CHEMICALLY PURE SILICON AND TITANIUM COATING IS NOT TOXIC FOR MESENCHYMAL STROMAL CELLS AND IMPROVES CYTOLOGICAL COMPATI.pdf ВВЕДЕНИЕ большое значение для качества жизни больных, нуждающихся в применении различных импланПроцессы интеграции живых тканей и искус-татов в травматологии и ортопедии, восстаноственных материалов в различных условиях имеют вительной медицине и стоматологии. Тканевой Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3 (62) сентябрь’2017 46 Шевела А.А., Тодер М.С., Матвеева В.А. и др. ответ на внедрение инородного тела обычно сопровождается воспалением. При разработке, оценке и испытании внедряемых в живой организм материалов важной задачей является выбор таких, которые вызывают минимальную реакцию окружающих тканей, обеспечивая длительное функционирование имплантата. В последние годы некоторые нелизируемые материалы используют в качестве матрицы для абсорбции мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК), которые должны ускоритьприживление этих инородных тел и уменьшить побочные реакции организма [1, 2]. В связи с этим очень важную роль играет исследование способности индуцировать клеточные и иммунные реакции, а также цитотоксичности имплантатов, особенно их поверхности. Без учета указанных факторов невозможно разрабатывать эффективные методы профилактики и лечения развивающихся осложнений использования любых материалов, даже биологического происхождения, для имплантации. Достаточно много имплантатов изготавливают из металлов, выбор которых обусловлен их прочностью, жесткостью, коррозийной и износостойкостью. Традиционные металлические материалы не обладают эластичностью, характерной для тканей живого организма. Требования биомеханической совместимости и фиксации имплантата в тканях организма могут быть удовлетворительно решены, если использовать материалы с поверхностью, к которой способна прочно прикрепляться живая ткань. При этом создаются два способа связей между имплантатом и живой тканью: механическое сцепление в результате образования (прорастания) ткани в порах имплантата и химическое соединение за счет взаимодействия ткани с компонентами элементного состава имплантата. Вид материала и характер поверхности влияют на реакции, протекающие на границе раздела живая ткань - имплантат [3-5]. Сплавы никелида титана (TiNi) известны своими уникальными свойствами - памятью формы и суперэластичностью [3, 6], что позволяет использовать их в медицине. Однако существует потенциальный риск токсического, аллергического и канцерогенного влияния никеля на клетки и ткани при вымывании из сплава [7]. Эффективным методом улучшения биосовместимости изделий из никеля и титана, ограничивающим вымывание никеля из сплава и повышающим интеграцию имплантата с окружающей тканью, является метод ионно-лучевой модификации поверхности [8]. Для скрининга имплантируемых материалов широко используют трансформированные линии клеток и ММСК. Выбор ММСК обусловлен тем, что они являются клеточными элементами нормальных тканей, дифференцируются в клетки различных органов in vivo; жизнеспособность, морфология, адгезия, пролиферация, направленность дифференцировки этих клеток могут быть достаточно легко изучены in vitro при оценке влияния физико-химических и морфологических свойств поверхности металлического имплантата [9, 10]. Цель исследования: изучить цитотоксическое действие на культуру ММСК образцов электрополированного сплава никелида титана после модификации поверхности химически чистыми однокомпонентными пучками ионов тантала (Ta) или кремния (Si). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Поверхности образцов сплава TiNi последовательно подвергали химическому травлению, механической шлифовке и электрополировке с последующей обработкой химически чистыми однокомпонентными пучками ионов (ионнопучковая модификация) Ta или Si. ОбразцыTiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi промывали водой и стерилизовали 20 мин при температуре 180 °С. ММСК костномозгового происхождения получали от крыс линии Wag и культивировали всоответствии с нашими предыдущими работами [1, 2]. Клеточные мембраны и ядра живыхММСК 2-го пассажа были окрашены флуоресцентными красителями Vybrant CM-Dil и Hoechst 33342 (Life Thechnology, США), соответственно, согласно инструкции производителя. Для определения пролиферативной активности на стерильные образцы TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi, помещенные в лунки 12-луночного планшета, наносили суспензию ММСК в плотности 5 • 103 клеток/см2. Через 14 сут культивирования жизнеспособность клеток в лунках планшета исследовали методом митохондриального тетразолиевого теста (МТТ), используя растворимую форму формазана WST1 (Roche, США), согласно инструкции производителя. Для оценки результатов МТТ сравнивали значения оптических плотностей растворов контрольных и опытных лунок при длинах волн . = 450 нм и референсной . = 655 нм на планшетном спектрофотометре BioRad 680 (BioRad, США). В данном случае оптическую плотность культуры определяет эффект светорассеивания, которое, в свою очередь, прямо пропорционально концентрации клеток в среде. Далее образцы TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi отмывали, переносили в лунки новых планшетов и культивировали еще 3 сут для оценки эффективности формирования колоний. После этого TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi с адсорбированными ММСК изучали на микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия). № 3 (62) сентябрь’2017 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Новые технологии 47 ММСК в лунках продолжали культивировать и через 11 сут определяли их жизнеспособность в МТТ. Клетки, культивируемые на поверхности лунок, окрашивали раствором Гимзы (Panreac) согласно инструкции производителя, используя световой микроскоп «Stemi 2000C» (Carl Zeiss, Германия), подсчитывали число и площадь колоний, для морфометрии применяли программное обеспечение морфологического модуля «Axiovision» (Carl Zeiss, Германия). Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 (Microsoft, США), определяли среднее арифметическое значение M и стандартное отклонение . для n = 3 в трех независимых экспериментах. Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента. Статистически значимым считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше (p < 0,05). При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Обнаружено, что через 17 сут культивирования ММСК заселяли поверхность всех образцов TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi, независимо от варианта обработки поверхности (рис. 1). Это соответствует данным литературы о том, что живые клетки прикрепляются к любому твердому субстрату [11, 12]. Таким образом, физикохимические свойства TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi не оказывают острого токсического действия на ММСК, культивируемые на поверхностях рассматриваемых металлов. Культивируемые в присутствии указанных образцов ММСК сохраняли митотическую активность. Эффективность пролиферации клеток на поверхности лунок не зависела от варианта обработки поверхности сплава. Неприкрепившиеся ММСК формировали монослой, а клетки, мигрировавшие с поверхности образцов TiNi_Ta, TiNi_Si и TiNi сохраняли клональную активность in vitro, формируя колонии и заселяя поверхность пластика лунок культивирования (рис. 2). а б в Рис. 1. ММСК крысы 2-го пассажа, культивируемые на образцах TiNi, поверхность которых модифицирована однолучевыми пучками ионов Si или Ta. Прижизненное окрашивание мембран и ядер клеток флуоресцентными красителями Vybrant-CM-Dil и Hoechst 33342, соответственно: а - живые ММСК; б - ММСК и поверхность образца на разных каналах флуоресценции; в - 3-D реконструкция расположения клеток на поверхности образца. Лазерная конфокальная микроскопия Рис. 2. Колонии ММСК, сформированные на поверхности пластика лунок культивирования клеточными элементами, мигрировавшими с образцов TiNi с различной модификацией поверхности Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3 (62) сентябрь’2017 48 Шевела А.А., Тодер М.С., Матвеева В.А. и др. Не было найдено статистически значимых верхностно модифицированных ионами Si или различий показателей митохондриального дыхания (по результатам МТТ) ММСК, заселившихповерхности лунок, после нанесения клеток на поверхность образцов TiNi_Si, TiNi_Ta и TiNi и культивирования в течение 14 сут (табл. 1). Установлено, что количество жизнеспособных клеток, число колоний и площадь, занимаемая колониями ММСК, мигрировавших с образцов TiNi_Ta или TiNi_Si, были статистически значимо больше, чем значения этих показателей для клеточных элементов, мигрировавших с чистого TiNi (табл. 2, 3). Согласно данным МТТ, относительное содержание жизнеспособных клеток, мигрировавших с поверхности образцов TiNi-Ta и TiNi_Si, статистически значимо не различалось, но было более чем в 2 раза выше по сравнению с числом жизнеспособных клеток, мигрировавших с поверхности немодифицированного TiNi (см. табл. 2). Среднее число колоний, образованных ММСК, мигрировавшими с образцов TiNi, по- Ta, также статистически значимо не различалось. В то же время среднее количество колоний, образованных клетками, мигрировшими с чистого TiNi, было более чем в 2 раза меньше, чем колоний, сформированных ММСК с TiNi_Si и TiNi_Ta (см. табл. 3). Колонии, образованные клетками, мигрировавшими с образцов TiNi_Ta или TiNi_Si, занимали 50-60% площади поверхности лунки, тогда как общая площадь колоний ММСК, мигрировавших с немодифицированного TiNi, составляла менее 30% поверхности и была примерно в 2 раза меньше занимаемой клетками с TiNi_Ta или TiNi_Si (см. табл. 3). Отмеченные реакции ММСК, возможно, связаны как с уменьшением общего числа жизнеспособных клеточных элементов, так и (или) с уменьшением количества быстро пролиферирующих клеток вследствие гибели из-за токсичности и (или) особенностей характера поверхности чистого TiNi, по-видимому, влияющей на прикрепление и (или) дифференцировку ММСК. Таблица 1 Показатели митохондриального дыхания ММСК (по результатам МТТ) (M ± .) после культивирования на образцах TiNi с различной модификацией поверхности Параметр Образец TiNi TiNi_Ta TiNi_Si Оптическая плотность 0,882 ± 0,231 0,926 ± 0,187 0,956 ± 0,162 Относительная оптическая плотность, %# 100 ± 7,06 105,00 ± 5,30 108,00 ± 4,62 # Здесь и в табл. 2 за 100% принята оптическая плотность в лунках с ММСК, не прикрепившимися к поверхности TiNi. Таблица 2 Численность жизнеспособных ММСК (по результатам МТТ) (M ± .), мигрировавших с образцов TiNi с различной модификацией поверхности Параметр Образец TiNi TiNi_Ta TiNi_Si Оптическая плотность 0,342 ± 0,127 0,786 ± 0,153* 0,910 ± 0,134* Относительная оптическая плотность, % 100 ± 6,04 230,00 ± 0 6,92* 266,00 ± 7,30*, # * Величины, статистически значимо отличающиеся от таковых при культивировании ММСК на TiNi (р . 0,05). # Величины, статистически значимо отличающиеся от таковых при культивировании ММСК на TiNi_Ta (р . 0,05). Таблица 3 Количество и относительная площадь колоний (M ± .), образованных ММСК, мигрировавшими с образцов TiNi с различной модификацией поверхности Параметр Образец TiNi TiNi_Ta TiNi_Si Число колоний 79 ± 10 163 ± 23* 154 ± 15* Относительное число колоний, %# 100,0 ± 12,7 206,0 ± 14,1* 195,0 ± 9,7* Относительная площадь, занимаемая колониями, %## 26,20 ± 7,54 50,90 ± 13,50 56,30 ± 9,55* # За 100% принято число колоний в лунке с ММСК, мигрировавшими с поверхности образцов не модифицированного TiNi. ## За 100 % принята вся площадь лунки. * Величины, статистически значимо отличающиеся от таковых при культивировании ММСК на TiNi (р . 0,05). № 3 (62) сентябрь’2017 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Новые технологии 49 ЗАКЛЮЧЕНИЕ заключить, что поверхность электрополирован ного TiNi, модифицированная химически чис Таким образом, присутствие ионов Si или Ta тыми однокомпонентными пучками ионов Ta на поверхности TiNi не токсично для ММСК и или Si, не токсична для ММСК. усиливает цитосовместимость этого материала. По результатам лазерной сканирующей мик-Исследование финансируется за счет средств роскопии, световой микроскопии и МТТ можно РНФ (проект N15-13-0023 от 18.05.2015).

Скачать электронную версию публикации