INHIBITION OF SIGNALING CASCADE OF GROUP P38 MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE AS A NEW PROMISE FOR IMPROVEMENT OF QUALIT.pdf ВВЕДЕНИЕ Проблема образования рубцов имеет особое значение в практике пластического хирурга, где результат операции во многом определяется качеством послеоперационных рубцов. Пока остается мечтой заживление раны без образования рубца, или чтобы такой рубец 14 Зеленин Н.В., Мантурова Н.Е., Шурыгин М.Г. и др. № 4 (67) декабрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии формировался бы с заданными свойствами. Очевидно, что совершенствование хирургической техники не приведет исчезновению проблемы заметных рубцов, и для качественного скачка нужны новые фундаментальные знания о механизмах воспаления и формирования соединительной ткани [1]. Процесс заживления раны требует слаженного взаимодействия между клетками воспаления, биохимическими посредниками и внеклеточным матриксом. Эти реакции регулируются митогенами и хемоаттрактантами, а различные факторы роста обеспечивают клеточные и молекулярные сигналы, необходимые для нормального заживления раны [2-5]. МАР-киназы (mitogen activated protein kinases) - большая группа протеинкиназ, сформированных в процессе эволюции в мощные сигнальные пути, которые в ответ на внеклеточные стимулы (митогены) участвуют в регуляции клеточной активности [6-8]. После воздействия на рецепторы мембраны клетки начинают развиваться MAPK-каскады реакций фосфорилирования протеинкиназ, в результате чего обеспечивается передача полученного сигнала в ядро клетки. Это, в свою очередь, приводит к активации или подавлению активности определенных генов. В результате запускаются воспалительный ответ, апоптоз, деление клеток. Цель исследования: изучить возможности управления процессом образования послеоперационного рубца путем снижения активности митогенактивируемой протеинкиназы группы р38. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Эксперимент проведен на 63 крысах-самцах линии Wistar, у которых изучали местное действие блокатора р38 МАР-киназы на заживление кожно-мышечной раны, нанесенной в асептических условиях, и последующее образование рубца. Масса тела животных составляла 220-250 г, возраст - 9 мес. Крысы содержались в стандартных условиях вивария без ограничения доступа к воде и пище. Содержание и экспериментальные действия с животными осуществляли по правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986). Животные были разделены на две группы по 30 особей: контрольную (нанесение раны, внесение в рану лекарственной пленки без активного вещества [9]) и основную (изучение воздействия блокатора р38 МАР-киназы SB 203580 (Tocris Bioscience, кат. № 1202 Bath № 4 A/95665) на заживление раны (нанесение раны, введение в рану блокатора р38 МАР-киназы в составе лекарственной пленки [9], наблюдение за заживлением раны), доза на одно животное - 1,05 мкг (4,2 мкг/кг)). Расчет дозы препарата (1) на одно животное проводили на основании IC50 [10]. Как известно, для блокатора р38 МАР-киназы SB 203580 IC50 составляет 50 и 500 нM для p38 и p38.2 соответственно [11]. (1) В качестве контроля для оценки механических свойств неизмененной кожи служили исследования, выполненные на трех интактных животных. Моделировалась линейная кожно-мышечная рана в стерильных условиях операционной вивария. Останавливали кровотечение и помещали в рану лекарственную пленку с медленной резорбцией, содержащую для крыс основной группы блокатор р38 МАРК SB203580, для контрольной группы животных - пленку без активного ингредиента [9]. Кожу и подкожную клетчатку зашивали однорядным узловым швом нитью пролен 4/0 (Ethicon) на атравматичной круглой игле. Снятие швов осуществляли через 7 сут. В сроки 2 ч, 6 ч, 12 ч, 1, 3 (по 3 животных в группе), 7, 14 и 30 сут (по 5 животных в группе) крыс выводили из эксперимента передозировкой раствора тиопентала натрия, введенного внутрибрюшинно. Для исследования забирали ткани из области раны, фиксировали раствором FineFix (Milestone, Италия) для последующего гистологического исследования. На нефиксированных фрагментах послеоперационного рубца на 7-е, 14-е и 30-е сут методом тензиометрии проводили определение механических характеристик рубца. Сразу после выведения животного из эксперимента скальпелем вырезали участок ткани в области ранее нанесенной кожно-мышечной раны шириной 1 см, который включал в себя по 1 см ткани с каждой стороны от формирующегося рубца. Ткань фиксировали зажимами в тензиометре, и к образцу ткани прикладывали усилие в направлении, перпендикулярном плоскости раны. Нагрузку увеличивали дискретно, начиная с 50 грамм-сил (гс) с шагом 50 гс (от 0,4903 Н, шаг 0,4903 Н) и доводили до достижения разрыва образца. Пластическая хирургия 15 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 4 (67) декабрь’ 2018 В области пластической деформации скорость нарастания нагрузки до достижения разрыва составляла 5 гс/с. Измеряли удлинение в ответ на прилагаемую нагрузку. Вычисляли относительное удлинение как отношение длины при приложении силы к начальной длине образца. Определяли предел прочности образца, точку перехода упругой деформации в пластическую деформацию. После определения значения усилия, вызывающего разрыв образца, вычисляли значение разрушающей нагрузки как отношение приложенной разрушающей силы к площади поперечного сечения образца по формуле: Разрушающая нагрузка = F/S, где F - сила, Н; S - площадь поперечного сечения, перпендикулярного направлению действия силы. В зоне упругой деформации рассчитывали модуль упругости Юнга - коэффициент, характеризующий сопротивление материала растяжению/сжатию при упругой деформации: E = F/S · L/.L, где E - модуль упругости, Па; F - сила, Н; S - площадь сечения; L - длина деформируемого образца; .L - модуль изменения длины образца в результате упругой деформации. Сравнение показателей проводилось между группами, а также по отношению к поведению на нагрузку интактной кожи в сроки 7, 14, 30 сут после операции. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизона (на выявление коллагеновых волокон) [12, 13]. Исследование проводили методом световой микроскопии с использованием микроскопа «Nikon 80i» (Япония). Морфометрические исследования выполняли с использованием программы ImageJ (Национальный институт здоровья, США). Для оценки формирования грубоволокнистой соединительной ткани на микрофотографиях при использовании окраски по методу Ван- Гизона определяли соотношение площади, занимаемой окрашенными волокнами коллагена, к общей площади ткани на срезе [14]. Электронно-микроскопические исследования выполняли на образцах ткани из области послеоперационного рубца, взятых на 3-е и 7-е сут, фиксировали в 2,5%-м глутаровом альдегиде на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение 2 ч. Тщательно отмывали 0,1 М какодилатным буфером (рН 7,4), проводили дофиксацию образцов в 1%-м растворе черырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, пропиленоксиде, пропитывали и заливали в Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, США) [3]. На ультратоме «LKB» (LKB, BROMMA, Швеция) изготавливали ультратонкие срезы, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Образцы исследовали на электронном микроскопе «TEM-410» (Нидерланды). Нормальность распределения количественных показателей определяли по W-критерию Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk's test). Для оценки значимости различий в попарно сравниваемых группах использовали критерий Манна-Уитни; при оценке механических свойств применяли метод множественных сравнений Шеффе. При проведении всех видов статистического анализа критический уровень значимости критериев принимали равным 0,05. При нормальном распределении данные представлены в виде M ± SE, где М - среднее значение; SE - ошибка среднего. При несоответствии распределения критериям нормальности данные записаны в виде Me [Q25- Q75], где Ме - медиана, [Q25-Q75]- 25% квартиль и 75% квартиль соответственно. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ У крыс контрольной группы (введение лекарственной пленки без активного действующего вещества) процесс формирования послеоперационного рубца соответствовал канонам заживления асептической раны. Так, через 2 ч после моделирования раны отмечался отек подкожной клетчатки, дермы, начиналась нейтрофильная инфильтрация в зоне раны. Через 6, 12 ч и 1 сут после повреждения отек и нейтрофильная инфильтрация сохранялись, при этом максимальная выраженность нейтрофильной инфильтрации приходилась на срок 12 ч. С 3-х сут у животных контрольной группы начиналась фибробластическая фаза воспаления: отмечалось формирование молодой грануляционной ткани, плотность фибробластов нарастала к 7-м сут после моделирования. В дальнейшем при морфологическом исследовании регистрировалось созревание соединительной ткани, и к концу наблюдения (30-е сут) на месте раны формировался хорошо выраженный рубец, при этом плотность фибробластов в области раны снижалась. У животных, которым вводили блокатор р38, через 2 ч после нанесения травмы наблюдался умеренный отек подкожной клетчатки в области раны, но нейтрофильной инфильтрации не отмечалось. Через 6 ч имели место умеренная нейтрофильная инфильтрация и отек области раны. К концу 1-х сут эксперимента выраженность нейтрофильной инфильтрации достигала максимума, однако была значительно менее выраженной, как по площади зоны инфильтрации, так и по плотности клеточных элементов по сравнению 16 Зеленин Н.В., Мантурова Н.Е., Шурыгин М.Г. и др. № 4 (67) декабрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии с показателями в контрольной группе. К 3-м сут наступала фибробластическая фаза воспаления с началом формирования молодой грануляционной ткани. Однако и на 7-е сут развитие соединительной ткани в области раны отставало от такового у животных контрольной группы, зона формирования соединительной ткани была очень узкой, с низкой плотностью клеточных элементов. К 14-м сут формировался узкий аккуратный рубец в области раны, наблюдалась полная ее эпителизация. К 30-м сут на месте раны наблюдался зрелый узкий соединительнотканный рубец, малозаметный на коже (рис. 1). а б Рис. 1. Ширина рубца (показана стрелками) в области кожной раны на 30-е сут у животных контрольной группы (а) и животных, получавших блокатор р38 (б) У крыс основной группы на 30-е сут ширина сформированного рубца составляла 157,8 [120,11- 206,45] мкм, в то время как у животных контрольной группы - 763,47 [334,1-1285,31] мкм. Различия статистически значимы - по критерию Манна-Уитни, Z = 6,073, p = 0,00001 (рис. 2). мкм Контроль р38 Рис. 2. Ширина рубца в области кожной раны на 30-е сут у животных основной и контрольной групп У крыс контрольной группы относительная площадь, занятая волокнами коллагена в зоне послеоперационной раны, закономерно увеличивалась от 3-х до 30-х сут, достигнув максимальных значений к 30-м сут - 73,54 [66,87- 78,01] %. При этом в интактной дерме изменений не наблюдалось, а в дерме рядом с травматическим повреждением плотность коллагена статистически значимо повышалась на 14-е сут (p = 0,029). Применение блокатора р38 SB 203580 приводило к значительному снижению интенсивности коллагенообразования в зоне формирующегося рубца. В течение всего срока наблюдения отмечалось статистически значимое снижение коллагенообразования в сравнении с группой контроля (таблица). Количество коллагена в зоне формирующегося рубца при подавлении активности р38 МАР-киназы Группа Срок Контрольная Основная Me 25% кв. 75% кв. Me 25% кв. 75% кв. Z p 3-и сут 11,57 8,53 27,85 4,53 0,89 9,81 2,49 0,011000 7-е сут 25,21 15,61 36,92 1,78 1,09 2,80 5,20 0,000001 14-е сут 55,41 41,10 74,38 31,54 23,15 40,24 4,49 0,000007 30-е сут 73,54 66,87 78,01 43,60 41,05 60,15 3,14 0,001700 Пластическая хирургия 17 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 4 (67) декабрь’ 2018 Исследование механических свойств рубца показало, что при низких нагрузках поведение образцов соответствовало закону Гука. При больших нагрузках наблюдался переход упругой деформации в пластическую. Точка перехода упругой деформации в пластическую в срок 7 сут после моделирования раны у экспериментальных животных значительно снижалась по сравнению с таковой на интактной коже. В дальнейшем наблюдалось постепенное повышение этого показателя. На 30-е сут в группе животных, которым в рану вводили блокатор р38, данный показатель был статистически значимо выше, чем в контрольной группе - (8417 ± 503) и (5623 ± 164) кПа соответственно (р = 0,0016). Разрушающая нагрузка, измеренная как отношение силы, приведшей к разрушению образца, к площади его поперечного сечения, для интактной кожи превышала 12 МПа. Эта величина была значительно ниже у животных экспериментальных групп в ранние сроки раневого процесса и постепенно повышалась по мере созревания формирующегося рубца. После введения в рану блокатора р38 значения данного показателя были выше во все сроки наблюдения по сравнению с контролем, различия становились статистически значимыми к 30-м сут - (9130 ± 341) против (7872 ± 237) кПа (р < 0,05) (рис. 3) Предел прочности кожи, кПа Контрольная Основная Группа Рис. 3. Предел прочности образцов на 30-е сут Изучение ультраструктуры клеток фибробластического ряда при подавлении активности p38 МАРК показало, что у крыс при применении блокатора р38 резко снижается количество фибробластов в зоне формирующегося послеоперационного рубца. При этом фибробласты не имеют морфологических признаков активации: ядрышки не выражены, слабо развита эндоплазматическая сеть. Данная картина наблюдалась весь период фибробластической фазы воспаления, начиная с 3-х сут. Отражением низкой плотности клеток в очаге образования соединительной ткани и их невысокой функциональной активности является низкая плотность формирующегося коллагена. При этом коллагеновые волокна рыхлые, неплотно упакованы, в отличие от контрольной группы не образуют больших полей. На 3-и и 7- сут после моделирования раневого процесса при искусственном подавлении активности р38 МАРК каскада нами отмечена деструкция митохондрий, их отек, набухание крист. У животных контрольной группы митохондрии были сохранны. Таким образом, изучение ультраструктуры фибробластов показало значительное влияние ингибитора р38 МАРК на функциональную активность клеток фибробластического ряда, что выражалось в снижении активности фибробластов. Таким образом, локальная блокада р38 МАРкиназного каскада в ранние сроки раневого процесса в значительной степени модифицирует воспалительный процесс, влияя на различные его фазы. При этом снижается выраженность нейтрофильной инфильтрации, подавляется интенсивность фибробластической фазы воспаления, что в итоге приводит к формированию достоверно более узкого послеоперационного рубца по сравнению с таковым у животных контрольной группы. Кроме того, результаты наших исследований показывают, что блокада р38 MAPК приводит к значительному изменению механических характеристик формирующегося рубца при кожно-мышечной ране. Локальное введение блокатора р38 позволяет к 30-м сут раневого процесса добиться формирования рубца, при котором механические свойства кожи в области раны (разрушающая нагрузка и точка перехода упругой деформации в пластическую) приближаются к показателям интактной кожи. Таким образом, путем местного применения блокаторов р38 МАР-киназного сигнального каскада возможно добиться заживления кожномышечной раны с образованием более тонкого рубца без увеличения сроков заживления раны. Лечение различных травм или ран, возникших вследствие заболеваний, привело к накоплению бесценного хирургического опыта. Пластическая хирургия определила правила нанесения разрезов и их зашивания, а также сформулировала принципы замещения дефектов тканей. Однако приходится констатировать, что пока мы только хотели бы добиться естественного неосложненного хода событий и, не мечтаем усовершенствовать природу, чтобы иметь возможность формирования рубцов с заданными свойствами в заданные сроки или заживления раны без образования рубца. 18 Зеленин Н.В., Мантурова Н.Е., Шурыгин М.Г. и др. № 4 (67) декабрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты проведенного исследования показали, что существуют хорошие перспективы улучшения качества послеоперационного рубца. Они заключаются в использовании достижений молекулярной медицины - создании новых материалов (лекарственных пленок, шовного материала и т.д.) с заданными свойствами - с включением в состав данных материалов блокаторов р38 МАРК. Установлено, что блокатор р38 МАР-киназ SB 203580, который мы помещали внутрь полимерной рассасывающейся пленки, приводит к неосложненному заживлению кожномышечной раны с образованием достоверно более тонкого рубца, чем в контрольных опытах. Мы надеемся, что понимание роли MAPKкаскадов в этих процессах открывает перспективу для разработки новых способов воздействия на рост соединительной ткани, что приведет к качественному скачку в пластической хирургии. Конфликт интересов. Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить. Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.

Скачать электронную версию публикации