Absorption and fluorescence spectra of sulgin in the presence of methylene blue.pdf Введение В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов анализа остаточных концентраций антибиотиков в пищевых продуктах. Создание новых вариантов флуоресцентных меток с длиной волны флуоресценции более 600 нм является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Введение зондов в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе их спектральных свойств, а также изучения связи между их структурой и оптическими проявлениями. Накопление лекарств в организме человека в связи с потреблением молока и молочных продуктов наносит большой вред его здоровью. Это связано, прежде всего, с тем, что часто снижается иммунитет, может развиться аллергия или дисбактериоз. По некоторым данным - наблюдается увеличение веса. Тетрациклин может стать причиной снижения аппетита, вызвать проктит или гастрит, а также фотосенсибилизацию кожи (повышенную чувствительность к УФ-лучам). Сульгин оказывает противодиарейное и антибактериальное действие, проявляет высокую активность в отношении возбудителей кишечных инфекций [1-5], однако вызывает заболевания органов ЖКТ. Остаточные количества антибиотиков вредят печени и способны нарушить состав крови. Стрептомицин вреден для нервной системы. Левомицетин, который ветеринары применяют довольно часто, угнетает кроветворную систему. Антибиотики подавляют активность ферментов, изменяют микрофлору в человеческом организме, распространяя ее устойчивые виды. Кипячения эти медпрепараты не боятся. В сухом молоке их не меньше, чем в исходном сырье, при сушке они не разрушаются. Накопление антибиотиков становится причиной возникновения устойчивости (резистентности) организма по отношению к медикаментам. При воспалительном заболевании лекарства окажутся неэффективными. С практической точки зрения очень важно разработать экспрессный метод анализа антибиотиков в пищевых продуктах. Флуоресцентная спектроскопия является надежным методом исследования веществ при низких концентрациях в фотовозбужденных состояниях. Для разработки метода в данной работе проведено изучение спектральных свойств сульгина в присутствии метиленового синего в воде. Методы спектроскопии электронного поглощения и флуоресценции используются для оценки свойств исследуемых молекул, вступающих в специфические и ван-дер-ваальсовы, гидрофобные и электростатические взаимодействия между сульгином и метиленовым синим (МВ). Объекты и методы исследования Объекты нашего исследования - n-аминобензолсульфонилгуанидина моногидрат (сульгин), синтезирован коммерческой фирмой «Sigma-Aldrich» (артикул Si-Al S8751-25G), и метиленовый синий. Структурные формулы объектов приведены на рис. 1. Сульгин - белый мелкокристаллический порошок, мало растворим в воде. Для получения матричного раствора сульгина при концентрации 1 мМ сухую навеску растворяли в дистиллированной воде с помощью ультразвуковой мешалки. Спектры поглощения и флуоресценции исследуемых растворов регистрировали на спектрофотометре VARIAN Cary 5000 Scan UV-VIS-NIR («AgilentTech.», США - Нидерланды - Австралия) и спектрофлуориметре VARIAN Cary Eclipse («AgilentTech.», США - Нидерланды - Австралия) при комнатной температуре в области 200-800 нм. Измерения проводились с помощью кварцевой кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Окислительно-восстановительные и агрегационные свойства МВ используются в молекулярно-биофизических исследованиях и нанотехнологиях при моделировании биофизических процессов и разработке схем функционирования наноустройств на молекулярном уровне [6-9]. Полезные применения МВ в нанотехнологиях основываются на связи его агрегационных свойств: переход мономер - димер. Молекулярный механизм биологического действия для мономерной и димерной форм МВ различается. Рис. 1. Структуры сульгина (а) и метиленового синего (б) Методом производной спектофотометрии были получены полосы, проявляющиеся лишь в виде скрытых максимумов и нечетких перегибов в спектре поглощения. Этот метод основан на тех же принципах, что и обычная спектрофотометрия, однако аналитическим сигналом служит не оптическая плотность, а ее производная n-го порядка (обычно по длине волны). Дифференцирование спектра позволяет более четко находить положение максимума полосы поглощения, а также сужает полосы и позволяет определять вещества, поглощающие при близких длинах волн, исходные спектры которых частично накладываются друг на друга. Согласно этой методике, удалось выделить электронные переходы в экспериментальных спектрах поглощения сульгина, метиленового синего и их смеси в воде. Спектроскопические характеристики сульгина находили из спектра поглощения и рассчитывали по известным формулам: , (1) где ε - коэффициент экстинкции; D - оптическая плотность в максимуме; С - концентрация вещества в растворе; l - оптическая толщина раствора в сантиметрах; , (2) где f - сила осциллятора; F - корректирующий множитель; ν - частота; , (3) где n - коэффициент поглощения растворителя; , (4) где τ0 - среднее время жизни синглетного возбужденного состояния; - средняя частота полосы поглощения в см-1; , (5) где S1, S2 - площади под спектрами флуоресценции фенола и сульгина соответственно; φ1, φ2 - квантовые выходы фенола и сульгина; D1, D2 - оптические плотности поглощения на длине волны возбуждения флуоресценции фенола и сульгина; , (6) где τ - собственное время жизни флуоресценции. Результаты и их обсуждение Электронные спектры поглощения и флуоресценции сульгина и метиленового синего В работе [10] приведены исследования электронных спектров МВ в различных растворителях и описана природа электронных переходов. Было показано, что моделирование комплексообразования МВ путем присоединения атома кислорода к атому серы и протонирования по атому азота фенотиазинового кольца описывает появление длинноволновой полосы в спектре поглощения молекулы в области 650-700 нм при переходе от неполярного растворителя к полярному. Следует ожидать взаимодействия окружения с молекулой МВ по центральным атомам азота и серы. Авторы сделали вывод, что взаимодействие по центральным атомам азота и серы с молекулами растворителя намного эффективнее, чем по атомам азота N(CH3)2-групп. На рис. 2 приведены спектры поглощения сульгина, МВ и их комплекса в воде. Вертикальными стрелками с помощью второй производной указаны электронные переходы, образующие экспериментальные полосы в спектрах индивидуальных молекул и их комплекса с молекулами воды. Рис. 2. Спектры поглощения сульгина 0.05 мМ (а), метиленового синего 0.05 мМ (б) и их комплекса (в) в воде. Изменение оптической плотности поглощения МВ в воде от концентрации (г). Стрелками указаны электронные переходы, полученные методом второй производной Длинноволновая полоса поглощения сульгина в воде образована одним электронным переходом, коротковолновая - двумя (рис. 2, а). Интерес представляет спектр поглощения комплекса сульгина и МВ в воде, приведенный на рис. 2, в. Из рисунка видно, что в спектре появляются дополнительные электронные переходы, которые указывают на образование молекулярного комплекса в основном состоянии. Этот комплекс достаточно устойчивый. Изменение оптической плотности поглощения МВ в воде от концентрации приведено на рис. 2, г. Из рисунка видно, что в пределе концентраций от 510-6 до 10-4 М изменение интенсивности поглощения имеет линейную зависимость. Это говорит о том, что МВ в воде находится в мономерной форме. Совсем противоположная ситуация наблюдается в спектрах флуоресценции МВ в воде (рис. 3). Линейная зависимость интенсивности флуоресценции МВ сохраняется только до 0.02 мМ (рис. 4). При увеличении концентрации МВ в воде максимум полосы флуоресценции сдвигается в область длинных волн и интенсивность полосы падает. Это, по-видимому, связано с образованием димеров в возбужденном состоянии. Для сульгина линейная зависимость интенсивности в спектрах поглощения от концентрации сохраняется в области от 510-6 до 210-4 М. В спектрах флуоресценции зависимость интенсивности сульгина от концентрации имеет линейный характер в пределах 510-6-7.510-5 М. На рис. 5 приведены спектры флуоресценции сульгина в воде. Квантовый выход флуоресценции составляет 0.28 (таблица). Рис. 3. Изменение интенсивности флуоресценции MB в воде от концентрации, М: кр. 1 - 510-6; кр. 2 - 7.510-6; кр. 3 - 10-5; кр. 4 - 2.510-5; кр. 5 - 510-5; кр. 6 - 7.510-5; кр. 7 - 10-4. Длина волны возбуждения флуоресценции 660 нм Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции МВ в воде от концентрации. Длина волны возбуждения флуоресценции 660 нм Рис. 5. Спектры флуоресценции сульгина в воде: кр. 1 - 510-6; кр. 2 - 7.510-6; кр. 3 - 10-5; кр. 4 - 2.510-5; кр. 5 - 510-5; кр. 6 - 7.510-5; кр. 7 - 10-4; кр. 8 - 2.510-4 М. Длина волны возбуждения флуоресценции 260 нм Спектральные характеристики сульгина в воде νпогл/λпогл, см-1/нм νфл/λфл, см-1/нм 1/2, см-1 СТ, см-1 ε, 1/(смМ) τ0107, с τ107, с f kr10-8, с-1  50800/197 29000/340 4700 9700 13200 2.3 0.6 0.19 4 0.28 48100/207 38600/270 Примечание. νпогл (λпогл) - максимум полосы поглощения; νфл (λфл) - максимум полосы флуоресценции; τ - время жизни возбужденного состояния; f - сила осциллятора; kr - константа скорости радиационной конверсии; ε - молярный коэффициент экстинкции; СТ - стоксов сдвиг; 1/2 - полуширина полосы на полувысоте,  - квантовый выход флуоресценции. Спектры флуоресценции сульгина в присутствии метиленового синего Рис. 6. Спектр флуоресценции смеси MB и сульгина в воде. Концентрация МВ в воде - 0.05 мМ. Концентрация сульгина, М: кр. 1 - 510-6; кр. 2 - 7.510-6; кр. 3 - 10-5; кр. 4 - 2.510-5; кр. 5 - 510-5; кр. 6 - 7.510-5; кр. 7 - 10-4; кр. 8 - 2.510-4. Длина волны возбуждения флуоресценции 250 нм Рис. 7. Спектр флуоресценции смеси MB и сульгина в воде. Концентрация МВ в воде - 0.05 мМ. Концентрация сульгина, М: кр. 1 - 510-6; кр. 2 - 7.510-6; кр. 3 - 10-5; кр. 4 - 2.510-5; кр. 5 - 510-5; кр. 6 - 7.510-5; кр. 7 - 10-4; кр. 8 - 2.510-4. Длина волны возбуждения флуоресценции 660 нм Рис. 8. Тушение флуоресценции MB в воде. Концентрация МВ в воде - 0.05 мМ Как указывалось выше, спектр поглощения смеси сульгина и МВ в воде (см. рис. 2, в) не является суммарным спектром отдельных компонент, появляются полосы, которые принадлежат комплексу сульгина и МВ. Спектры флуоресценции смеси сульгин + МВ в воде регистрировали на двух длинах волн возбуждения: 260 и 660 нм (рис. 6 и 7). При возбуждении в область 260 нм зафиксирована флуоресценция сульгина в смеси. В присутствии МВ интенсивность флуоресценции сульгина снижается (рис. 6). Более заметные изменения происходят в полосе флуоресценции МВ (рис. 7): интенсивность падает почти на порядок. Это означает, что происходит тушение флуоресценции МВ сульгином (рис. 8). Прямолинейная зависимость в координатах Штерна - Фольмера [11] обычно указывает на существование в растворе одного типа флуорофоров, одинаково доступных тушителю. Константа взаимодействия МВ с сульгином равна 2.510-3 М-1. Если принять во внимание, что время затухания флуоресценции МВ около 3 нс, то кажущаяся бимолекулярная константа тушения окажется равной 81011 М-1с-1. Полученное значение больше, чем это возможно для диффузно контро¬лируемой реакции. Для идентификации статистического и динамического тушения необходимы исследования времен затухания флуоресценции или зависимости тушения от температуры. Из анализа спектров поглощения МВ и сульгина (см. рис. 2) можно сделать вывод, что образуется комплекс между МВ и сульгином уже в основном состоянии. Связанные в комплекс МВ и сульгин не флуоресцируют, и наблюдается флуоресценция только несвязанных флуорофоров (рис. 6 и 7). Заключение Полученные результаты могут быть полезными на практике для микроскопии биологических тканей, где необходим свет с большей длиной волны для лучшего проникновения в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин - основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 900 нм. Сульгин в воде обладает хорошей поглощательной способностью ( = = 13200 см-1М-1), высоким стоксовым сдвигом (9700 см-1) и относительно высоким квантовым выходом флуоресценции ( = 0.28). Практическая значимость полученных результатов заключается в том, что использование метиленового синего с максимумом флуоресценции около 700 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции при обнаружении сульгина в биологических системах. Константа взаимодействия метиленового синего с сульгином составляет 2500 М-1.

Скачать электронную версию публикации