Протолитическое равновесие возбужденных состояний флуоресцеина | Известия вузов. Физика. 2021. № 11. DOI: 10.17223/00213411/64/11/108

Протолитическое равновесие возбужденных состояний флуоресцеина

Протолитическое равновесие возбужденных состояний флуоресцеина зависит не только от равновесия в основном состоянии, но и от эффективности фотовозбуждения, релаксации и переноса протона в возбужденном состоянии. Из-за конкурирующих по скорости излучательных и безызлучательных процессов, протекающих в смеси протолитических форм, до сих пор существует проблема выявления флуоресцентных характеристик индивидуальных форм флуоресцеина. В работе осуществлено моделирование стационарного распределения концентраций основного и возбужденных состояний катиона, ряда таутомеров нейтральной формы, моноаниона и дианиона флуоресцеина при непрерывном фотовозбуждении. Определены значения pH преимущественного существования возбужденных состояний отдельных протолитических форм, подтверждаемые стационарными измерениями флуоресценции. Обсуждены возможные причины существующих в опубликованных данных разночтений по флуоресцентным свойствам отдельных протолитических форм флуоресцеина, и получены уточненные данные по форме спектров и времени жизни хиноида и моноаниона флуоресцеина.

Protolytic equilibrium of excited states of fluorescein.pdf Введение Флуоресцеин и его гомолог флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ) широко используются в биологии и медицине в качестве флуоресцентных маркеров различных белков [1-3]. Без ФИТЦ сегодня невозможно представить флуоресцентную маркировку антител. В то же время флуоресцеин проявляет большое разнообразие ионных форм (дианион, моноанион, различные таутомеры нейтральной формы, катион), равновесие которых чувствительно к изменению pH (рис. 1). Многообразие форм и их спектральных свойств позволяет использовать флуоресцеин как индикатор pH для in situ, в том числе внутриклеточных измерений [4-9]. Рис. 1. Структурные формулы ионных и таутомерных форм флуоресцеина Константы диссоциации в возбужденном состоянии флуоресцеина и его производных могут отличаться от таковых для основного состояния [10-14]. Это свидетельствует о протекании реакции переноса протона в возбужденном синглетном состоянии и фотокислотных (фотоосновных) свойствах красителя. В целом данное явление достаточно часто встречается в ароматических гидроксисоединениях и аминах. Эффект фотоиндуцированного переноса протона находит свое применение в практике зондирования. Флуоресценция различных прототропных форм зондов показывает чувствительную реакцию на изменение локальной среды вокруг микрогетерогенного окружения, касающегося его физических свойств, локальной структуры и динамики. Протонирование флуорофора (например, пиранина) становится чувствительным к размерам межфазной области, которая меняет уровень гидратации границы раздела мицеллы [15]. Зависимость прототропизма возбужденного состояния флуорофора от микроокружения и соответствующие изменения его флуоресцентного излучения используются для мониторинга поведения фазовых переходов (плавления) мембран. Он основан на разнице скоростей фотопереноса протона флуорофора (1-нафтола) по разные стороны мембраны [16]. Смесь протолитических форм флуоресцеина, многообразие их спектральных свойств и квантовых выходов, фотоиндуцированный перенос протона в возбужденном состоянии делают задачу интерпретации экспериментальных данных по флуоресценции неоднозначной. В литературе представлены успешные исследования отдельных ступеней диссоциации, например, дианион-анионной [9, 17] или катион-нейтральной [18, 19], протекающих в узких интервалах pH. В настоящей работе впервые получены равновесные концентрации всех известных ионных и таутомерных форм флуоресцеина как в основном, так и в возбужденном состояниях в широком интервале pH. Эта задача решена путем моделирования стационарного распределения концентраций при непрерывном зондирующем возбуждении. На основе сравнения расчетных и экспериментальных данных удалось получить новые спектральные и кинетические характеристики ряда протолитических форм флуоресцеина. Материалы и методы В работе использовалась натриевая соль флуоресцеина C20H10O5Na2 (Fluka). Концентрация красителя в водном растворе составляла около 2 мкM. Для регулирования pH использовали серную кислоту и щелочь NaOH. Измерения производились через 30-40 мин после приготовления растворов. pH растворов определяли с помощью pH-метра SevenCompact («Mettler Toledo»). Спектры поглощения измеряли на спектрометре Lambda 35 («PerkinElmer»). Стационарные и время-разрешен¬ные флуоресцентные исследования проводили на спектрофлуориметре Fluorolog 3-22 («Horiba Jobin Yvon»), оборудованном приставкой для измерения времени жизни c разрешением 28 пс/канал. Затухание флуоресценции было получено в максимуме спектра испускания при возбуждении диодом NanoLED с максимумом на 453 нм, длительностью импульса 9 - дианион. Рис. 3. Равновесные концентрации протолитических форм флуоресцеина в основном (a) и возбужденном разными длинами волн ( возб) состояниях (б). На рис. 3, б пунктиром обозначены значения pH, для которых были измерены спектры испускания, показанные на рис. 4 Рис. 4. Спектры испускания флуоресцеина при разных длинах волн возбуждения. Значения pH соответствуют обозначенным на рис. 3, б Сравнение с экспериментальными данными Форма и интенсивность спектра испускания флуоресцеина зависят от ряда факторов: i) pH, определяющий количество и вклад протолитических форм в основном состоянии; ii) длина волны возбуждения, влияющая на эффективность поглощения света этими формами; iii) фотоиндуцированный перенос протона, формирующий перераспределение концентраций протолитических форм за время жизни возбужденных состояний; iv) форма спектра и квантовый выход возбужденных состояний ионных форм, сформированных перечисленными процессами. Измеряемый спектр испускания, как правило, имеет в своем составе несколько контуров. В этой связи измерение контура испускания отдельно взятой формы, за исключением дианионной (при pH > 9), требует обоснования длины волны возбуждения и диапазона pH, которые обеспечивают ее концентрационное преимущество перед другими формами. Проверить диапазоны существования возбужденных состояний одной формы можно экспериментально. Независимость формы спектра испускания от длины волны возбуждения говорит о том, что в результате совокупности всех процессов сформировался излучатель одного типа. На рис. 4 приведены нормированные спектры испускания для выбранных на основании рис. 3, б значений pH. Контур испускания, полученный при pH 1.3, относится к нейтральной хиноидной форме, при pH 9 - к дианионной, при pH 4.4-4.9 при длинах волн возбуждения от 435 до 490 нм - к моноанионной. Последний диапазон pH обеспечивает незначительную долю дианионной формы, вклад которой в суммарный спектр возрастает по мере приближения к длине волны максимума ее поглощения (490 нм). В противоположность обсуждаемым диапазонам pH, при pH 6.1 спектр испускания существенно зависит от длины возбуждения. Согласно рис. 3, б при этом pH формируются излучатели двух типов - моноанион и дианион, вклад которых перераспределяется при изменении длины волны возбуждения. Экспериментальное измерение времен жизни возбужденных состояний различных форм флуоресцеина также требует обоснованного выбора длины волны возбуждения и pH, при котором преимущественно существует одна форма. На рис. 5 приведены расчетные данные нормированных концентраций возбужденных состояний и экспериментальные данные по времени жизни, полученные при возбуждении на одинаковой длине волны (453 нм). Сопоставление этих данных позволяет определить время жизни хиноида на уровне 3.0 нс, дианиона - 4.1 нс, что совпадает с опубликованными данными [10, 11, 19]. Для моноаниона опубликованные значения лежат в интервале 3.0-3.7 нс [10, 11, 17]. Такой разброс можно объяснить вариабельностью условий эксперимента. При вариации pH и длины волны возбуждения анализируемый образец может представлять собой либо смесь моноаниона с хиноидом (что дает заниженное значение времени жизни моноаниона), либо смесь моноаниона с дианионом (дает завышенное значение времени жизни). Результат, полученный в настоящей работе для моноаниона (3.3 нс), следует считать наиболее точным, поскольку он удовлетворяет условиям преимущественного испускания только одной протолитической формы. Рис. 5. Нормированные расчетные концентрации возбужденных протолитических форм флуоресцеина на длине волны возбуждения 453 нм (линии), экспериментально измеренные значения времен жизни (символы) Среди множества протолитических форм флуоресцеина некоторые имеют схожую структуру хромофорной группы - ксантеновый трицикл (см. рис. 1). Это приводит к подобию спектральных свойств некоторых из них. Так, хиноид и моноанион оказываются неотличимы по форме спектра поглощения [11]. Тем не менее флуоресцентные характеристики этих форм - спектры (рис. 4, верхний ряд) и время жизни (рис. 5) - немного различаются. Заключение Динамика протолитических форм флуоресцеина достаточно сложна и определяется процессами переноса протона в основном, возбужденном состояниях, вероятностью поглощения и испускания различных протолитических форм, которых в зависимости от pH в растворе может существовать от одной до пяти разновидностей одновременно. В работе осуществлено моделирование распределения концентраций протолитических форм флуоресцеина в основном и возбужденном состояниях при непрерывном фотовозбуждении в широком интервале pH. Модель протестирована на результатах, полученных ранее для основного состояния. Показано существенное отличие картины равновесных распределений концентраций для основного и возбужденного состояний. В дополнение к известному диапазону существования возбужденного состояния дианиона (pH > 9) выявлен узкий интервал pH преимущественного существования других протолитических форм в возбужденном состоянии (хиноид - pH 1.3, моноанион - pH 4.4-4.9 при возбуждении 435-490 нм). Эти результаты позволили спланировать эксперимент и определить контуры испускания и времена жизни хиноида (3.0 нс) и моноаниона (3.3 нс). Модель позволяет избежать некорректную трактовку экспериментальных данных по флуоресценции смеси ионных форм флуоресцеина и может быть использована для изучения природы излучения других флуоресцентных соединений с выраженными прототропными свойствами.

Ключевые слова

флуоресцеин, протолитическое равновесие, флуоресценция, фотоиндуцированный перенос протона, кинетический подход, возбужденное состояние

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Суржикова Дарья ПавловнаСибирский федеральный университетмагистрантка СФУdarya19578@yandex.ru
Герасимова Марина АнатольевнаСибирский федеральный университетст. преподаватель кафедры общей физики СФУmarina_2506@mail.ru
Слюсарева Евгения АлексеевнаСибирский федеральный университетд.ф.-м.н., профессор базовой кафедры фотоники и лазерных технологий СФУeslyusareva@sfu-kras.ru
Всего: 3

Ссылки

Hauke S., von Appen A., Quidwai T., et al. // Chem. Sci. - 2017. - V. 8. - P. 559-566.
Yuan Y., Wang X., Mei B., et al. // Sci. Rep. - 2013. - V. 3. - P. 3523.
Abou-Zied O.K., Sulaiman S.A.J. // Dyes Pigm. - 2014. - V. 110. - P. 89-96.
Nakamura A., Tsukiji S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2017. - V. 27. - P. 3127-3130.
Li G., Zhang B., Song X., et al. // Sens. Actuators B. - 2017. - V. 253. - P. 58-68.
Ma J., Ding C., Zhou J., and Tian Y. // Biosens. Bioelectron. - 2015. - V. 70. - P. 202-208.
Слюсарева Е.А., Герасимова М.А., Сизых А.Г., Горностаев Л.М. // Изв. вузов. Физика. - 2011. - Т. 54. - № 4. - С. 81-87.
Lanz E., Gregor M., Slavik J., Kotyk A. // J. Fluoresc. - 1997. - V. 7. - P. 317-319.
Yguerabide J., Talavera E., Alvarez J.M., Quintero B. // Photochem. Photobiol. - 1994. - V. 60. - P. 435-441.
Sjöback R., Nygren J., Kubista M. // Spectrochim. Acta A. - 1995. - V. 51. - P. L7-L21.
Klonis N., Sawyer W.H. // J. Fluoresc. - 1996. - V. 6. - P. 147-157.
Martin M.M., Lindqvist L. // J. Lumin. - 1975. - V. 10. - P. 381-390.
Shah J., Pant D.D. // Curr. Sci. - 1985. - V. 54. - P. 1040-1043.
Gerasimova M.A., Tomilin F.N., Malyar E.Y., et al. // Dyes Pigm. - 2020. - V. 173. - P. 107851.
Phukon A., Ray S., Sahu K. // Langmuir. - 2016. - V. 32. - P. 10659-10667.
Pappayee N., Mishra A.K. // Spectrochim. Acta A. - 2000. - V. 56. - P. 2249-2253.
Alvarez-Pez J.M., Ballesteros L., Talavera E., Yguerabide J. // J. Phys. Chem. A. - 2001. - V. 105. - P. 6320-3211.
Orte A., Talavera E.M., Macanita A.L., et al. // J. Phys. Chem. A. - 2005. - V. 109. - P. 8705-8718.
Surzhikova D., Gerasimova M., Tretyakova V., et al. // J. Photochem. Photobiol. A. - 2021. - V. 413. - P. 113233.
Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2021616577 / Д.П. Суржикова, Е.А. Слюсарева, А.С. Ципотан и др. - Заявка № 2021615532. Дата поступления 13 апреля 2021 г. Зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 23 апреля 2021 г.
 Протолитическое равновесие возбужденных состояний флуоресцеина | Известия вузов. Физика. 2021. № 11. DOI: 10.17223/00213411/64/11/108

Протолитическое равновесие возбужденных состояний флуоресцеина | Известия вузов. Физика. 2021. № 11. DOI: 10.17223/00213411/64/11/108