Biodegradable wound coverings on the basis of polysaccharides polymers.pdf ВВЕДЕНИЕ Проблема восстановления обширных раневых дефектов в результате ожога была и остается одной из самых актуальных в современной медицине. В настоящее время число обожженных пациентов за год составляет в РФ в среднем 120 тыс. человек (данные Федеральной службы государственной статистики за 2008 год). В результате существенно возросла потребность в коже или ее искусственных эквивалентах, что стимулировало многочисленные исследования в был достигнут в создании способов и средств, ускоряющих сроки заживления ран благодаря управляемым процессам самосборки основного компонента соединительной ткани - коллагена [13, 18, 21, 25]. В настоящее время стало очевидным, что наилучшие результаты в оптимизации процессов реорганизации тканевых дефектов позволяет получить использование природных полимеров, способных осуществлять контроль синтеза и ориентации волокнистых структур [11, 23]. Комбинация таких полимеров с мукополисахаридами и факторами роста дает возможность этом направлении [4, 6-10, 14, 16, 17, 19, 20, 24, контролировать образование грануляций, эпи26]. Определенный прогресс в данной области телизацию кожных дефектов, получать рубцовую Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 2 (37) июнь2011 54 Большаков И.Н., Сапожников А.Н., Еремеев А.В., Кириченко А.К., Власов А.А.и др. а б Рис. 1. а - Постановление Правительства РФ № 3411п-П16 от 05.07.2010 г. о перечне первоочередных инвестиционных проектов в СФО; б - Первоочередной инвестиционный проект в СФО «Развитие коллаген-хитозановых нанокомплексов », г. Железногорск ткань, мало отличающуюся от окружающей здоровой кожи. Переход от биологически инертных полимеров (полигликолиды, полилактиды) к биологически активным системам (полисахаридам), которые позволяют иммобилизировать факторы роста, регуляции пролиферации клеток, открывает широкие возможности регенерации не только кожных покровов, но и других жизненно важных клеточных систем организма человека. Такими полимерами, из которых возможно изготовление деградирующих в организме пациента материалов, являются природные полисахариды - хитин и его дезацетилированное производное - хитозан. Природные полисахариды (хитин, хитозан) резорбируются. Эти природные полисахариды являются перспективными материалами при создании рассасывающихся матриц для культивирования фибробластов и кератиноцитов. Они обеспечивают сохранность внеклеточного матрикса и нужную ориентацию клеток при переносе трансплантата на раневую поверхность. Можно полагать, что матричные материалы на основе этих природных полимеров окажутся более перспективными, чем материалы на основе коллагена или рассасывающихся синтетических полимеров при культивировании и трансплантации клеток кожи человека. Предлагаемые в настоящей работе раневые покрытия входят в инновационный проект (№ 15), который включен в перечень первоочередных инвестиционных проектов в Сибирском Федеральном округе в рамках Программы развития инновационной сферы Сибири, утвержденный Председателем правительства Российской Федерации 5 июля 2010 г. (рис. 1). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ хИТОЗАНОВый пОлИМЕР И ЕГО СТРУКТУРИРОВАНИЕ Изделие медицинского назначения класса «Коллахит» является продуктом наукоемких технологий, в основу которых заложено структурирование полисахаридных комплексов с целью практического применения в сфере комбустиологии, трансплантологии и создания искусственных органов, содержащих в своих основах биодеградируемые полимерные микрочастицы с прикрепленными к ним целевыми молекулами. Отдельные фрагменты структурированного хитозана представляют собой систему переноса ингредиентов для обмена информацией с материнской тканью, служат непосредственным строительным материалом для быстрого восстановления утраченных тканей. Такая система переноса гарантирует сохранность биологической активности прикрепленных целевых молекул в агрессивных биологических жидкостях организма, является высокоаффинной по отношению к соматическим клеткам при доставке к ним информации для их размножения и дифференцировки, является высокоаффинной по отношению к патогенным № 2 (37) июнь2011 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 55 бактериальным клеткам с целью прекращения их жизнедеятельности. Возможность культивирования на таких подложках эмбриональных клеток, включая стволовые с высокими пролиферативными и дифференцировочными потенциями, обеспечивает имплантацию эмбриональной клеточной массы на указанные подложки в присутствии полного молекулярного микроокружения, находящегося в микросоставляющей раневого покрытия, инициирующего строго направленную организацию искусственного дермально-эпидермального эквивалента кожи, позволяет уже через две недели культивирования получать продукт, пригодный для прямой трансплантации на ожоговую поверхность. Разработка новой номенклатуры клеточных матриц для получения нового класса коммерческих продуктов (например, дермально- эпидермального эквивалента кожи с репрограммированным клеточным геномом под конкретного пациента) является социально значимой научной проблемой. В настоящей работе использована авторская технология структурирования хитозана молекулярной массы 690 kDa со степенью дезацетилирования 98 %. Первичным сырьем служили клешни свежезамороженного камчатского краба, из хитонового покрова которых был получен хитозан высокой степени очистки. Следует отметить, что молекулярная масса и размер частиц хитозана существенно зависит от pH среды. Следует отметить, что эффективность молекул хитозана зависит также от зарядового состояния биополимера. В кислых средах хитозан принимает катионную форму, что способствует электростатическому связыванию с анионными компонентами среды [15]. Эти события разыгрываются на каждом мономерном звене хитозана, размеры которого не превышают 1 нм, что во много раз меньше размеров частиц самого хитозана. В зависимости от плотности упаковки в частицах полимера могут формироваться активные центры, размеры которых значительно меньше самой молекулы. Таким образом, на одной частице имеется несколько функционально значимых сайтов разного масштаба. Масштаб размеров молекул является принципиальным фактором для медицинского применения хитозана. Благодаря очень малым размерам обеспечивается преодоление ферментативного или адсорбционного барьеров, а также пролонгированное действие лекарственных препаратов. Наноразмерные частицы полимера обеспечивют преодоление ферментативного или адсорбционного барьеров, а также пролонгированное действие лекарственных препаратов. Авторы настоящей работы провели последовательный химический синтез гелей на основе высоко дезацетилированного хитозана с присоединением к фрагментам жесткой цепи в положении Спиранозного кольца мономерного звена глюкозамина через аминогруппу (NH2)+ молекул аскорбиновой кислоты. Таким образом, при дополнительном протонировании аминогруппы с образованием (NH3)+ и увеличении положительного заряда молекулы было осуществлено последовательное присоединение молекул гепарина, хондроитинсерной и гиалуроновой кислот, низкомолекулярного сывороточного фактора роста крупного рогатого скота «адгелон» (ИНЭОС им. А. Н. Несмеянова РАН, г. Москва) при строго заданных значениях температуры, концентрации, рН и молекулярной массы (изделие медицинского назначения «Бол-хит»). Такой химический синтез привел к образованию системы переноса компонентов соединительной ткани размерами в поперечнике порядка долей 1 нанометра, усиленно потребляемых при строительстве в проблемной зоне ткани при воспалительно- дегенеративных процессах. Для создания раневых покрытий с привлечением структурированного хитозана предпочтительным является введение ингредиентов полисахаридной структуры. К таковым относится альгинат натрия, по сути дела, выполняющий такую же роль инициатора ионного желирования, как и триполифосфат натрия. Изделие «Бол-хит» в виде лиофилизированной пористой массы содержит аскорбат хитозана с молекулярной массой 700 кДа и степенью дезацетилирования 98 %, солевые формы хондроитинсерной, гиалуроновой кислот и гепарин. Структурирование хитозана с существенным уменьшением размеров молекул обусловлен наличием именно таких анионных полисахаридов как гепарин, хондроитинсульфат, гиалуронат. пОлУЧЕНИЕ КОллАГЕН-хИТОЗАНОВОГО РАНЕВОГО пОКРыТИя Ковалентное соединение полисахаридной гелевой конструкции «Бол-хит» с бычьим коллагеновым гелем в соотношении 1:3, лиофильное высушивание глубоко замороженных образцов, упаковка и стерилизация электронно-лучевым способом позволило получить раневое покрытие «Коллахит-Бол», пригодное не только в Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 2 (37) июнь2011 56 Большаков И.Н., Сапожников А.Н., Еремеев А.В., Кириченко А.К., Власов А.А.и др. Рис. 2. Маркировка готовой продукции Рис. 3. Внешний вид коллаген-хитозановой мат- рицы Рис. 4. Заключение лабораторно-испытательно- го центра НИИ ФХМ МЗ РФ о применении ране- вого покрытия «Коллахит-Бол» по показателю токсичность качестве бесклеточного раневого покрытия для реконструкции ожоговой поверхности, но и для культивирования и дифференцировки in vitro эмбриональных клеток, включая пул стволовых, с формированием дермально-эпидермального эквивалента кожи (рис. 2, 3). Безопасность полиионной конструкции при контакте с биологическими тканями была подтверждена на базе испытательного лабораторного центра НИИ ФХМ МЗ РФ (аттестат № ФС 02-ПТИ-04 от 10.03 2004 г., регистрация в реестре ФС 16.08.2004 г.) проведены санитарнохимические и токсикологические испытания продуктов «Бол-хит» - протокол № 1612.007 от 13.08.2007 г.; «Коллахит-Бол» - протокол № 1488.007 от 19.07.2007 г.) (рис. 4). ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАя ОЖОГОВАя ТРАВМА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЙ ТИПА «КОЛЛАХИТ» ДЛя ЕЕ ЛЕЧЕНИя Исследование заключалось в изучении процессов репарации на модельной ожоговой ране животных с помощью известных методов регистрации динамики заживления. Термический ожог кожи IIIБ степени моделировали с помощью разработанного способа [1] на 94 крысах самцах популяции Wistar массой 180-220 г. После депиляции в паравертебральной области спины под эфирным наркозом создавали контактный термический ожог медной пластинкой с силой в 1,255 н, нагретой до 220 °С. Время экспозиции пластины составило 14 сек, с глубиной ожога IIIБ степени. День нанесения травмы животным считали нулевым. Для вычисления процентного соотношения ожоговой поверхности к общей площади тела у крыс использовалась формула, предложенная Lee (1929), в модификации формулы Мее-Рубнера: S = К.W0,60, где S - поверхность тела в квадратных сантиметра; К - коэффициент, равный 12,54; W - вес животного в граммах. Площадь ожоговой раны составляла 26 см2 (9-10 % от общей поверхности кожи крысы). На 2-й день на всех этапах исследования после механического удаления раневого струпа [3] и стандартного туалета ожоговых ран с использованием растворов антисептиков в условиях асептики извлекались из стерильных бумажных № 2 (37) июнь2011 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 57 пакетов раневые покрытия и моделировали их по контуру раны. Контрольные и опытные покрытия наносили на рану, прижимали ко дну и фиксировали по краю с помощью шовного материала, марлевого бинта и пластыря. Покрытие выступало за края раны на 0,2-0,5 см. Оценку результатов проводили на основе динамического визуального, планиметрического, гистологического, иммуногистохимического анализов состояния ожоговой поверхности. Контрольные точки анализа репарации ожоговой поверхности: 5, 7, 10, 13, 15, 16, 20, 26 и 30 суток с момента травмы. Раневые покрытия обновляли по мере их биодеградации. Для расчета суточного уменьшения заживления площади раны использовали формулу, предложенную Л. Н. Поповой (1942): S=(S-Sn).100/S.t, где S - величина площади раны при предшествующем измерении; Sn - величина площади раны в момент очередного контроля; t - число дней между первым и последующим измерением. Партии раневых покрытий «Коллахит-Г» и «Коллахит-Бол» произведены в ООО «Коллахит » г. Железногорска Красноярского края (ген. директор предприятия А. Н. Сапожников). ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОБШИРНОЙ ОЖОГОВОЙ РАНЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КОЛЛАГЕН-ХИТОЗАНОВЫХ КОНСТРУКЦИЙ Для проведения морфологического анализа предварительно производилась эксцизия ожоговой поверхности с последующей фиксацией препаратов в 10 % нейтральном растворе забуференного формалина. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по ВанГизону. В микропрепаратах оценивали линейные размеры толщины эпидермиса и его слоев, толщины струпа и слоя грануляционной ткани. С помощью сетки со 130 равноудаленными точками в дне раны, исключая струп, в процентах определяли удельную площадь, занимаемую полиморфно- ядерными лейкоцитами (ПЯЛ), лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, фиброцитами, фибробластами, волокнистыми структурами, сосудами. Иммуногистохимические реакции проводились по стандартному стрептавидин - биотин - пероксидазному методу с использованием моноклональных и поликлональных антител («Novocastra», Великобритания) [22] к трансформирующему фактору роста .-1 (TGF-.-1) для оценки фиброгенных факторов, к кластеру дифференцировки макрофагов (CD68+) для характеристики моноцитарно- макрофагальной популяции клеток воспалительного инфильтрата, к фактору пролиферативной активности клеток (Ki-67) для оценки пролиферативной способности клеточных элементов ожоговой раны, к металлопротеазам (MMP-2, MMP-9) для оценки ремоделирования внеклеточного матрикса, к коллагену IV типа. Морфометрия со статистической обработкой полученных данных проводилась при помощи светового микроскопа «Leica DMLB» и анализатора изображения «Q550IW», снабженного программой «Leica Qwin» для статистической обработки. Полученные данные подвергались анализу методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента с пороговым значением p < 0,05. ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ АЛЛОФИБРОБЛАСТЫ В СОСТАВЕ БИОПОЛИМЕРНОЙ ГУБКИ Исследование осуществлялось в несколько этапов: получение фетальных фибробластов, их культивирование, трансплантация фибробластов на раневое покрытие «Коллахит-Бол», оценка цитотоксического действия покрытия на клетки, аппликация полученного дермального эквивалента кожи и покрытия «Коллахит-Бол» на раневую поверхность в опытных группах животных, покрытий «Коллахит-Бол» с кондиционированной средой, «Коллахит-Г» и марлевых салфеток (без лечения) на раневую поверхность в контрольных группах, наблюдение и анализ изучаемых параметров в соответствии с основными направлениями исследования. Для получения эмбриональных фибробластов использовали фетусы крыс популяции Wistar (7-10 день беременности). Выделенные фетусы помещали в фосфатно-солевой буфер Дульбекко, содержащий антибиотики пенициллин+стрептомицин (100 мкг/мл), трижды отмывали. Затем переносили в среду ДМЕМ, где проводили отсечение кожных лоскутов. Далее материал переносили в раствор, содержащий трипсин и ЭДТА на фосфатно-солевом растворе, измельчали и культивировали 30 минут в термостате при +37 °С. Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 2 (37) июнь2011 58 Большаков И.Н., Сапожников А.Н., Еремеев А.В., Кириченко А.К., Власов А.А.и др. После инкубации пробы центрифугировали РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 5 минут при 1000 об/мин. Осадок переносили в полную среду ДМЕМ, содержащую 10 % ЭТС (эмбриональной телячьей сыворотки), L-глутамин (1 мМ), стрептомицин+пенициллин (100 мкг/мл), и пересаживали в культуральные матрасы (HyClone). Для опытов использовалась культура 2-3-го пассажа. В экспериментах по исследованию влияния кондиционированной клетками среды проводился сбор среды на различных сроках и ее замораживание у культур, не достигших конфлуентности. Клетки снимались раствором Версена, по 4 мл взвеси рассевались на коллаген-хитозановые матрицы (1 мл суспензии содержал 6.104 клеток), предварительно забуференные бикарбонатом, а затем использовались для трансплантации экспериментальным крысам. Для оценки степени цитотоксического потенциала исследуемых раневых покрытий осуществляли регистрацию программированной клеточной гибели фибробластов после культивирования на матрице. Для этого часть крысиных фибробластов снимали с флаконов 0,25 % трипсином на фосфатном буфере Дульбекко и через 24, 48 и 72 часа, а также более длительный срок в клетках определялись признаки апоптоза с помощью Hoechst 33342 и Propidium iodide на микроскопе Olympus BX51 [5], микроскопической визуализации блеббинга и системы Annexin V-FITC на микроскопе «ЛЮМАМ» с использованием фазово-контрастной насадки с увеличением .450. Выявление апоптотических клеток осуществляется благодаря связыванию между аnnexin V и фосфатидилсерином [12]. Статистический анализ и обработка результатов выполнена на персональном компьютере с помощью комплекса прикладных и программных средств, используя критерий U Вилкоксона-Манна- Уитни и t-критерий Стьюдента [2]. Использование в эксперименте на крысах коллаген- хитозанового раневого покрытия «Коллахит- Бол» с трансплантированными аллогенными эмбриональными фибробластами существенно ускорило заживление ожоговой раны III-Б степени. Так, уже на 7-е сутки наблюдения площадь раны составляет 20,3±0,36 см2. На 7-е сутки в контроле, где применялось пропитанное кондиционированной средой ДМЕМ биоматрица «Коллахит-Бол», площадь ожоговой раны составляла 22,9±0,39 см2 (p

Скачать электронную версию публикации