Fluorescence of laurdan in water-micellar solutions.pdf Введение Наиболее распространенным способом изменения спектрально-люминесцентных свойств органической молекулы является изменение свойств среды (окружения молекулы). Самым простым способом является использование смесей полярных растворителей, неполярный и полярные растворители, что приводит к созданию сред с различными донорно- акцепторными и диэлектрическими свойствами [1-3]. Для биохимических и биофизических исследований эти среды непригодны, так как ферменты теряют в них свою активность [4]. Принципиально другой путь открывает применение мицеллообразующих поверхностно-активных веществ (ПАВ)-детергентов. Водные растворы ПАВ при определенных условиях представляют ультрамикрогетерогенные системы (организованные среды), возникающие в результате самоорганизации дифильных молекул ПАВ с образованием супрамолекулярных систем (мицелл), способных солюбилизировать молекулы и влиять на межмолекулярные взаимодействия (ММВ) и фотофизические процессы в молекулах [5]. Использование мицеллярных растворов ПАВ как растворителей позволило улучшить метрологические характеристики спектрофотометрических и флуорометрических методов анализа и разработать их новые варианты [6-8]. Из неионогенных детергентов в биохимических исследованиях часто используется Тритон Х-100. Многие белки плохо растворимы в водных буферных растворах. Добавление Тритона X-100 зачастую улучшает их растворимость и не влечет за собой их денатурацию, сохраняя вторичную и третичную структуру белков [9]. В работе [10] исследовалось распределение неионогенного детергента Тритона Х-100 в бислоях трех видов липидов. При этом получена различная восприимчивость к солюбилизации, которую авторы [10] связывают либо с насыщенностью бислоя детергентом, либо с образованием смешанных липид-детергентных мицелл. В течение последних лет флуоресцентные зонды стали незаменимыми средствами исследования живых клеток, обогатив клеточную биологию новыми быстрыми и точными методами количественного анализа [11-14]. Благодаря использованию флуоресцентных зондов появляется возможность оценки конформационного состояния белков, физического состояния мембранных липидов непосредственно в ткани [11, 15]. Флуоресцентный зонд лаурдан использовался в 1990 г. как индикатор на наличие двух состояний (гель и жидкокристаллическое) в модельных мембранных системах [16], в 2015 г. - для исследования анализа гетерогенности клеточной мембраны с различными свойствами, такими, как содержание воды и холестерола [17], в 2018 г. - для изучения влияния H2O2 на динамику мембран NIH3T3 [18]. Интерпретация данных биохимических и биофизических исследований с использованием лаурдана требует детальных сведений о его флуоресцентных свойствах в различном окружении. В работе исследованы флуоресцентные свойства лаурдана в гомогенных растворителях различной химической природы и водно-мицеллярных растворах. При этом решались следующие задачи: выяснялась роль общих эффектов растворителя, специфических взаимодействий в смещение полосы флуоресценции, изучались особенности флуоресценции лаурдана в водно-мицел¬лярных растворах Тритона Х-100 и проводилась оценка полярности окружения молекулы лаурдана в ВМР. Исследование в гомогенных растворителях проводилось и ранее [19, 20], но при интерпретации данных учитывалась диэлектрическая проницаемость  и нормализованный параметр полярности . Донорно-акцепторные свойства растворителя (параметры основности (SB) и кислотности (SA)) не учитывались. 1. Методы исследования Объектом исследования являлся флуоресцентный зонд лаурдан (6-додеканоил-2-диметил¬аминонафталин) (рис. 1) с величиной сдвига в зависимости от растворителя 2300-6300 см-1. Молекула лаурдан является производной нафталина, имеющая длинную углеводородную часть (СH2)10 и карбонильную группу, что способствует различным типам взаимодействия в негомогенных средах. Рис. 1. Структура молекулы лаурдан Для приготовления ВМР использовался Тритон Х-100 (рис. 2), который представляет собой вязкое при комнатной температуре вещество. Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) [21-24] Тритона X-100: 2•10-5- 6.8•10-5 М, радиус сферической мицеллы - 5 нм [5]. Тритон Х-100 имеет в составе молекулы гидрофобный (4-третоктилфенол) 1 и гидрофильный фрагменты 2 (рис. 2) и является модельной системой при изучении биологических объектов. Рис. 2. Структура молекулы Тритон Х-100 Флуоресцентный зонд лаурдан в воде плохо растворяется. Водно-мицеллярные растворы лаурдана готовили двумя способами: 1) лаурдан растворяли в заранее приготовленном ВМР; 2) лаурдан растворяли в Тритоне Х-100 и затем исследовали при различных концентрациях воды, сохраняя объем Тритона Х-100 постоянным. Несмотря на использование Тритона Х-100, свойства его как растворителя (, SA, SB, ) в известной нам литературе не приводятся. Концентрация мицелл в растворе рассчитывается по формуле , (1) где СПАВ - концентрация ПАВ; СККМ - концентрация ККМ; А - число агрегации (150) [24]. Смещение полосы флуоресценции для растворителя {2} относительно растворителя {1} описывается формулой (2) где α1, α2 - радиусы полостей, внутри которых находится флуорофор; h - постоянная Планка; с - скорость света; μ1, μ2 и μ1*, μ2*- дипольные моменты флуорофора в различном окружении в основном и возбужденном состояниях соответственно; f() - низкочастотная поляризуемость; f(n) - высокочастотная поляризуемость. При оценке смещения полосы необходимо иметь данные по дипольным моментам молекулы и макрохарактеристикам растворителей (, n). Расчет дипольного момента проводился в рамках метода TDDFT (Time-Dependent Density Functional Theory) [25] с функционалом B3LYP и базиса атомных орбиталей TZV (пакет программ GAMESS US) [26]. Ab initio расчеты проводились на базе вычислительного кластера «СКИФ Cyberia» в межрегиональном суперкомпьютерном центре Томского госуниверситета [27]. Расчеты в ряду растворителей (циклогексан, этанол, ацетон, метанол, тетрагидрофуран) проведены методом PCM (Polarized Continuum Model). Значения  и n приведены из справочника [3]. Определение возможных центров взаимодействия молекулы с протонодонорными растворителями было проведено при помощи метода молекулярного электростатического потенциала (МЭСП) [28]. Электронные спектры флуоресценции регистрировались на установке для снятия спектров люминесценции СДЛ-2. Источник возбуждения - галогенная Н1 лампа. Толщина слоя 1 см. Эксперименты проводились при комнатной температуре. В работе использовались вещества со степенью чистоты: лаурдан (Fluka), Тритон X-100 (BioXtra). Длина волны возбуждения выбиралась из длинноволновой полосы спектра поглощения лаурдана [29]. В работе применен метод четных производных от спектров флуоресценции, который является источником дополнительной информации при разделении полос и выделении слабых максимумов (перегиб, плечо в спектре) [30]. При обработке спектров флуоресценции определялся фактор асимметрии и полуширина полосы [31]. 2. Обсуждение результатов Согласно приведенной формуле (2), для смещения полосы флуоресценции молекулы влияние растворителя учитывается через макрохарактеристики  и n, которые входят в формулу для частоты флуоресценции через функции низкочастотной поляризуемости f() = (-1)/(2+1) и высокочастотной поляризуемости f(n) = (n2-1)/(2n2+1). Для описания влияния растворителя существует ряд формул: широко используемая формула Липперта [32], более сложные выражения в работах [1, 33]. В этих работах растворитель рассматривается как некий континуум с включенной в него молекулой флуорофора. Свойства флуорофора входят в формулу (2) через радиус Онзагера (α) и дипольные моменты μ и μ* и их разность [1, 32]. Полученные дипольные моменты, рассчитанные авторами ранее указанным методом в различных растворителях, приведены в табл. 1. Таблица 1 Значения дипольных моментов (, D) для лаурдана в S0- и S1-состоянии для различных сред Среда Тетрагидрофуран Метанол Ацетон Этанол Циклогексан S0 8.8 9.2 9.1 9.2 7.5 S1 17.9 18.9 18.7 18.8 15.1 Дипольный момент при переходе S0→S1 увеличивается примерно в 2 раза для всех растворителей. Проведена оценка дипольного момента для возбужденного состояния на основе формулы Липперта [32] . (3) В качестве растворителя в расчет принимался тетрагидрофуран (ТГФ). Значение величины μ было выбрано из проведенного нами теоретического расчета в пакете программ GAMESS для состояния S0 (8.8 Д). При расчете учитывалось, что углеводородная цепочка является максимально скрученной и радиус полости 4.2 Å. Приближенное значение дипольного момента возбужденного состояния составило 22 Д. Рассмотрим зависимость энергий переходов S1-S0 от величины диэлектрической проницаемости, полученных методом TDDFT. Значительная разница в энергии, полученной экспериментально и теоретически, наблюдается для полярного растворителя (4200 см-1), а наименьшая - для циклогексана (300 см-1). Таким образом, учет свойств растворителя через диэлектрическую проницаемость не согласуется с экспериментальными данными. Отметим, что в настоящее время нет единой величины, которая бы характеризовала полярность растворителя. Есть несколько подходов к решению этого вопроса [34], но, как правило, диэлектрической проницаемостью пользуются всегда. Это использование не всегда адекватно [2]. Из рассмотрения исключаются специфические взаимодействия флуорофор-растворитель. Эти взаимодействия при интерпретации экспериментальных данных учитывались через параметры, отражающие химическую природу растворителя: параметр основности и кислотности растворителей. Эти параметры приведены в [35] и были использованы в настоящей работе для рассматриваемых растворителей. Перейдем к обсуждению флуоресцентных свойств лаурдана с использованием трех параметров растворителя: , SA, SB. 2. 1. Флуоресценция лаурдана в гомогенных растворителях Рассмотрим флуоресценцию лаурдана в растворителях, у которых параметр кислотности SA = 0 (табл. 2). Таблица 2 Характеристики полосы флуоресценции лаурдана в растворителях с основными свойствами Растворитель λфлmax/ νфлmax , Å/см-1 Полуширина Δν1/2, см-1  f(n)** Фактор асимметрии Р SA SB f() Δν, см-1 Ацетон 4470/22370 2660 20.56 0.180 1.3 0.000 0.475 0.464 2830 Диоксан 4260/23470 2380 2.21 0.214 1.3 0.000 0.444 0.223 1730 Этилацетат 4310/23200 2560 6.02 0.185 1.5 0.000 0.542 0.384 2000 Ацетонитрил* 4530/22070 2700 38.8 0.175 1.4 0.044 0.286 0.481 3130 ТГФ* 4320/23150 2670 7.32 0.195 1.4 0.000 0.591 0.404 2050 Циклогексан 3960/25200 2610 2.03 0.200 1,5 0.202 0 Примечание. * Данные по спектрам поглощения и испускания лаурдана в ацетонитриле и ТГФ заимствованы из [20]; ** значение показателя преломления (n) в пределах от 1.359 до 1.426. Полоса флуоресценции в указанных растворителях асимметрична (P = 1.3-1.5) (рис. 3). Приведенные основные растворители значительно отличаются по диэлектрической проницаемости (в 10 раз) и близки по параметру основности, за исключением ацетонитрила (0.286). При близких значениях ε и SB (этилацетат, тетрагидрофуран), νmax флуоресценции, Δν1/2 и фактор асимметрии совпадают. При всех значениях диэлектрической проницаемости контуры полос сохраняются. Самое большое смещение относительно циклогексана (инертный растворитель) Δν - в ацетонитриле, хотя значение параметра основности SB самое маленькое (0.286) (табл. 2). В ацетоне и ацетонитриле λmax флуоресценции близки, хотя диэлектрическая проницаемость и отличается в 2 раза, а SB в 1.7 раза. Это связано с тем, что в формулы, определяющие сдвиг полосы флуоресценции [1, 32], входит f(), а f() для ацетона и ацетонитрила близки: 0.464 и 0.481. Таким образом, смещение полосы флуоресценции в указанном ряду растворителей определяется функцией низкочастотной поляризуемости f(). Рис. 3. Спектры флуоресценции лаурдана в Тритоне Х-100 (кр. 1а) и его вторая производная (кр. 1b), изопропаноле (кр. 2), ацетоне (кр. 3), этилацетате (кр. 4) Перейдем к рассмотрению взаимодействия с протонодонорными растворителями. Методом МЭСП определены возможные центры взаимодействия. При рассмотрении нижнего возбужденного состояния расчет показал два плоскостных минимума, локализованные вблизи атома кислорода C=O-группы (-550 и -472 кДж/моль). Используемые протонодонорные растворители можно отнести к разным группам: SA > SB (метанол, глицерин), SA < SB (этанол) и SA SB, дают больший сдвиг полосы флуоресценции. Все протонодонорные растворители образуют Н-связь по карбонильной группе лаурдана. Но точно оценить вклад Н-связи в смещение полосы можно только для случая, когда сравнение происходит с основным растворителем с близким значением диэлектрической проницаемости и параметром основности, т.е. для используемых растворителей в табл. 3, этому условию удовлетворяет глицерин и менее точно этанол. Получаем 2190 см-1 для глицерина и 2090 см-1 для этанола. Таким образом, вклад в смещение полосы флуоресценции за счет водородной связи 2090- 2190 см-1, а за счет общих эффектов растворителя 2830-3130 см-1. Зависимость максимума полосы флуоресценции лаурдана в растворителях с различными параметрами (основности, кислотности) от диэлектрической проницаемости делится на две группы (рис. 4): первая содержит растворители, обладающие кислотными и основными свойствами (изопропанол, этанол, метанол, глицерин); вторая - растворители с преобладающими основными свойствами (ацетонитрил, ацетон, тетрагидрофуран, этилацетат). Рис. 4. Зависимость λфлmax лаурдана от диэлектрической проницаемости растворителя 2. 2. Определение параметров растворителя Тритон Х-100 В работе использовали растворитель ПАВ-Тритон Х-100 для приготовления водно-мицеллярного раствора. Для лаурдана в Тритоне Х-100 максимум флуоресценции соответствует 4490 Å (22270 см-1), что совпадает с λфлmax ацетона. Контур полосы лаурдана в Тритоне Х-100 и ацетоне подобен: симметричен в коротковолновой области (4000-4490 Å / 25000-22270 см-1) и асимметричен в длинноволновой области (4490-6000 Å / 22270-16600 см-1) (см. рис. 3). Факторы асимметрии одинаковы (1.3). В Тритоне Х-100 полуширина полосы флуоресценции больше на 700-800 см-1 относительно других гомогенных растворителей. Метод второй производной флуорометрии показывает наличие четко выраженного перегиба в длинноволновой области (рис. 3). Для Тритона Х-100 параметры растворителей, ранее использованные для остальных растворителей (SA, SB, ε), неизвестны. На основании собственных экспериментальных исследований для молекулы лаурдана была построена зависимость максимумов полос флуоресценции в различных растворителях от указанных величин (рис. 5). На основе линейной зависимости λфлmax от SA было получено следующее значение для Тритона X-100: 0.073±0.019. Линейной зависимости для SB не наблюдается. Отметим, что SB для Тритона Х-100 попадает в интервал 0.475-0.286. Рис. 5. Зависимость максимума флуоресценции лаурдана от параметра кислотности (▼) и основности (●) растворителя Диэлектрическая проницаемость растворителей имеет интервал 7.32-42.5 (тетрагидрофуран - глицерин) (рис. 4). Максимум полосы флуоресценции в Тритоне Х-100 449 нм. Согласно рис. 4, получим ε = 21.6. По зависимости положения максимумов флуоресценции лаурдана в растворителях от нормализованного параметра полярности последний для Тритона Х-100 равен 19. 2. 3. Флуоресценция лаурдана в водно-мицеллярных растворах Перейдем к рассмотрению спектров флуоресценции лаурдана в водно-мицеллярном растворе при концентрации ПАВ 0.016 М, что превышает критическую концентрацию мицеллообразования. Спектры флуоресценции лаурдана в ВМР, приготовленном двумя способами, указанными в методах исследования, идентичны в шкале частот и не зависят от длины волны возбуждения (3700-4000 Å). Полоса флуоресценции лаурдана в ВМР резко отличается от полос флуоресценции в других растворителях: полоса асимметрична в коротковолновой области (четко выражен перегиб на 4300 Å), полуширина полосы 4050 см-1 и фактор асимметрии 0.7 (табл. 4). Таблица 4 Спектральные характеристики лаурдана в растворе Тритон Х-100 с различными добавками воды Раствор (соотношение Тритона Х-100 и воды) Концентрация Тритона Х-100, М Концентрация лаурдана, М Концентрация мицелл λфлmax, Å I(раствора) / I0 (лаурдан в Тритоне Х-100) Фактор асимметрии, ρ Δν1/2, см-1 - Лаурдан в Тритоне Х-100 8•10-5 - 4485 1 1.2 3370 1:25 68•10-3 8•10-5 4.53•10-4 4830 0.87 0.7 4020 1:50 34•10-3 4•10-5 2.27•10-4 4805 0.59 0.8 4090 1:75 23•10-3 2.7•10-5 1.53•10-4 4820 0.49 0.7 4050 1:100 17•10-3 2•10-5 1.13•10-4 4815 0.41 0.7 4070 1:350 5•10-3 6•10-6 0.33•10-4 4805 0.15 0.7 4090 Полоса с λ = 4300 Å соответствует молекуле лаурдана, связанной с мицеллой, образованной гидрофобными фрагментами (4-третоктил-фенола) и наблюдается при концентрации мицелл больше концентрации флуорофора. При исследовании флуоресценции лаурдана в растворе (эта- нол + Тритон Х-100) коротковолновая полоса отсутствует, поскольку мицеллы в этаноле не образуются. Наблюдаемую полосу 4300 Å связываем с гидрофобным взаимодействием (взаимодействие молекулы лаурдана с ядром мицеллы). Ранее было проведено определение возможных центров взаимодействия лаурдана с протонодонорным растворителем: водородная связь по карбонильной группе [36]. Если учесть, что в ряду гидроксилсодержащих растворителей вода наиболее кислый растворитель [35], то комплексу по карбонильной группе должна соответствовать большая λmax, чем в метиловом спирте (498 нм). В работе [37] приводится максимум флуоресценции в воде 529 нм. Полоса флуоресценции, соответствующая комплексу с образованием водородной связи по карбонильной группе, не обнаружена. Вторая полоса λ = 4750 Å соответствует молекуле лаурдана с сольватной оболочкой из гидрофильного фрагмента, обладающего основными свойствами. Гидрофильный фрагмент представляет собой мантию из сильно скрученных оксиэтиленовых цепочек, которые связаны водородной связью с молекулами воды, а молекула лаурдана оказывается в окружении этого гидрофильного фрагмента [38]. Рассмотрим результаты эксперимента по исследованию флуоресценции раствора лаурдана, растворенного в Тритоне X-100 с различными добавками воды (рис. 6, табл. 4). При увеличении концентрации воды происходит уменьшение интенсивности в максимуме полосы флуоресценции, полуширина и фактор асимметрии при этом не меняются (табл. 4). При дальнейшем добавлении воды (1:2000) параметры полосы флуоресценции сохраняются. Двухполосная флуоресценция наблюдается при концентрации мицелл больше концентрации лаурдана. В экспериментальной полосе с максимумом полосы 4805-4830 Å видим отчетливый изгиб в коротковолновой области (область изгиба 4200-4500 Å), λср = 4350 Å, минимум в спектре второй производной 4335 Å. Ориентируемся на эти значения и рис. 5, который отражает зависимость λmax от параметра основности, и получаем диэлектрическую проницаемость окружения лаурдана в диапазоне 7.5-9. Рис. 6. Спектр флуоресценции раствора лаурдана в Тритоне X-100 (кр. 1) и лаурдана в Тритоне X-100 с различными добавками воды при следующих соотношениях Тритона Х-100 и воды: кр. 2 - 1:25; кр. 3 - 1:50; кр. 4 - 1:75; кр. 5 - 1:100; кр. 6 - 1:350 Что касается второй полосы лаурдана в растворе ВМР, то оценку диэлектрической проницаемости для неё проводим по рис. 5 (зависимость λфлmax от  для гидроксилсодержащих растворителей). Интервалу 4805-4830 Å соответствует диэлектрическая проницаемость 24-27. Таким образом, применение в качестве растворителя для лаурдана наноразмерной системы (вода + Тритон Х-100, радиус мицеллы 5 нм) приводит к двум типам окружения лаурдана: менее полярному в коротковолновой области и более полярному в длинноволновой области. Заключение 1. Оценен вклад общих эффектов растворителя в смещение полосы флуоресценции (2800- 3100 см-1) и специфических взаимодействий (1990-2190 см-1). 2. Сольватофлуорохромию лаурдана в гомогенных растворителях следует рассматривать с учетом диэлектрической проницаемости, параметров основности и кислотности растворителей. 3. Для лаурдана использование в качестве среды ВМР при концентрации ПАВ выше ККМ приводит к значительному изменению его флуоресцентных свойств по сравнению с гомогенными растворителями, что проявляется в: а) изменении контура полосы флуоресценции; б) появлении новой полосы флуоресценции на 4300 Å в коротковолновой области (относительно максимума полосы флуоресценции), обусловленной гидрофобной сольватацией лаурдана, при этом Тритон Х-100 занимает от общего объема раствора менее 0.3 %; в) отсутствии взаимодействия (водородной связи) по карбонильной группе лаурдана с молекулами воды. 4. На основе данных по сольватофлуорохромии лаурдана в различных гомогенных растворителях определены параметры растворителя Тритон Х-100 и оценена диэлектрическая проницаемость микроокружения лаурдана в ВМР. 5. Показано, что для растворителей, способных к образованию Н-связей, с молекулами флуорофора вклад универсальных взаимодействий в величину изменения энергии ππ*-состояния больше, чем вклад, обусловленный Н-связью.

Скачать электронную версию публикации