NEW PRODUCTS TISSUE-ENGINEERING IN THE TREATMENT OF SPINAL CORD INJURY.pdf ЭПидемиолоГия и Экономика дах России на догоспитальном и госпитальном ПоЗвоночно-сПинномоЗГовой этапах невысоки. Применяемые до настоящего Травмы времени хирургические и фармакологические методики дают неудовлетворительные или мини Показатели качества медицинской помощи мально эффективные результаты лечения [1, 2]. пострадавшим с сочетанной позвоночно-спин-На лечение одного пациента с осложненной номозговой травмой (ПСМТ) в различных горо-позвоночно-спинномозговой травмой российское Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3(54) сентябрь, 2015 Большаков И.Н., Сергиенко В.И., Киселёв С.Л. и др. здравоохранение затрачивает порядка 1 млн рублей в острейший, острый и промежуточный периоды после травмы. Число осложненных ПСМТ составляет в разных географических зонах России от 30 до 50 на 1 млн населения, что составляет 5 600-6 000 пострадавших в год. Таким образом, ежегодные расходы в острейший, острый и промежуточный периоды после травмы составляют около 5,6 млрд руб. Количество лиц, нуждающихся в уходе и нейрореабилитации в отдаленном периоде, в нашей стране составляет 55-60 тыс. человек. Затраты на одного такого пациента составляют в отдаленный период только за 1 мес без учета хирургической реабилитации порядка 720 тыс. руб. в год (четырехразовая реабилитация по 18 дней, согласно МЭС). Таким образом, затраты на всех нуждающихся в реабилитации составляют 43,2 млрд руб. Применение предлагаемого продукта-имплантата с целью реконструкции спинного мозга после анатомического разрыва предполагает устранение проблем со стороны тазовых органов. Стоимость лечения одного пациента с патологией тазовых органов, функция которых нарушена в результате осложненной нейротравмы, в течение 40 дней (МЭС) [3] составляет около 687,3 тыс. руб. Таким образом, восстановление в течение 40 дней только функции тазовых органов позволит сократить затраты здравоохранения на одного пациента в отдаленном послеоперационном периоде (средняя продолжительность жизни 10 лет) на 6,87 млн руб. Общее сокращение затрат на эту категорию больных может составить за 10 лет 412,4 млрд руб. Реабилитация в отдаленном периоде после травмы двигательной и чувствительной функций конечностей одного пациента сопровождается затратами порядка 542 тыс. руб в год. Восстановление двигательной и сенсорной активности в результате использования нового инновационного продукта может привести к сокращению сроков реабилитации с 72 до 18 дней в год, что позволит сократить затраты здравоохранения на сумму 362 тыс. руб в год. В целом сокращение затрат на реабилитацию этой категории больных с нарушениями двигательной и чувствительной функций конечностей по имеющимся МЭС может составить 21,75 млрд руб в год. За 10-летний период (средняя продолжительность жизни этой тяжелой категории пострадавших) высвободившиеся средства здравоохранения могут составить 217,5 млрд руб. введение На основе коллаген-полисахаридных конструкций разработан ряд продуктов, имеющих перспективу применения в качестве импланта тов при анатомическом разрыве спинного мозга. Применение подложек, содержащих коллагенхитозановый комплекс с включенными в него сульфатированными и несульфатированными гликозаминогликанами, факторами роста клеток, факторами пролиферации и дифференцировки стволовых клеток животных или человека, показало, что использование коллаген-хитозанового комплекса «Коллахит-бол» приводит к обратимым изменениям физико-химических свойств клеток. Процесс культивирования клеток на матрицах уменьшает их массу в состоянии апоптоза. Культивирование клеток подтверждает отсутствие цитотоксической реакции при контакте с матрицами. Сделан вывод о целесообразности перед процедурой трансплантации с целью улучшения эффективности приживления образца использовать клетки на этапе восстановления их функций и пролиферативной активности. Предварительные результаты исследований по поддержанию плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и изучение строения колоний этих клеток показывают, что культивирование на полученных подложках может поддерживать в течение 7 сут нормальное морфологическое состояние колоний плюрипотентных клеток мышей, характерное и для ЭСК человека. Иммуноцитохимическое исследование маркеров плюрипотентности показывает в ЭСК, культивируемых на матрице, что клетки экспрессируют ядерные белки oct-4, TRA1-60, cd30 и антиген SSEA4. Таким образом, предложенные режимы культивирования эмбриональных стволовых клеток мышей после соответствующей подготовки биодеградируемых матриц позволяют повысить качество и стабильность культивирования, поддерживать у эмбриональных стволовых и мультипотентных стволовых клеток нормальные уровни внутриклеточного кальция, рН, НАДН, вязкость мембран, пролиферативную активность, исключить цитогенотоксичность коллаген-хитозановой подложки, исключить на конечном этапе получения клеточной матрицы обработку клеток ферментами в процессе пассирования при смене питательной среды, повысить прикрепление клеток к поверхности матрицы, и, следовательно, предупредить их потерю при пересеве на питательные среды благодаря присутствию в ней хитозанового биополимера, обеспечить получение клеточной матрицы, пригодной для прямой трансплантации. Суть разрабатываемой технологии заключается в получении 3D-структуры на основе наноструктурированного хитозана, формируемой путем последовательного химического синтеза включения в состав этого природного линейного полимера сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов, нейрональных факторов № 3(54) сентябрь, 2015 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии детерминирования и роста, факторов роста стволовых клеток и самих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, предварительно получивших in vitro химические сигналы к нейрональной дифференцировке. Изделие медицинского назначения в виде эластичной губки содержит компоненты, функциональные свойства которых формируют наночастицы хитозана при биодеградации аналогично известной схемы с применением анионов триполифосфата натрия. В настоящем проекте роль структурирующих наночастицы веществ играют соли гиалуроновой, хондроитинсерной кислот и гепарин. Широкая полидисперсность частиц, получаемых в процессе приготовления препаратов на основе хитозана, корректируется при их применении в биодеградируемых подложках. Эта коррекция обусловлена протеканием ферментативной деградации хитозана и комплексов на его основе, которая сдвигает распределение масс молекул и размеров наночастиц в сторону меньших величин. Нейрональные подложки на основе хитозанколлагеновых комплексов в виде губки являются промежуточным продуктом, удобным для хранения и транспортировки. При клиническом использовании готового продукта губка в составе питальной среды имплантируется в рану. При этом происходит ее набухание и раскрепощение трансляционной подвижности наночастиц хитозана. При достижении наночастицами раневой поверхности происходит их включение в ферментативные процессы. В результате этих ферментативных реакций уменьшается размер молекул биополимера путем гидролиза хитозана по кислородным мостикам до уровня, позволяющего проникать через капилляры, поры и клеточные мембраны и эффективно выполнять функции системы переноса веществ, предусмотренных технологией, лекарственных препаратов, а также продуктов, подлежащих удалению. маТериал и меТоды 1. Иммуноцитоморфология ЭСК мыши и ЭСК человека (нейрональная дифференцировка) в условиях нейрональной кондиционированной среды и нейрональной добавки N2 (определениемаркеров GFAP, нейрофиламента и нестина) прикультивировании на опытных образцах коллагенхитозановых матриц in vitro: а) лиофилизированная коллаген-хитозановая матрица, содержащая сульфатированные и несульфатированные гликозаминогликаны (хондроитинсульфат, гиалуронатнатрия, гепарин) с включенными в нее элементами полной питательной среды DMEM; б) лиофилизированная коллаген-хитозановая матрица того же состава, что и в п. 1, с дополнительно включенной в состав кондиционированной нейрональными клетками средой; в) лиофилизированная коллагенхитозановая матрица того же состава, что и в п. 1, с включенной в нее нейрональной добавкой N2; г) лиофилизированная коллаген-хитозановая матрица того же состава, что и п. 1, с включенными в нее полной питательной средой DMEM, кондиционированной нейрональными клетками средой и нейрональной добавкой N2. 2. Иммуноцитохимический сэндвич-анализ диспергатов спинного мозга крыс (проточная цитометрия Guava Easy Cyte Mini, США), в различныесроки (от 1 до 20 нед) получивших трансплантаты различного состава (нейрональные маркеры: GFAP астроцитов, нейрофиламент и нестин, енолаза нейронов, маркер олигодендроцитов). 3. Иммуноцитогистохимический контроль жизнеспособности трансплантированных клеток мыши в спинной мозг крысы - наличие в ядрах пересаженных клеток плазмиды, контролирующей синтез флуоресцирующего белка GFP (микроскопия Olympus BX51 и программные продукты Applied Spectral Imaging (США)). 4. Гистологический серийный анализ с окраской гематоксилин-эозином срезов спинного мозга крысы после трансплантации предложенных контрольных и опытных нейроматриц в сроки 1-20 нед (Leica, Германия). 5. Иммуногистохимический серийный анализ нейротрансмиттеров (серотонин, ацетилхолин, ГАМК) в клетках на различных уровняхспинного мозга крыс в сроки 1-20 нед посттрансплантационного периода (Abcam, США). 6. Использование на животных (белые крысы линии Вистар) модели 100 %-й механическойтранссекции спинного мозга на уровне IX-X грудных позвонков с полным нарушением моторной, сенсорной и вегетативной функций спинного мозга, со 100 %-й летальностью в группе отрицательного контроля. Модели сопровождались поддерживающей антибактериальной, обезболивающей терапией, обеспечением дренирования функций желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы (без имплантационной терапии), энтеральным питанием в течение 1 мес смесями «Полипротэн» («ПРОмедфарм», Москва). 8. Трансплантация 100 тыс. нейрональных предшественников мыши (24 особи) или человека (18 особей) в анатомический разрыв спинногомозга крысы с последующим анализом неврологического дефицита. 9. Анализ экспрессии нейрональных маркеров клеток человека. В экспериментах по культивированию плюрипотентных клеток человека первоначально для наращивания биомассы использовали основную среду коДМЕМ с добавлением 10 % SR (заменительсыворотки), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1 ммоль L-глутамина, 4 нг/мл основного фактора Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3(54) сентябрь, 2015 Большаков И.Н., Сергиенко В.И., Киселёв С.Л. и др. роста фибробластов (bFGF), 1 ммоль растворнезаменимых аминокислот. Наращивание клеточной биомассы проводили во флаконах, покрытых 0,1 %-м раствором желатина. Смену среды осуществляли ежедневно. Состояние колоний оценивали визуально с помощью микроскопа Olympus BX-51. После третьего пассажа с помощью 0,5 %-го раствора коллагеназы ЭСК культивировали в среде с добавлением N2 компонента согласно инструкции производителя. 10. Иммунофлуоресцентный анализ плюрипотентных клеток человека. Каждые 3 сут проводилась формальдегидная фиксация с последующей иммуноцитохимией клеток с помощью антител против GFAP - глиального фибриллярного кислого белка (маркер астроцитов), нейрофиламентаи нестина. Выявление маркеров осуществляли методом согласно инструкции производителя антител. Ядра клеток окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) в течение 10 мин. Для получения изображений и анализа использовали флуоресцентный микроскоп Olympus BX51 и программные продуктыApplied Spectral Imaging (США). 11. Анализ неврологического дефицита с использованием шкалы ВВВ [4]. 12. Отработка Протокола культивирования, дифференцировки и пролиферации стволовых клеток человека (iPSCh) в нейрональном направлении на 6 контрольных и опытных биоинженерных нейроматрицах. Контроль жизнеспособности клеточной массы. 13. Анализ экспрессии нейрональных маркеров стволовых клеток человека (iPSCh) на биоинженерных нейроматрицах: а) модифицированная гликозаминогликанамиколлаген-хитозановая матрица, содержащая полную питательную среду DMEM; б) модифицированная гликозаминогликанамиколлаген-хитозановая матрица, содержащая кондиционированную питательную среду, полученную от нейрональных предшественников мЭСК; в) модифицированная гликозаминогликанами коллаген-хитозановая матрица, содержащая DMEM и нейрональную добавку N2; г) модифицированная гликозаминогликанами коллаген-хитозановая матрица, содержащая кондиционированную питательную среду от нейропредшественников, перепрограммированных мЭСК, и нейрональную добавку N2; д) модифицированная гликозаминогликанамиколлаген-хитозановая матрица, содержащая кондиционированную питательную среду, полученную от нейрональных предшественников чЭСК; е) модифицированная гликозаминогликанами коллаген-хитозановая матрица, содержащая кондиционированную питательную среду от нейропредшественников, перепрограммированных чЭСК, + нейрональную добавку N2. При работе с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека для заселения матриксов использовали нейрональные предшественники, полученные методом направленной дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) здоровых доноров по ранее разработанному протоколу [5]. Для засева матриксов использовалинейрональные предшественники, полученные из трех различных линий иПСК. Заселение матриксов проводилось в среде для культивирования, имеющей следующий состав: DMEM/F12, penicillin/ streptomycin 1x, B27 1x, BDNF 10 ng/ml, Forskolin 4 .M. Заселение матриксов проводилось двумя способами. В первом случае матрикс предварительно вымачивали в DMEM/F12, penicillin/ streptomycin 1x, B27 1x, BDNF 10 ng/ml, Forskolin 4 .M на протяжении 2-4 ч в лунках 24-луночного планшета, после чего излишки среды по краям отбирались и на поверхность матрикса с помощью наконечника наносилось 100 мкл суспензии, содержащей 106 клеток. Клетки в течение 1 ч оставляли прикрепляться в СО2-инкубаторе, после чего в лунку добавляли 1 мл среды, до полного закрытия поверхности матрикса. Наблюдение за клетками проводили на протяжении 8-10 сут. В качестве контроля нейрональные предшественники засевались в лунку, покрытую матригелем. реЗУльТаТы 1. Контроль фенотипа и функции клеток при культивировании на коллаген-хитозановых матрицах показал, что добавление в культуральную среду компонента нейрональной добавки N2 или кондиционированной среды приводит к нейрональной дифференцировке ЭСК мыши и человека. Исследование морфологии клеток показывает, что ЭСК после культивирования в вышеописанных условиях способны приобретать нейрональный фенотип. На 1-е сут в обоих случаях отсутствуют сигналы флуоресценции нейрофиламента. На 5-е сут характерно появление экспрессии нейрофиламента при культивировании ЭСК в кондиционированной среде от эмбриональных нейрональных клеток, а на 7-е сут - и в клетках, культивируемых в среде с добавлением N2 компонента. Аналогичная картина наблюдается и в случае определения маркеров GFAP и нестина. Таким образом, результаты показывают, что, как и при культивировании на матрицах в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками среде, так и в среде с добавлением N2 компонента ЭСК на 14-е сут экспрессируют маркеры, характерные для нейрональных клеток и приобретают их морфологию. 2. Предварительный морфологический и цитохимический анализ клеток спинного мозга при № 3(54) сентябрь, 2015 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии спинальной травме и трансплантации нейроматрицы показал, что трансплантированные на матрице предшественники нейронов жизнеспособны и пролиферируют в течение 2 нед. Относительное содержание клеток, экспрессирующих фактор GFP, не изменяется на протяжении 2 нед и составляет около 34 %. 3. Результаты анализа гистопрепаратов показали, что при имплантации матрицы с клетками в спинной мозг происходит приживление и миграция их в раневой зоне с последующей дифференцировкой в нейрональном направлении в течение 1-4 нед. Ключевое значение имеет не только трехмерная структура носителя, но и нейрональное окружение клеток в ране. У животных как в ранние сроки, так и в поздний период наблюдается наличие трансплантированных клеток, дифференцирующихся в тканеспецифические типы. При дифференцировке клеток по нейрональному направлению в продольном срезе спинного мозга отмечаются наличие нейрофиламентов в клеточном цитозоле и образование синапсов. 4. При выполнении анализа наличия енолазы в препаратах спинного мозга после обработки клеток антителами против енолазы и последующего мечения вторичными антителами с детекцией флуоресценции обнаруживается специфический белок нейрона. При обработке антителами против глиального кислого белка последний также обнаруживается в клеточной массе трансплантированных клеток. В препаратах спинного мозга ЭСК, обработанных антителами против олигодендроцитов, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флюоресценции, последние обнаруживаются в зоне прямой трансплантации. Исследование гистологических препаратов области имплантации, окрашенных гематоксилин-эозином, показывает, что имплантация клеток на матрицах (независимо от состава) демонстрирует болеевысокую скорость заживления по сравнению с имплантантами без клеток. Клетки в матрицах не только выживают, но и заполняют всю структуру. Количество волокон биополимера в таких препаратах снижено, что свидетельствует о высокой метаболической активности в зоне репарации. При заполнении матрицы клетками ткань, образованная ими, приобретает структуру, идентичную неповрежденным участкам. На 4-й нед после имплантации биополимерный материал практически полностью деградирует, замещается клеточной массой, схожей с интактными участками, тогда как при имплантации матрицы без клеток в тот же срок клеточность зоны экспериментального повреждения незначительна, количество биополимерного материала превышает его содержание в опытных образцах, содержащих имплантированные клетки. 5. Анализ маркеров нейронов в диспергатах спинного мозга из мест дислокации спинальной травмы и имплантации нейрональной матрицы показывает, что в образцах присутствуют GFPмеченые клетки независимо от типа имплантированных матриц, обнаруживается стабильная экспрессия GFP на 3-й и 4-й нед после трансплантации в зону повреждения спинного мозга, что указывает на способность к хоумингу трансплантированных клеток в зоне повреждения. Анализ образцов гистологических препаратов на наличие маркеров нейрональной дифференцировки и восстановление нормальных синаптических межклеточных связей указывает на то, что трансплантированные клетки экспрессируют маркеры олигодендроцитов и нейрофиламентов, образуя межсинаптические связи. Встречаются меченные против нейрофиламента клетки, что указывает на дифференцировку в данном направлении перенесенных ЭСК. Исследование маркеров на мембранах олигодендроцитов показывает, что клетки формируют характерные морфологические структуры. 6. Анализ маркеров передачи нервного сигнала при частичной травме спинного мозга показал, что в сегментах центральной нервной системы, находящихся выше контрольного бесклеточного трансплантата, обнаруживаются клетки, экспрессирующие ГАМК, ацетилхолин и серотонин в сроки от 1 до 4 нед после оперативного вмешательства. В контроле зона имплантации матрицы заполнена межуточной тканью с клетками материнского спинного мозга, экспрессирующими выше названные нейротрансмиттеры. В хвостовой части спинного мозга обнаруживается жизнеспособная ткань с клетками, продуцирующими медиаторы передачи нервного сигнала. 7. У животных опытной серии при частичной травме спинного мозга в зонах головной и хвостовой части обнаруживается идентичная контролю картина экспрессии нейротрансмиттеров. Вместе с тем, регистрируется феномен спрутинга трансплантированных предшественников нейрональных клеток из зоны трансплантации в проксимальный отдел материнского спинного мозга. В цитоплазме клеток кроме обнаружения зеленого флуоресцирующего протеина выявляется экспрессия нейромедиаторов. Во всей зоне трансплантации в спинной мозг коллаген-хитозановой матрицы с предшественниками нейрональных клеток помимо клеток материнской ткани регистрируется высокое число клеток, содержащих в цитоплазме GFP. Кроме того, эти клетки экспрессируют ГАМК, ацетилхолин и серотонин. В хвостовой части спинного мозга ниже трансплантированной клеточной матрицы наблюдается спрутинг предшественников нейрональных клеток (клетки, экспрессирующие ацетилхолин-GFP, через 2 нед после трансплантационного периода). Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3(54) сентябрь, 2015 Большаков И.Н., Сергиенко В.И., Киселёв С.Л. и др. 8. Иммунофлуоресцентный анализ нейротрансмиттеров контрольных серийных срезов головного отдела спинного мозга крысы через 20 нед после его полной транссекции (непосредственно надтрансплантационная зона) показывает, что межуточная ткань заполнена ядерной клеточной массой, активно экспрессирующей ГАМК, ацетилхолин и серотонин. Число таких клеток имеет равномерный характер распределения от центра к зоне трансплантата. 9. Серийный иммунофлуоресцентный анализ зоны коллаген-хитозанового трансплантата показывает, что через 20 нед после операции зона заполнена межуточной мозговой тканью с большим числом жизнеспособных нейрональных клеток материнского спинного мозга, активно экспрессирующих маркеры ГАМК, ацетилхолин и серотонин. Кроме того, зона трансплантата содержит большое количество вновь образованных микрокапилляров, содержащих тела эритроцитов с эффектом аутофлуоресценции. Количество ядросодержащих клеток материнского спинного мозга в трансплантате уменьшается по направлению к хвостовому отделу. В хвостовой зоне спинного мозга (ниже трансплантата) число ядросодержащих клеток существенно меньше, чем в головной зоне и в контрольном трансплантате. Тем не менее, жизнеспособные клетки экспрессируют нейротрансмиттеры ГАМК, ацетилхолин и серотонин. 10. Исследование опытных образцов спинного мозга, содержащих, кроме нейронального микроокружения факторов роста, 100 тыс. предшественников нейрональных клеток мыши, показывает, что со стороны трансплантата регистрируется спрутинг клеток, продуцирующих GFP, в зону центрального отдела материнского спинного мозга. Трансляция ядросодержащих клеток сопровождается экспрессией нейромедиаторов ГАМК, ацетилхолина и серотонина. Детальный серийный анализ срезов собственно клеточного трансплантата в спинном мозге указывает на богатое содержание жизнеспособных нейронов, продуцирующих GFP и одновременно экспрессирующих нейромедиаторы. Трансплантированная клеточная масса помимо пришедших материнских нейрональных клеток занимает весь объем коллагенхитозановой подложки. В хвостовой части спинного мозга опытной группы животных регистрируется сниженное число ядросодержащих клеток с экспрессией нейромедиаторов и без таковой. Изучение серийных срезов ниже коллаген-хитозанового клеточного трансплантата (хвостовойотдел спинного мозга) выявляет слабый феноменспрутинга GFP-клеток. 11. Установлено, что добавление в культуральную среду компонента N2 приводило к нейрональной дифференцировке ЭСК человека. Исследование морфологии клеток показало, что ЭСК после культивирования в вышеописанных условиях способны приобретать нейрональный фенотип. Отмечено, что на 1-е сут в обоих случаях отсутствуют сигналы флуоресценции по указанному маркеру. На 7-е сут наблюдалось появление экспрессии нейрофиламента при культивировании ЭСК в среде с добавлением N2 компонента. Еще через 1 нед при анализе ЭСК выявляются и другие маркеры нейрональной дифференцировки, такие как нестин и глиальный фибриллярный кислый протеин (GFAP) (рис. 1-6). Рис. 1. 1-е сут. Отсутствие экспрессии нейрофиламента Рис. 2. 7-е сут. Экспрессия нейрофиламента Рис. 3. 14-е сут. Экспрессия нейрофиламента Рис. 4. GFAP Рис. 5. Нестин Рис. 6. Нейрофиламент № 3(54) сентябрь, 2015 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии 12. Анализ неврологического дефицита у крыс после полной транссекции спинного мозга показывает, что трансплантация бесклеточной коллагенхитозановой матрицы в диастаз спинного мозга на уровне IX грудного позвонка приводит к заметному сокращению объема нарушений, восстанавливая функции тазовых органов в полном объеме, а также обеспечивает 5-6-й уровни восстановления моторных и сенсорных функций спинного мозга в течение 20 нед наблюдения. Имплантация в диастаз спинного мозга коллагенхитозановой подложки с 100 тыс. предшественников нейрональных клеток мыши приводит к практически полному устранению нейродефицита, достигая в течение 20 нед 20-го уровня восстановления (из 21-го возможного) (рис. 7). Имплантация в спинной мозг крысы нейроматрицы, содержащей 100 тыс. нейрональных предшественников ЭСК человека, повторяет результаты трансплантации контрольных нейроматриц, не содержащих клеточную массу, устраняя нейродефицит в течение 14 нед после трансплантации порядка 5-6 баллов по шкале ВВВ (рис. 8). Рис. 7. Динамика изменения неврологического ста 13. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека на матриксах росли компактными группами, не выпускали нейриты, рост скорее наблюдался не по повермхности подложки, а над ней (рис. 9). В то же время контрольные клетки, как и положено, выпускали длинные нейриты, достигающие размеров в несколько миллиметров и формировали сетевую структуру (рис. 10). Внутрь матрикса клетки не проникалии при длительном культивировании формировали около поверхности сферические структуры, напоминающие нейросферы (рис. 11). В связи с этим был использован другой способ заселения матриксов, который мог бы обеспечить более глубокое проникновение клеток. Для этого сухие матриксы помещались в криопробирку, в которой находилась суспензия клеток в концентрации 2 • 106/мл. Пробирки помещались на 1 ч в СО2-инкубатор. После этого матрикс извлекался из пробирки и помещался в 24-луночную плашку и залитую средой доверху (1 мл). Использование этого подхода позволило немного увеличить проникновение клеток внутрь матрикса. Анализ роста клеток показал, что одиночные клетки распределяются по матриксу, но растут и пролиферируют значительно хуже, чем в контроле. Вполне вероятно, что ни один из примененных способов заселения матрикса не обеспечивает полноценного заселения матрикса в связи с низкой адгезивностью нейрональных клеток к его поверхности. Для подтверждения того, что матриксы заселяются действительно нейрональными предшественниками, было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток, растущих на матриксах антителами в b3 тубулину, маркеру нейрональных клеток (рис.12, 13). Как видно из рис. 12, 13, не менее 90 % клеток имеют нейрональный маркер b3 тубулин. Уровень восстановления, баллы Срок, нед Применение антител позволило визуализовать туса крыс по шкале BBB на протяжении 20 нед после трансплантации ЭСК мыши (серый и черный мар нейриты. Из приведенных микрофотографий кер - две задние лапки в опыте, пунктирные марке видно, что нейриты очень короткие и сильно ры - две задние лапки в контроле) искривленные. Создается впечатление, что в от Уровень восстановления, баллы личие от нейритов, сформированных контрольными нейронами на матригеле, нейриты на матриксе пытаются избежать контактов с ним и формируются между отдельными группами нейронов «на весу». Разницы в росте клеток на разных типах матрикса от «а» до «г» не обнаружено. Матриксы под индексами «д» и «е» засевались труднее всего и деформировались после засева (картина скручивания). С целью преодоления низкой адгезивности матриксов ней Срок, нед рональными предшественниками и нейронами Рис. 8. Динамика изменения неврологического ста туса крыс по шкале BBB на протяжении 14 нед после трансплантации плюрипотентных клеток человека была предпринята попытка заселения матриксов комплексом нейрональных и глиальных клеток, (черный маркер - правая лапка, серый маркер - леваяполученных из одной и той же культуры индуцилапка) рованных ПСК (рис. 14). Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3(54) сентябрь, 2015 60 Большаков И.Н., Сергиенко В.И., Киселёв С.Л. и др. Рис. 9. Световой фазовый контраст нейрональных предшественников, засеянных суспензионно на матриксы. Группы клеток указаны стрелками Рис. 10. Световой фазовый контраст контрольных нейрональных предшественников, засеянных на лунку, покрытую матригелем 500 мкм Рис. 12. УФ-изображение нейрональных предшественников, выращенных на матриксе и окрашенных антителами к b3 тубулину (зеленый) 100 мкм Рис. 11. Световой фазовый контраст нейрональных предшественников при длительном культивировании на матриксе Рис. 13. УФ-изображение нейрональных предшественников, выращенных на матриксе и окрашенных антителами к b3 тубулину (зеленый) и DAPI (синий) Рис. 14. УФ-изображение нейрональных и глиальных клеток при их совместном культивировании на матриксах на протяжении 8 сут. Окраска DAPI Не исключено, что в присутствии глиальных клеток нейрональные культуры будут вести себя на матриксах более физиологично и будут формировать нейрональные сети. В целом очевидно, что дальнейшие исследования потребуют внесения поправок в содержание белка в подложке, характеристик коллагена, сочетания клеток различной нейрональной природы, изменения 3D-структуры самой матрицы с ориентированными аксональными каналами для быстрого внедрения и роста клеток, качества и количества молекулярных нейродобавок.

Скачать электронную версию публикации