USE COMPOSITE MATERIAL AS A WAY TO ELIMINATE RESIDUAL VOIDS IN THE LIVER IN EXPERIMENTAL CONDITIONS.pdf ВВЕДЕНИЕ ОПП возникают в результате хирургического лечения различных кистозных образований, в том Закрытие остаточных полостей печени числе непаразитарной и паразитарной этиоло( ОПП) является актуальной проблемой современной реконструктивной хирургии [2, 6, 13]. гии (эхинококкоз), опухолей, абсцессов печении посттравматических образований. Чаще всего Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 2 (57) июнь’2016 44 Хижняк И.И., Третьяков А.А., Стадников А.А., Неверов А.Н. (до 80% случаев) при эхинококкозе поражается печень [3, 14]. Часто образующиеся в результатехирургического лечения очаговых заболеваний печени остаточные полости таят в себе угрозу развития серьезных осложнений: кровотечения, формирование гнойных и желчных свищей, нагноение и прорыв инфицированной полости в желчеотводящие пути, брюшную полость, поддиафрагмальное и подпеченочное пространство [19]. Для ликвидации ОПП, в частности, после эхинококкэктомии, предлагались различные методики. Результаты их применения не могут удовлетворять хирургов, так как ни одна из них не решает проблемы инфицирования полости и формирования послеоперационных кист (Вишневский В.А. с соавт. 2003). Одним из путей решения этой проблемы, на наш взгляд, является использование для пломбировки ОПП синтетических материалов на основе коллагена. Наноразмерный гидроксоапатитколлагеновый биополимерный композит «ЛитАр» в настоящее время используется для замещения дефектов в челюстно-лицевой хирургии, травматологии и ортопедии, урологии, гинекологии, пульмонологии [9-11]. На 70% «ЛитАр» имеет пористую структуру, тем самым способствуя интенсивному васкулогенезу и обеспечивая короткое время его биотрасформации. Однако, несмотря на обширность применения «ЛитАр», сведения о применении коллагенового композита при реконструктивных операциях на печени в доступной нам литературе отсутствуют. В последние годы в схемы местной антибактериальной терапии при различных гнойновоспалительных процессах стали вводить антибиотики совместно с окситоцином, целесообразность использования которого обоснована экспериментальногистологическими и микробиологическими исследованиями [1, 4, 7, 8, 15-18]. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Все исследования выполнены на 69 лабораторных белых крысах-самцах линии Вистар массой тела 280-300 г. Было проведено шесть серий опытов. В 1-й серии была создана модель остаточной полости печени путем имплантации в правую долю органа силиконового шарика диаметром 6-9 мм на срок 14 сут, после чего шарик изымался из печени. Во 2-й серии полость, сформированная по вышеописанной методике диаметром около 8-9 мм, на стадии 14 сут эксперимента заполнялась композитом «ЛитАр» размером 0,25 см, другого лечения не проводилось. В 3-й серии опытов сформированная таким же образом полость на стадии 14 сут заполнялась «ЛитАром», который затем пропитывался раствором окситоцина (1 МЕ), при этом после пломбировки в течение 10 дней экзогенно к месту имплантации ежедневно подводился раствор окситоцина (1 МЕ) через установленную в ОПП хлорвиниловую трубку. В 4-й серии эксперимента сформированная по вышеописанной методике полость перед заполнением предварительно инфицировалась культурой Klebsiellaе pneumoniaе, штамм ГИСК № 278, затем полость заполнялась композитным материалом. В 5-й серии аналогичная полость, инфицированная культурой Kl. pneumoniaе, пломбировалась «ЛитАром», пропитанным раствором окситоцина (1 МЕ) и в течение 10 дней экзогенно к месту имплантации ежедневно подводился раствор окситоцина (1 МЕ). В 6-й серии опытов инфицированная полость заполнялась композитным материалом «ЛитАр», пропитанным раствором окситоцина (1 МЕ), в течение 10 дней после операции внутримышечно вводился антибиотик цефоперазон 2 раза в сутки по 50 мг/кг массы тела и экзогенно к меступластики подводился раствор окситоцина (по1 МЕ ежедневно) и цефоперазон. Участок имплантации в печень композитного материала «ЛитАр» иссекался для последующего изучения на светооптическом, иммуноцитохимическом (идентификация экспрессии синтеза прои антиапоптотических генов р53, Bcl-2, caspasa-3, пролиферативного протеина Ki-67) и электронномикроскопическом уровнях. Формирование модели остаточной полости в печени осуществлялось следующим образом. С соблюдением правил асептики и антисептики под масочным эфирным наркозом у крыс выполнялась верхнесрединная лапаротомия. Правая доля печени выводилась в операционную рану. Тупым и острым путем в правой доле формировался туннель, в который погружали силиконовый шарик на стерильной нитке, которую затем завязывали для фиксации шарика в печени. Место погружения укрывалось большим сальником. Печень с имплантированным в нее силиконовым объектом погружали в брюшную полость, операционная рана послойно ушивалась наглухо. РЕЗУЛЬТАТЫ На основании анализа гистологических препаратов было показано, что через 3 сут опыта по краю имплантированного объекта формируется выраженный демаркационно-некротический вал, включающий в себя макрофаги, лимфоциты и полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилыи эозинофилы). Зона некротических измененийсущественно нарастала к 7-м сут и являлась пролонгированным «раздражителем», обеспечивающим развитие воспалительных реакций в тканях печени, вплоть до 14 сут эксперимента. Таким № 2 (57) июнь’2016 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 45 образом, установлено, что через 7 сут опыта в ОПП присутствуют явления дисрегенерации паренхиматозных структур органа, что проявляется в интенсивном фибриллогенезе, опережающем пролиферацию гепатоцитов. Деструкция, некробиотические изменения гепатоцитов сопровождались полиморфноклеточной инфильтрацией вокруг печеночных триад и погибших гепатоцитов. Процессы гибели гепатоцитов (в краевой зоне) нарастали к 14-м сут. При этом отмечалось разрастание соединительной ткани не только по краю полости, но и в зонах печеночных долек, размеры которых долек в области ОПП существенно уменьшены. Мы еще раз отмечаем, что при создании модели ОПП не наблюдается признаков инволюции рубцовых структур, которые испытывают на себе длительное механическое воздействие со стороны имплантированного в печень силиконового шарика. Все это свидетельствует о развитии стойкого фиброза участков печеночной ткани, которые контактировали с инородным телом (силиконовым шариком). Использование в качестве лечебного средства «ЛитАра» для ликвидации ОПП показало, что через 3 сут эксперимента визуально при клиническом осмотре и гистологическом исследовании данный объект набухает и начинает заполнять все пространство остаточной полости. К 7-м сут эксперимента, разбухая, композит не выходил за пределы сформированной полости, и, заполняя ее целиком, был интимно сращен со стенками ОПП, в нем видны новообразованные сосуды. При этом выявлялись гипертрофия большей части гепатоцитов в зоне, прилегающей к ОПП, повышение их митотической активности, а также повышение экспрессии синтеза протеина Ki-67 (в 3 раза по сравнению с нелеченными животными). В итоге на фоне резорбции композита происходило не только частичное заполнение ОПП соединительно-тканными элементами, но и органотипическими структурами (новообразованными печеночными клетками, формирующими атипические балки) (рис. 1). При включении в комплекс лечебных мероприятий окситоцина мы отметили пролонгированное формирование малодифференцированной соединительной ткани в области имплантированного композита (до 14 сут) с признаками интенсивного васкулогенеза. Клеточные элементы (фибробласты, эндотелиоциты) давали позитивную окраску на идентификацию экспрессии синтеза протеина Кi-67, при лимитировании экспрессии синтеза белка caspasa 3. Подобные изменения мы наблюдали и в капсулярной зоне ОПП, которая претерпевала гистологическую трансформацию из грубоволокнистого состояния в хорошо васкуляризованную рыхлую волокнистую соединительную ткань. В этих случаях признаки гранулематозного воспаления не наблюдались. Это обеспечивает не только частичное заполнение ОПП соединительнотканными элементами, но и органотипическими структурами (новообразованные холангиолы и печеночные клетки, формирующие атипические балки) (рис. 2). АА А Рис. 1 Новообразованные печеночные клетки (А). 2-я серия, 14-е сут эксперимента. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Ув.: об. 40, ок. 10. Стрелками показаны эозинофилы А Б Б Рис. 2 Органотипический регенерат в ОПП. Новообразованные холангиолы (А) и печеночные клетки (Б), формирующие атипические балки. 3-я серия, 14-е сут эксперимента Синусоидные и желчные капилляры, как правило, сохраняли свои просветы и не имели признаков нарушений микроциркуляции крови и оттока желчи. Электронномикроскопические исследования показали, что гепатоциты имели структурно-функциональную характеристику, свойственную нормальному цитологическому статусу (рис. 3). Мы подчеркиваем, что визуально к 30-м сут ОПП без применения окситоцина и к 14-м сут с применением данного нейропептида полностью заполнена органотипическим регенератом, внешне не отличающимся ни по цвету, ни по консистенции от паренхимы печени. Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 2 (57) июнь’2016 46 Хижняк И.И., Третьяков А.А., Стадников А.А., Неверов А.Н. Рис. 3. Фрагмент гепатоцита из пограничной зоны ОПП. Электронограмма: А - ядро; Б - эндоплазматический ретикулум; В - включения гликогена. 14-е сут эксперимента. Ув. 28000 ОБСУЖДЕНИЕ Использование этого композита в качестве лечебного средства для ликвидации инфицированной ОПП не лимитирует развитие гнойнонекротического процесса, не обеспечивает реализации адекватной репаративной гистотипической потенции ткани печени. В представленной серии опытов были получены морфологические сведения о том, что сформированная ОПП и окружающие ее структуры органа демонстрировали признаки развития гнойно-некротического вос паления, свойственные гепатиту уже на 7-е сут. В данных условиях эксперимента портальные тракты были особенно расширенными с выраженной перипортальной воспалительной инфильтрацией и формированием лимфоидных фолликулов с герменативными центрами. Описанные факты свидетельствуют о том, что в моделируемых условиях развивается морфологическая картина лобулярного и перипортального гепатита. При моделировании ОПП, а также при замещении ее «ЛитАром» в условиях инфицирования всегда нарастали явления апоптоза гепатоцитов на фоне снижения у них экспрессии синтеза протеина Ki-67 (таблица). Несмотря на морфологические изменения, происходящие в ткани печени и в ОПП, визуального отторжения имплантированного в инфицированную полость композитного материала ни в одном случае не наблюдалось. К 14-м и 30-м сут участок печени, в который погружался «ЛитАр», визуально имел обычный цвет, мягкоэластическую плотность, фибринозный налет на поверхности отсутствовал (рис. 4). На разрезе этот участок имел однородную структуру, темновишневый цвет, без признаков инфицирования (без очагов скопления гноя). Фрагменты композитного материала отсутствовали. При включении в комплекс лечебных мероприятий окситоцина при коррекции заранее инфицированной ОПП, создаются условия для адекватной пролиферации Изменение экспрессии про-, антиапоптотических протеинов и Ki-67 у гепатоцитов в пограничной зоне ОПП, %. Стадия: 14 сут Показатель ОПП ОПП + «ЛитАр» ОПП + «ЛитАр» + инфиц. ОПП + «ЛитАр» + инфиц. + окситоцин ОПП + «ЛитАр» + инфиц. + антибиотик р53 0,99 ± 0,02 1,14 ± 0,01 2,81 ± 0,12 0,81 ± 0,22 0,61 ± 0,11 Bсl-2 0,13 ± 0,04 0,25 ± 0,03 0,39 ± 0,20 0,46 ± 0,06 0,51 ± 0,11 Caspasa 3 0,72 ± 0,03 1,56 ± 0.03 2,91 ± 0,11 1,11 ± 0,11 0,70 ± 0,01 Ki-67 0,13 ± 0,02 0,22 ± 0,09 0,13 ± 0,01 0,79 ± 0,04 0,80 ± 0,06 Рис. 4. Участок печени экспериментального животного. Вид ОПП (указаны стрелками) на 30-е сут эксперимента. 4-я серия эксперимента малодифференцированной ткани, формирование которой зарегистрировано как в области имплантированного композита, так и в капсулярной зоне ОПП. Установлено, что использование окситоцина в условиях инфицирования ОПП лимитирует развитие гнойно-некротических процессов, отграничивает зоны некроза от жизнеспособных тканей, стимулирует репаративные и органотипические потенции тканей печени как в самой ОПП, так и в пограничных с ней зонах органа, приводит к замещению полости органотипическим регенератом. К 30-м сут ОПП заполняется визуально гистиотипической тканью печени, которая не отличается по цвету и консистенции от окружающей паренхимы. Сочетанное использование окситоцина с антибиотиком существенно потенцирует позитивные антиапоптотический и пролифератогенный эффекты, реализуемые паренхиматозными элементами печени. Электрон № 2 (57) июнь’2016 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 47 но-микроскопические исследования показали, что цессы репаративного гистогенеза в гистострукгепатоциты имели структурно-функциональную турах печени и холангиолах ОПП, в том числе в характеристику, свойственную нормальному условиях инфицирования полости, обеспечивая цитологическому статусу. оптимальные условия для активной пролиферации малодифференцированной ткани, регенера ЗАКЛЮЧЕНИЕ ционной гипертрофии гепатоцитов в зоне, при Таким образом, применение коллагенового легающей к ОПП, повышения их митотической композита «ЛитАр» в сочетании с окситоцином активности и заполнения остаточной полости и антибиотиком при пломбировке ОПП оказы-как соединительно-тканными элементами, так и вает максимально позитивное влияние на про-органотипическими структурами.

Скачать электронную версию публикации