда водорастворимых полимеров и вазелина с формированием стабильных гелеобразных и мазевых составов. Антимикробная активность модифицированных составов превышает активность серебряных наночастиц в отношении MRSA.

Скачать электронную версию публикации