IMMUNOHISTOCHEMICAL ESTIMATION OF EFFECTIVENESS OF MICROBIAL TRANSGLUTAMINASE IN BURN'S WOUND HEALING EXPERIMENT.pdf ВВЕДЕНИЕ инновационного препарата, содержащего комплекс фитосоединений в качестве основы автор По данным Всемирной организации здравоохранения, термические поражения занимают третье место среди прочих травм; в Российской Федерации на их долю приходится 10-11% [1, 2]. Несмотря на достижения репаративной медицины, вопрос полноценного заживления ожоговых ран в максимально быстрые сроки остается актуальным. Одной из основных причин в структуре летальности при глубоких ожогах служит развитие вторичной бактериальной инфекции, вызывающей гибель до 75% пациентов [3]. Немаловажным аспектом также является эстетическая сторона проблемы, а именно рубцовые осложнения, которые существенно снижают качество жизни пациентов, особенно при ожогах открытых частей тела, прежде всего лица [1]. Такие ожоги, по данным различных авторов, составляют от 25 до 50% [2, 3]. Следует отметить ивысокую стоимость реабилитационного периода [1-3]. Сложность медикаментозного контроля процессов заживления связана с тем, что это комплексный динамический процесс, состоящий из четырех непрерывных, перекрывающихся и строго запрограммированных фаз: быстрого гемостаза, собственно воспаления, пролиферации и ремоделирования тканей [4]. События каждой фазы должны происходить точным и регламентированным образом. Прерывания, аберрации или пролонгация процесса могут привести к задержке репарации с последующим рубцеванием или к хроническим незаживающим повреждениям [5]. Поэтому поиск новых, недорогих в производстве биотехнологических лекарственных средств, предназначенных для коррекции раневого процесса и лечения ран, представляется актуальным и своевременным [6-10]. Одним изперспективных направлений является использование трансглютаминаз - ферментов, образующих прочные химические связи, в клетках и в молекулах межклеточного вещества. Трансглютаминазы микробного происхождения (МТГ) представляют наибольший практический интерес для расширения возможностей хирургии и комбустиологии [11]. Цель исследования: изучить особенности морфогенеза регенераторных процессов кожи при моделировании ожоговых ран III степени в условиях местной терапии микробной трансглютаминазой с вспомогательной экспериментальной субстанцией авторской фитомази. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ На основании биофармацевтических и биологических исследований предложен состав ской фитомази и МТГ в концентрациях 0,1 и 0,03%. В составе мази - экстракты трав, обладающих ранозаживляющим, противовоспалительным и ангиопротекторным действием: зверобоя продырявленного, вероники лекарственной, лопуха, чернокорня лекарственного. Эти активные компоненты введены в масляную основу, включающую яичное масло, масло виноградных косточек в комбинации с животными жирами. Мазь использовали как самостоятельное средство и базу для МТГ из порошка для пищевой промышленности «ЭлайТ-актив 100» в концентрациях 0,1 и 0,03%. МТГ в составе мази делает ее структуру схожей с гелем, что позволяет использование на всех этапах ранозаживления. «ЭлайТ-актив 100» произведен ЗАО «Компания Милорд» (Московская обл.), ТУ9199-049-48470548-07 с изм. № 1-4. Экспериментальные исследования выполняли в два этапа. 1. Изучали гистологические и гистохимические аспекты регенерации кожных ран на 150 белых беспородных мышах, у которых моделировали ожоги кожи III степени. Для этого животных предварительно наркотизировали, выбривали шерсть. Ожог моделировали в межлопаточной области путем прикладывания к ограниченному участку кожи раскаленного цилиндра размером 1,0 . 1,0 см на 30 с. 2. Исследовали иммунофенотип клеточных элементов эпителиального и соединительнотканного компонентов кожного регенерата на 96 белых беспородных крысах; моделирование ожоговых ран проводили вышеописанным способом. Необходимость второго этапа эксперимента обусловлена недостоверностью данных, полученных в ходе анализа результатов иммуногистохимического (ИГХ) исследования вследствиегомологичности антител к тканям мышей, а также с целью воспроизведения результатов первого этапа эксперимента на других биологических объектах. При проведении экспериментальных исследований соблюдали принципы и положения Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (US NIH, № 85-23), международных правил «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (2009) с учетом Конвенции Совета Европы о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). На проведение работы было получено разрешение комитета по этике ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» (г. Симферополь) (протокол № 2 от 11 сентября 2015 г.). № 1 (64) март’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 33 Характеристика экспериментальных групп лабораторных животных Название серии Сокращенное название Характер проводимого лечения Сроки взятия материала, сут Количество Лабораторные белые мыши - общая гистология Ожог III степени ОК Без лечения 3, 5, 7, 10, 21 6 ОС Солкосерил 3, 5, 7, 10, 21 6 ОМ Фитомазь 3, 5, 7, 10, 21 6 ОФ1 Мазь + фермент МТГ 0,1% 3, 5, 7, 10, 21 6 ОФ2 Мазь + фермент МТГ 0,03% 3, 5, 7, 10, 21 6 Лабораторные белые крысы - ИГХ-исследование Интактные К - - 6 Ожог III степени ОК Без лечения 3, 10, 21 6 ОС Солкосерил 3, 10, 21 6 ОМ Фитомазь 3, 10, 21 6 ОФ1 Мазь + фермент МТГ 0,1% 3, 10, 21 6 ОФ2 Мазь + фермент МТГ 0,03% 3, 10, 21 6 Все животные были разделены на группы в зависимости от применяемого в качестве терапии препарата (таблица). Лекарственные препараты наносили ежедневно на раневую поверхность, раны вели открыто, без использования перевязочных материалов. Фрагменты кожи для морфологических исследований у мышей брали на 3-и, 5, 7, 10 и 21-е сут, а у крыс - на 3-и, 10, 21-е сут после декапитации под изофлурановым наркозом. Для изучения эффективности действия исследуемых лекарственных средств использовали комплекс морфологических методов: стандартное гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином и ИГХ-метод. ИГХисследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полизином (Menzel-Glaser, Германия), система визуализации En vision. Ядра докрашивали гематоксилином. Тепловую демаскировку антигенов проводили в микроволновой печи Samsung М 1915 NRпри фиксированной мощности 800 Вт в течение 2 мин. С целью контроля метода проведена серия исследований с использованием позитивных и негативных образцов, которые служили эталонами [12]. Морфометрическое исследование включало измерение количества позитивных клеток на 100 клеток в 10 полях зрения (в поле зрения при увеличении .200) с помощью программы SoftwareDP-SOFT. Пролиферативную активность изучали с помощью моноклональных антител Ki-67 (клон SP-6). Клетки гистиоцитарной природы визуализировали с использованием моноклональных антител к CD68 (Clone PG-M1), а оценку реактивности стромы с определением мембранной экспрессии проводили с маркером синдекан1/ CD138 (Сlone MI15) [12]. Просмотр и цифровые фотографии микропрепаратов осуществляли цифровой камерой OLYMPUS C 5050Z, установленной на микроскопе «Olympus CX-41». Полученные результаты подвергали математической обработке с помощью компьютерной программы Statistica 10. При анализе данных для проверки статистической значимости использовался парный двухвыборочный t-тест для средних и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при уровне р < 0,05 [13, 14]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В интактной коже крыс определялась позитивная очаговая ядерная экспрессия Ki-67 (3,1 ± 0,03), преимущественно в базальном слое многослойного плоского эпителия (МПЭ). Позитивная цитоплазматическая реакция с маркером CD68+ выявила 2,7 ± 1,5 макрофагов, локализованных в верхних отделах дермы либо в области волосяных фолликулов. При этом ИГХреакция с маркером CD138 во всех наблюдениях в очагах неповрежденной кожи негативная, как в клеточных элементах, так и в стромальном компоненте. Очаговая слабовыраженная позитивная цитоплазматическая экспрессия обнаружена в клетках МПЭ. Межгрупповые отличия репаративных процессов определяются уже на 3-и сут эксперимента. При анализе ИГХ-реакций во всех фрагментах кожи установлена отрицательная экспрессия Ki-67. Минимальное количество CD68+ клеток (32,50 ± 1,33) визуализируется в ОК Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 1 (64) март’ 2018 34 Еськова А.Ю., Дыдыкин С.С., Голубинская Е.П. и др. группе, что в комплексе с данными гистологического исследования (прогрессия некробиотических процессов в окружающие ткани с формированием микроабсцессов в жировой клетчатке и мышечных волокнах, лейкоцитарно-макрофагальное соотношение - 2 : 1) отражает продолжающуюся интенсификацию воспалительной фазы регенераторного процесса, возможно, за счет бактериальной контаминации раневой поверхности. Морфологические проявления заживления ожоговых ран в остальных экспериментальных группах характеризуются наличием плотного струпа на поверхности раны, спаянного с подлежащими тканями (особенно в коже крыс группы ОФ1) и начальными признаками пролиферативной активности клеток базального и мальпигиевого слоев в прилегающем краевом эпидермисе (1,40 ± 0,16, p < 0,05). Важной особенностью кожи крыс данной группы является гомогенизация образующихся коллагеновых волокон в области раневого канала, которые выглядят утолщенными и более эозинофильными (рис. 1). Рис. 1. Группа ОФ1. Дерма кожи. 3-и сут. Цитоплазматическая экспрессия CD68 в макрофагах воспалительного инфильтрата. Визуализация в системе Envision. Ув. 400. ИГХ В большинстве наблюдений групп ОФ2 и ОМ струп очагами истончен, либо происходит его десквамация с поверхности, а под него подрастает краевой эпителий. Экспрессия Ki-67 в данных группах статистически значимо выше не только по отношению к контролю, но и к группам ОС и ОМ (1,10 ± 0,14, p < 0,05). Лейкоцитарномакрофагальное соотношение - 1 : 2. Максимальное количество CD68+ макрофагов выявлено в группе ОФ1 (42,40 ± 0,92), однако было сопоставимо с аналогичными показателями других экспериментальных групп. Увеличение числа клеток гистиоцитарного происхождения на фоне пролиферативной активности герминативного слоя МПЭ свидетельствует об интенсификации процессов очищения в раневом канале и последовательной смене экссудативной фазы заживления на пролиферативную, характеризующуюся заполнением раневого дефекта грануляционной тканью. Кроме того, возрастающая интенсивность стромальной экспрессии синдекан-1 является следствием воздействия кателицина активированных лейкоцитов, повидимому, в рамках механизма обратной связи на дермальные фибробласты для активации многочисленных факторов роста (в том числе фактора роста эндотелия сосудов и эпидермального фактора роста). Помимо экспрессии клетками фибробластического ряда, CD138 маркер может проявлять цитоплазматическую («dott-like») экспрессиюу клеток гистиоцитарного происхождения, вследствие повышения синдекан-1-активности также для ремоделирования внеклеточного матрикса [15, 16]. Эти данные подтверждены в ходенашего исследования. Однако, поскольку эти клетки не могли быть точно идентифицированы как макрофаги или какие-либо другие клеточные элементы с достаточным уровнем достоверности, математический анализ этих данных не проводили. Важно подчеркнуть, что существенных межгрупповых отличий интенсивности экспрессии синдекан-1 клетками стромы, эндотелия и макрофагальными элементами в наших исследованиях не выявлено ни в одном из сроков наблюдений. Пятые сутки после начала эксперимента характеризуются снижением воспалительной инфильтрации во всех наблюдениях и повышением пролиферативной активности эпителиоцитов с увеличением площади новообразованного МПЭ за счет разрастания его к центру ожоговых ран. Струп, покрывающий раневую поверхность, истончается с очаговым отделением от сформированной грануляционной ткани. Поверхность кожи мышей группы ОФ1 все еще покрыта плотным эозинофильным конгломератом с немногочисленными «замурованными» в нем лейкоцитами. Лейкоцитарно-макрофагальное соотношение - 2 : 2. Показатели пролиферативной активности по-прежнему остаются на высоком уровне (1,9 ± 0,3), в то же время количествоCD68+ макрофагов практически неизменно в сравнении с предыдущим сроком наблюдений ((38,7 ± 1,6) позитивно окрашенных клеток). Помимо увеличения числа клеток гистиоцитарного происхождения, в воспалительном инфильтрате отмечается появление (0,9 ± 0,2) клеток мембранно-экспрессирующих CD138 маркер плазмоцитов, что в сравнении с другими экспериментальными группами может иметь двойственную интерпретацию. С одной стороны, № 1 (64) март’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Экспериментальная хирургия 35 достоверно низкий показатель плазмоцитарной активности может свидетельствовать о минимальной антигенной нагрузке, в том числе инфицированности раневой поверхности, а с другой - может являться показателем недостаточности гуморального иммунного ответа за счет нарушения сосудистой проницаемости вследствие ремоделирования и гомогенизации грануляционной ткани и компонентов базальных мембран вновь образованных сосудов. Учитывая увеличение пула полиморфноядерных лейкоцитов, наличие слабовыраженной экспрессии CD138 является показателем негативного патоморфоза регенераторных процессов в исследуемых участках. Наиболее выраженная позитивная динамика репаративных процессов наблюдается в группах ОФ2 и ОС, что подтверждено данными ИГХ исследования. Так, показатели эпителизации раневой поверхности имеют тенденцию к росту с максимальными значениями на 7-е сут исследования - 3,8 ± 0,3 и 3,5 ± 1,3 соответственно (рис. 2). Рис. 2. Группа ОФ2 с местной аппликацией МТГ0,03%. 7-е сут. Эпидермис и дерма кожи. Экспрессия Ki-67. Визуализация в системе Envision. Ув. 400. ИГХ Количество CD68+ макрофагов также динамически уменьшается (почти в 2 раза) в сравнении с предыдущим сроком наблюдений и составляет 19,9 ± 1,8 в ОС и 21,3 ± 1,8 в ОФ2 группах на 5-е сут эксперимента и 10,0 ± 1,5 и 11,1 ± 0,6 (p < 0,05) соответственно на 10-е сут. Уровень статистической значимости различий количества позитивно окрашенных гистиоцитов в ОМ группе не отличается от данных экспериментальных групп и составляет 24,2 ± 1,5 клеток на 5-й день и 13,3 ± 1,8 - на 10-й. Клетки с позитивной мембранной экспрессией синдекан-1 локализуются преимущественно в периваскулярных пространствах в виде единичных элементов без тенденции к формированию клеточных агрегатов, что также свидетельствует об их миграционной активности либо в ответ на слабое антигенное воздействие экспериментальных средств, либо о хемотаксисе клеток-памяти гуморального иммунитета в ответ на проникновение немногочисленных микробных агентов. При изучении кожи крыс на 10-е сут эксперимента в группах ОФ2, ОС и ОМ отмечено завершение репаративных процессов в виде сформированного соединительнотканного рубца с полной эпителизацией раневой поверхности (рис. 3). МПЭ с наличием очаговых акантотических выростов и единичными интраэпителиальными и субэпителиальными скоплениями CD68+ клеток. Рис. 3. ОК группа. 10-е сут. Дерма кожи. Мембранная экспрессия CD138 в плазмоцитах воспалительного инфильтрата. Цитоплазматическая экспрессия синдекан-1 в макрофагах. Стойкая стромальная экспрессия синдекан-1 в соединительнотканном компоненте и эндотелии сосудов Визуализация в системе Envision. Ув. 400. ИГХ Следует отметить, что в группе ОК в указанные сроки начинаются процессы активной пролиферации эпидермоцитов с одновременным отделением истонченного эозинофильного струпа. Лейкоцитарно-макрофагальное соотношение изменяется и составляет 1 : 2 со значительным превалированием в воспалительном инфильтрате гистиоцитарных клеток, что характеризует процесс активного очищения ожоговой раны. В группе с использованием в качестве местной терапии МТГ 0,1% наблюдается превалирование экссудативных процессов и вторичной альтерации, по-видимому, связанное со значительным уплотнением соединительнотканного компонента, нарушением сосудистой проницаемости. Гомогенизация и уплотнение струпа приводит к нарушению аэрации раны, накоплению отечной жидкости, усугублению некротических изменений и изъязвлению раневой поверхности с последующей вторичной бактериальной контаминацией. Иммуногистохимически пролиферативная активность эпидермоцитов Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 1 (64) март’ 2018 36 Еськова А.Ю., Дыдыкин С.С., Голубинская Е.П. и др. остается достаточно высокой - (2,3 ± 0,2). Лейкоцитарномакрофагальное соотношение 1,5 : 1 на фоне уменьшения количества клеток, экспрессирующих маркер CD68 (25,7 ± 2,9) и увеличения содержания CD138+ клеток в воспалительном инфильтрате до 6,9 ± 0,4. Стабильное повышение числа иммунофенотипически идентифицированных клеток плазмоцитарного происхождения определяется в кожи крыс контрольной группы без применения местной терапии (7,2 ± 0,6) и свидетельствует, понашему мнению, о пролонгации репаративных процессов вследствие выраженности специфического иммунного ответа на воздействие флогогенных факторов биологической природы. Количество клеток, экспрессирующих CD68, при этом прогрессивно уменьшается до 16,9 ± 1,3, гистологически отмечается превалирование процессов ремоделирования грануляционной ткани. Оценка ИГХ реакций на 21-е сут после начала эксперимента свидетельствует о полном завершении регенераторных процессов во всех исследуемых группах с небольшой вариабельностью пострегенераторных изменений. Так, в группах ОФ2, ОС и ОМ определяется наличие соединительнотканного рубца, покрытого многослойным плоским эпителием с явлениями гипери паракератоза и четким послойным распределением базального, шиповатого, зернистого и кератинового слоев. В толще рубцовой ткани определяется большое количество сформированных волосяных фолликулов и формирующихся сальных желез. Однако, если заживление происходит через нагноение (в группах ОК и ОФ1), в области рубца определяются очаговые круглоклеточные инфильтраты в виде лимфоидных фолликулов с единичными мембранно-окрашенными плазмоцитами (2,1 ± 0,3 и 1,9 ± 0,1 соответственно, р < 0,05). Кроме того, в указанных группах отмечается наличие позитивно окрашенных макрофагов в виде очагов интраэпителиальной и субэпителиальной инфильтрации в области рубцово измененных тканей, что также является показателем незавершенности регенераторных процессов (рис. 4). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное гистологическое и ИГХ исследование кожи крыс с маркерами Ki-67, CD68 и CD138 в процессе заживления ожоговых ран позволило установить морфогенетические характеристики регенерации, динамически изменяющиеся в зависимости от вида местной терапии. Интенсификация процессов очищения раневой поверхности происходит в группе с местной Рис. 4. 21-е сутки. Эпидермис и дерма кожи. РФ1 группа с местной аппликацией мази МТГ0, 1%. Экспрессия CD68. Визуализация в системе Envision. Ув. 400. ИГХ аппликацией фитомази с МТГ в концентрации 0,03% (пиковые значения на 3-и сут CD68+ 42,1 ± 0,3, р < 0,05), вследствие чего происходит повышение реактивности стромального компонента с последующим ускоренным формированием и ремоделированием соединительнотканного рубца (диффузная стромальная и цитоплазматическая реакция маркера синдекан1/ CD138 при негативной мембранной экспрессии) и полной эпителизацией уже к 10-м сут эксперимента (Ki67+-3,3 ± 0,3, р < 0,05). Использование МТГ 0,1% оправдано в первые трое суток для профилактики вторичной бактериальной контаминации раневой поверхности (в качестве биологически интактногосредства закрытия очага повреждения). Последующее его применение в качестве местной терапии ожоговых ран приводит к активации процессов вторичной альтерации (нарастающей гомогенизации межклеточного вещества, включая, по-видимому, компоненты базальных мембран микроциркуляторного русла), прогрессирующему динамическому нарушению сосудистой проницаемости и, как следствие, изменению взаимодействия клеточных и неклеточных элементов системы местного иммунитета как специфического, так и неспецифического. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Исследования выполнены в рамках научного проекта № 17-415-92011, поддержанного Советом министров Республики Крым и РФФИ, по теме «Патогенетические механизмы реэпителизации и ремоделирования ожоговых ран и оптимизация процессов репарации посредством потенцирования противовоспалительных эффектов наночастиц серебра и апротинина», код конкурса «р_а». № 1 (64) март’2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии

Скачать электронную версию публикации