DEVELOPMENT OF THE LYMPHATIC SYSTEM IN NATURALLY-HISTORICAL ASPECT. PART 1.pdf ВВЕДЕНИЕ Знания о развития лимфатической системы, в том числе о молекулярных механизмах, лежащих в основе ее формации и морфогенеза, а также о причинах появления в процессе фило- и онтоге- неза чрезвычайно необходимы для понимания происхождения различных врожденных заболева- ний лимфатической системы, например синдрома дистихиаза-лимфедемы или болезни Nonne- Milroy. В статье представлены современные дан- ные о развитии лимфатической системы в естест- венно-историческом аспекте, т.е. с точки зрения фило- и онтогенеза у животных и человека. Лимфатическая система человека представ- ляет собой сеть сосудов (начинающихся слепо из межклеточных пространств), идущих парал- лельно с кровеносной системой, и состоит из инициальных лимфатических капилляров, соби- рательных сосудов или коллекторов, а также из лимфатических узлов и лимфоидных органов [1]. Инициальные лимфатические капилляры («корни лимфатической системы») - открытые и начи- наются в межклеточных пространствах, они помогают поддерживать тканевой гомеостаз и выполняют абсорптивную функцию [1, 2]. Со- бирательные сосуды, или коллекторы, выполняют транспортную функцию для лимфы, образую- щейся в инициальных сосудах: у человека без лимфатической системы ежедневно во внесосуди- стых компартментах задерживалось бы до 12 л жидкости, богатой белками [1]. Также важно отметить роль коллекторов в создании «внутрен- них сил», обеспечивающих продвижение лимфы против градиента гидростатического давления. На активный транспорт лимфы приходится две трети всей работы лимфатической системы по ее продвижению, оставшаяся треть работы выполняется пассивно с помощью «внешних сил», в основном мышечной помпы [3]. Меха- низмы продвижения лимфы по коллекторам лимфатической системы в кровяное русло пред- ставляют собой малоизученную сферу современ- ной лимфологии, однако доказана важная роль в этом механизме таких факторов, как преднагруз- ка (конечно-диастолическое давление в лимфан- гионе; аналогия закона Франка-Старлинга в сер- дечно-сосудистой системе) [1, 4, 5], постнагрузка (выходное давление в области выхода из лим- фангиона) [1, 6], частота и сила сокращений лимфангионов [1, 7], нейрогенное влияние веге- тативной нервной системы на моторику лимфати- ческих сосудов [8] и обеспечение синхронности их сократительной активности [9]. Лимфатические узлы и лимфоидные органы выполняют иммунную функцию через накопле- ние и презентацию антигенов иммунокомпе- тентным клеткам [1]. Имеются некоторые дока- зательства влияния гладкой мускулатуры капсулы лимфатических узлов на продвижение лимфы против градиента гидростатического давления в лимфатическом русле [10] (рис. 1). Лимфатическая система выполняет следую- щие функции [10]: 1) возвращение компонентов плазмы (в ос- новном, альбуминов) в систему циркуляции крови; 2) транспорт воды, нутриентов (хиломикро- нов) и электролитов из желудочно-кишечного тракта; 3) транспорт биологически активных аген- тов, таких как гормоны (кортизол, инсулин, ти- роксин, ренин, щелочная фосфатаза) и ферменты; 4) элиминация макромолекул из внесосуди- стых компартментов (гиалуроновая кислота, бактерии, колллоиды для идентификации сто- рожевых лимфоузлов и др.); 5) накопление и презентация антигенов в лимфатических узлах иммунокомпетентным клеткам (лимфоцитам) через систему хемокинов и других сигнальных молекул; 6) секреция вазоактивных веществ (NO, про- стагландины) лимфатическими эндотелиальными клетками. 58 Дудников А.В., Байтингер В.Ф., Курочкина О.С. № 3 (66) сентябрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии Рис. 1. Схема механизмов, создающих силу движения лимфы против градиента гидростатического давления Таким образом, лимфатическая система представляет собой частично обособленную систему, выполняющую важную для организма функцию сохранения «экологии внутренней среды». В настоящее время формация и морфогенез лимфатической системы изучается на нескольких биологических моделях. Возникновение ее зачат- ков, а также влияние регуляторных генов иссле- дуется на эмбрионах Шпорцевых лягушек (Xenopus) [11]. Кроме того, большое количество исследований проводится на рыбках рода Данио (Zebrafish), поскольку они имеют хорошо выра- женную лимфатическую систему со всеми мор- фологическими, молекулярными и функциональ- ными особенностями, напоминающими таковые у других позвоночных [12, 13]. Лимфатическая система Zebrafish экспрессирует известные мар- керы, определяющие развитие эндотелиальных клеток по «лимфатическому» пути, а также на- боры генов, необходимых для лимфангиогенеза. Важным недавним открытием стала способность Zebrafish накапливать и транспортировать по своей лимфатической системе подкожно введен- ные красители (как и у других позвоночных [11, 14]), что позволило проводить генетические исследования, наблюдая за сосудистым руслом Zebrafish in vivo. Другой великолепной экспери- ментальной моделью формации и морфогенеза лимфатической системы являются мыши. ПРЕНАТАЛЬНЫЙ ОНТОГЕНЕЗ ЛИМФАТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ У ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ Процесс закладки и развития лимфатической системы у мышей и Zebrafish во многом схож, несмотря на разные эволюционные уровни. У мышей первые стадии развития сосудистой сис- темы начинаются с параллельно идущего спру- тинга (от англ. sprout - распространяться) сосудов от дорзальной аорты (dorsal aorta) и кардиналь- ной вены (cardinal vein) на стадии E8 (эмбрио- нальные стадии по Carnegie) (рис. 2) [15]. У Zebrafish этот процесс немного разделен во времени, с началом спрутинга артериальных эндотелиальных клеток из дорзальной аорты на стадии 20 hpf (hours post fertilization, часов после фертилизации) и спрутинга венозных эндоте- лиальных клеток на стадии 30 hpf [16]. Ранний период развития лимфатической системы может быть разделен на два этапа: 1-й - спецификация клеток для дальнейшего их развития по лимфатическому пути, 2-й - спру- тинг предшественников лимфатических эндо- телиальных клеток (lymphatic endothelial cells, LECs) для формирования лимфатических меш- ков. Последние литературные данные подтвер- ждают, что и у мышей, и у Zebrafish оба этих процесса происходят в одну и ту же стадию пренатального онтогенеза - в стадию Е9.5 по Carnegie у мышей и около 24-36 hpf - у Zebrafish. В этот период впервые появляются Prox1- позитивные клетки на разных участках карди- нальной вены и знаменуют начало специфика- ции LEC [17-19]. У мышей межсегментарные (интерсомит- ные) вены представляют собой дополнитель- ный источник лимфатических эндотелиальных клеток [20]. Рис. 2. Схема сосудистой системы эмбриона. Common cardinal vein - общая кардинальная вена; Interior cardinal vein - передняя кардинальная ве- на; posterior cardinal vein - задняя кардинальная вена; Dorsal aorta - дорзальная аорта Обзоры 59 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3 (66) сентябрь’ 2018 Рис. 3. Схематическая модель раннего онтогенеза лимфатической системы у рыбок Данио (а) и мышей (б) [2]. В обоих случаях кардинальная вена (CV) является источником клеток, которые в дальнейшем будут специализироваться как клетки лимфатического русла (зеленый цвет). Далее они преобразуются в парахордальные клетки в случаях Zebrafish либо в лимфатические мешки у мышей. В случае последних, лимфатические эндотелиальные клетки (LECs) также могут происходить из межсегментарных сосудов (б, изображение посередине). В случае Zebrafish предшественники LEC происходят из субполяции специализированных ангиобластов (желтый цвет) в области задней кардинальной вены (PCV) Следуя по пути спецификации в лимфатиче- ские эндотелиальные клетки, Prox1-позитивные LEC отпочковываются от кардинальной вены для формирования примитивных лимфатических мешков. Таким же образом, т.е. примерно на стадии 36 hpf, у Zebrafish лимфатические пред- шественники отпочковываются от кардинальной вены в сторону горизонтальной мышечной пе- регородки для образования парахордальных кле- ток (parachordal cells, PACs), являющихся цепоч- кой поверхностно расположенных продолгова- тых клеток, рассматриваемых в настоящее время как эквиваленты первичных лимфатических мешков у млекопитающих [12, 16, 17] (рис. 3). МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ, ЛЕЖАЩИЕ В ОСНОВЕ ПРОЦЕССОВ ЗАКЛАДКИ И РАЗВИТИЯ ЛИМФАТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ У ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ Несмотря на важность первичных артерий и вен как первоначальных источников для фор- мирования лимфатической системы, им по- священо относительно небольшое количество исследований. Причина тому - большая техни- ческая сложность наблюдать их in vivo. Тем не менее, обнаружение транскрипционных фак- торов и маркеров, относящихся к эндотелию лимфатических сосудов, позволило значитель- но продвинуться в сфере изучения процессов происхождения лимфатической системы. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ КОНТРОЛЬ СПЕЦИФИКАЦИИ ЛИМФАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Процесс специализации лимфатических клеток требует четкой пространственно-временной координации экспрессии тех или иных генов (рис. 4). С помощью исследований, обеспечивающих нокаут (knockout, КО) и нокдаун (knockdown, KD) определенных генов у мышей и Zebrafish, были выявлены некоторые ключевые транс- Рис. 4. Сигнальные пути и молекулярные механизмы контроля лимфатической спецификации и спрутинга лимфатических сосудов [2]. Prox1 - ключевой транскрипционный фактор в эмбриологии лимфатической системы (а). Его экспрессия регулируется транскрипционными факторами Sox18 и Coup-TFII, а также косвенно - Wnt5b или Bmp2b. Сигнальный путь Notch - негативный регулятор спецификации LEC. В даль- нейшем, после спецификации LEC, эти лимфатические эндотелиальные клетки мигрируют в соответствии с Vegfc и в зависимости от уровня Vegfr3 (б). Роль Notch сигнального пути остается неясной а б а б 60 Дудников А.В., Байтингер В.Ф., Курочкина О.С. № 3 (66) сентябрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии крипционные факторы, которые определяют «судьбу» клеток для их спецификации по пути LEC. Prox1 (prospero-related homeobox gene 1) - первый обнаруженный ген, непосредственно влияющий на спецификацию LEC и опреде- ляющий ее правильное развитие. У Prox1- нокаутированных мышей определялось недо- статочное количество лимфатических мешков и лимфатических сосудов [19]. Такие мыши умирали вскоре после рождения из-за множест- венных дефектов развития. В исследованиях, в которых нокаут гена осуществлялся только в эндотелиальных клетках, также наблюдались дефекты развития лимфатической системы и высокая постнатальная смертность [21]. В свою очередь, гиперэкспрессия гена Prox1 проявля- лась в достаточном уровне специализации LEC как in vitro [22], так и in vivo [23]. В мышиных эмбрионах экспрессия Prox1 проявляется в виде ограниченной популяции эндотелиальных клеток в области кардинальной вены на стадии E9.5 [19, 24]. Хотя большинство Prox1- позитивных эндотелиальных клеток отпочко- вывается от кардинальной вены для того, чтобы дать рост примитивным лимфатическим мешкам, небольшая их популяция остается в кардиналь- ной вене для формирования лимфовенозных клапанов [25]. У Zebrafish экспрессия Prox1a - одного из ортологов (генов, имеющих общего предка и выполняющих схожую функцию) гена Prox1 у млекопитающих - обнаруживается в перед- ней кардинальной вене на стадии 22-24 hpf [18] и в более дорзальных позициях на стадии около 30 hpf [17]. Prox1а - позитивные клетки в дальнейшем делятся и отпочковываются для формирования парахордальных клеток (PACs), будущих строительных блоков лимфатической системы рыб [12, 26, 27]. Нокдаун гена Prox1a (с использованием ATG антисмысловых мор- фолино-олигонуклеотидов) приводит к сни- жению количества парахордальных клеток и дефектам грудного протока [12]. Эмбрионы Zebrafish также экспрессируют Prox1b - еще один ортолог гена Prox1 млекопитающих, од- нако его роль остается спорной. Некоторые исследователи утверждают, что этот ген на- блюдается в матричной РНК эндотелиальных клеток задней кардинальной вены на стадии около 48 hpf и ответственен за венозный спру- тинг [28]. Вдобавок к гену Prox1, еще до его появления на стадии E9.5, в дорзолатеральной субпопуля- ции эндотелиальных клеток в передней карди- нальной вене обнаруживается транскрипцион- ный фактор Sox18 [29]. Ген Sox18 индуцирует экспрессию Prox1 в этой же субпопуляции венозных эндотелиальных клеток [30, 31]. Потеря этого гена у некоторых линий мышей приводит к тотальному отеку подкожно-жировой клетчат- ки, что подчеркивает его роль в формировании лимфатической системы [29]. У Zebrafish ген Sox18 можно обнаружить на всем протяжении кардинальной вены, а также в дорзальной аорте [32, 33]. Дополнительный транскрипционный фак- тор, необходимый для лимфатической специ- фикации эндотелиальных клеток - COUP transcription factor 2 (COUP-TFII), также известный как Nr2f2. COUP-TFII, который впервые экс- прессируется в кардинальной вене мышиных эмбрионов на стадии Е8.5; показал свою спо- собность индуцировать развитие клеток по «венозному» пути, ингибируя путь «артери- альный» [34]. Ролью этого гена является под- держание экспрессии Prox1 на самых ранних стадиях спецификации и дифференциации LEC [25, 35]. ВНЕШНИЕ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СПЕЦИФИКАЦИЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПО ЛИМФАТИЧЕСКОМУ ПУТИ В то время как внутренний каскад реакций (транскрипционный контроль), определяющий спецификацию субпопуляции эндотелиальных клеток кардинальной вены по пути LEC, доста- точно хорошо изучен, информации об экзоген- ных влияниях на этот процесс довольно мало. К настоящему времени в нескольких исследова- ниях доказано экзогенное влияние на этот про- цесс костного морфогенного протеина (bone morphogenic protein, BMP), сигнальных путей Wnt, Notch и васкулярного эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) (см. рис. 3). Как и для многих других процессов специ- фикации в период эмбриогенеза [36, 37], BMP и Wnt вовлечены в процессы спецификации лимфатической. Члены семейства белков BMP в экспериментах in vivo показали себя как репрес- соры формирования лимфатической системы [38-40]. У Zebrafish повышение регуляции бел- ком Bmp2b на стадии 25-26 hpf индуцирует эктопический венозный спрутинг, в то время как искусственная экспрессия Noggin3, естест- венного эндогенного ингибитора BMP сиг- нального пути, приводила в конечном итоге к нарушению формирования каудального веноз- ного сплетения [41]. Также интересными яв- ляются последние открытия, указывающие на индукцию белком Bmp2b венозной дифферен- циации через активацию вышеуказанного пути B-catenin/Coup-TFII [42]. Обзоры 61 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии № 3 (66) сентябрь’ 2018 Вдобавок к своей роли мощного индуктора спецификации клеток по «венозному» пути, Bmp2b оказывает негативную модуляцию на спецификацию по «лимфатическому» пути у Zebrafish путем ингибирования экспрессии Prox1a [38]. В свою очередь, гиперрегуляция Bmp2b у Zebrafish приводит к снижению экс- прессии Prox1a в определенных субпопуляциях эндотелиальных клеток, что свидетельствует, по нашему мнению, об очевидно негативном влия- нии Bmp2b на спецификацию LEC. Несмотря на то, что эти данные были получены учеными на более поздних стадиях развития Zebrafish, позд- нее чем общепринятые рамки спецификации LEC (22-36 hpf) [17, 18], они могут свидетель- ствовать только о более негативном влиянии Bmp2b на поддержание спецификации LEC и, в меньшей степени, - на индукцию этой специ- фикации. Вместе с тем, в ряде исследований, в проти- вовес вышеописанной модели у Zebrafish, семей- ству белков BMP отводят совершенно противо- положную роль [43]. Используя методику нок- дауна гена, приводящую к снижению регуляции белков Bmp2a, Bmp2b, Bmpr1aa, Bmpr1ab и Smad5 - естественного медиатора BMP- сигнального пути, - исследователи обнаружили грубые дефекты лимфатической системы (агене- зия различных участков), природу которых объ- яснить пока не представляется возможным. Роль BMP-сигнального пути была также проанализирована у мышей, в результате чего было определена негативная роль Bmp9 (фено- тип, аналогичный Bmp2b у Zebrafish) на разви- тие лимфатической системы [39, 40]. Нокаут гена Bmp9 приводил к расширению дермаль- ных лимфатических сосудов на стадии развития E15.5, вызванному избыточной повышенной пролиферацией LEC [40]. К тому же у ново- рожденных мышей с нокаутированным геном Bmp9 наблюдалось повышение числа LEC в брыжейке кишечника, приводящее к увеличе- нию в размерах коллекторных лимфатических сосудов [39]. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ВЕНОЗНЫЙ СПРУТИНГ И КЛЕТОЧНУЮ МИГРАЦИЮ За спецификацией LEC всегда следует их миграция в соответствие с градиентом белка Vegfc [44]. Соответственно, у мышей и Zebrafish с дефицитом белка Vegfc часто наблюдают- ся гипоплазия лимфатических сосудов и лимфе- дема [12, 13, 44-46]. Vegfr3 (также известный, как Flt4) [47] - основной рецептор для Vegfc, и его активация обеспечивает пролиферацию LEC, их миграцию и выживание [48]. Во время процесса всего эмбрионального развития Vegfr3 экспрессируется артериальными, веноз- ными и лимфатическими эндотелиальными клетками как у мышей [47, 49], так и у Zebrafish [50-52], что крайне важно для ремоделирова- ния всей сосудистой системы [53]. Мыши, у которых наблюдается дефицит функционального Vegfr3, умирают на стадии E10,5 эмбрионального развития, еще до появ- ления первых лимфатических сосудов [53], в то время как гетерозиготы по гену Vegfr3 выжи- вают, но страдают от грубых дефектов развития лимфатической системы (агенезия участков) [54]. У Zebrafish мутации в гене Vegfr3 приводят к изолированным дефектам лимфатической системы, без влияния на спрутинг артерий и вен [55]. Последние исследования также под- тверждают наличие ранее предположенной положительной обратной связи между уровнем Vegfr3 и Prox1 [56]. Согласно этим данным, Vegfc-сигнальный путь оказывает влияние на количество предшественников LEC в задней кардинальной вене у эмбрионов Zebrafish [17]. Вдобавок к уже определенной роли Vegfc в процессе спрутинга LEC, этот сигнальный путь оказывает влияние на уровень Mafba - транс- крипционного фактора, участвующего в разви- тии лимфатической системы у Zebrafish [57]. Кроме того, указывается на влияние Mafba на миграцию LEC и их дальнейший спрутинг из задней кардинальной вены [57]. Mafba также важен в спрутинге LEC у мышей [58]. Активность Vegfc регулируется белком Ccbe1 (collagen and calcium binding EGF domains 1), необходимым для правильного развития лимфа- тической системы, как у Zebrafish [26], так и у мышей [59]. Мутации белка CCBE1 у людей приводили к первичной генерализованной дис- плазии лимфатических сосудов [60], что подчер- кивает эволюционную связь между разными видами позвоночных в развитии лимфатиче- ской системы. У мышей Ccbe1 модулирует ак- тивность Vegfc через связь Ccbe1 c экстрацел- люлярным матриксом (Extracellular matrix, ECM) [59]. ECM-связанный Ccbe1 усиливает процессинг Vegfc, трансформируя его с длинно- цепочного Vegfc в другую, крайне активную форму. Значение Notch-сигнального пути в спру- тинге LEC также изучалось последние годы. С одной стороны, супрессия Notch-пути его специфическим лигандом Delta-like 4 (Dll4-fc) индуцировала спрутинг LEC in vitro и in vivo [61]. Более того, у Notch1-нокаутированных мышей наблюдался усиленный спрутинг LEC и расширенные лимфатические сосуды [62]. С другой стороны, блокировка Notch1/Dll4-пути 62 Дудников А.В., Байтингер В.Ф., Курочкина О.С. № 3 (66) сентябрь’ 2018 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии с помощью специальных антител в период пост- натального лимфангиогенеза у мышей приводила к снижению плотности лимфатических сосудов [63]. Аналогично, нокдаун Dll4 или его рецеп- торов Notch1b и Notch6 у Zebrafish, а также бло- кировка этих рецепторов фармакологическими агентами, приводили к снижению числа пара- хордальных клеток (PAC) - прообраза лимфати- ческой системы у позвоночных [64]. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Скачать электронную версию публикации