MORPHOLOGICAL RESULTS OF IMPLANTATION OF POLYHYDROXYALKANOATE IN THE FORM OF ULTRATHIN FIBERS WITH ADSORBED MULTIPOTENT .pdf ВВЕДЕНИЕ Исследователи, синтезировавшие полимеры на основе полигидроксиалканоатов (ПГА), сообщают об их биосовместимости и легкой деградации в организме в сочетании с термопластичностью и высокой механической прочностью. В последние годы собрана обширная экспериментальная библиотека, показывающая указанные ценные характеристики ПГА [1-6]. Полимеры этого класса не деградируют в водных средах и имеют очень низкую (месяцы и годы) кинетику биоразрушения. На фоне этого деградация ПГА в биологических жидкостях не приводит к изменению активных реакций среды [1], что позволяет применять ПГА в качестве носителя-скаффолда для живых клеток [5]. Такие Экспериментальная хирургия / Experimental surgery 37 Issues of Reconstructive and Plastic Surgery No. 2 (69) June’ 2019 материалы могут использоваться в качестве матриксов для депонирования, адресной доставки и контролируемого высвобождения в течение длительного времени разнообразных лекарственных препаратов, пестицидов и т.п., в частности, некоторых противоопухолевых средств [7, 8]. ПГА можно применять как матрицы для доставки в ткани мультипотентных стромальных клеток (МСК) [9-12]. Проведены исследования с использованием световой микроскопии, окрашивания живых клеток трипановым синим, оценки синтеза ДНК и белка клетками в культуре и в ММТ-тесте определения клеточной и лекарственной цитотоксичности (способ, основанный на возможности дегидрогеназ митохондрий преобразовывать водорастворимый бромид 3-(4,5-диметилтиазол- 2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиума (МТТ) в формазан, кристаллизуемый внутри клеточных элементов. В процессе изучения цитотоксичности и биосовместимости ПГА матриксов на клеточных культурах разного происхождения - энтодермального (гепатоциты), мезенхимального (эндотелиоциты и фибробласты) и в первичной культуре остеобластов, полученных при культивировании МСК костномозгового происхождения, было обнаружено, что внешний вид клеточных элементов при непосредственном контакте с поверхностью ПГА в процессе культивирования не отличался от морфологии клеток, прикрепившихся к стеклу или полистиролу. Прямое взаимодействие с поверхностью полимера не ингибировало жизнеспособность клеточных элементов, не супрессировало синтез ДНК и митотическую способность. На основании этого было сделано заключение об отсутствии цитотоксичности полимеров из ПГА и значительной биосовместимости подобных материалов со всеми клеточными культурами. Также в процессе указанных исследований не обнаружено различий биологических эффектов между полигидроксибутиратом и сополимерных объектов из полигидроксибутирата/полигидроксивалериата [13]. Ранее в процессе культивирования хондроцитов было отмечено, что смеси ПГА (полигидпрксибутират-Согидроксигексаноат/полигидроксибутират), относительно монополигидроксибутирата, более оптимальны для клеточного культивирования [14]. Установлено, что ПГА способствуют пролиферации и дифференцированию МСК, в частности, в нейрональные клеточные элементы при повреждениях центральной нервной системы [15]. Кроме того, ПГА in vitro улучшают рост фибробластов [16]. Имеются отличия поверхностных свойств материалов, сделанных из разных видов ПГА, например, из поли-3-гидроксибутирата и поли-3-гидроксибутирата-Co-3гидроксивалериата, что, кроме всего прочего, может воздействовать на уровень адгезии клеток к поверхности полимеров. Было сделано заключение, что биополимеры для тканевой инженерии могут обладать специфичностью для определенного типов клеточных элементов. Так, поли-3гидроксибутират оптимален для культивирования клеток обонятельного тракта (обкладочные нейро-эпителиальные клетки), а поли-3-гидроксибутират-Co-3-гидроксивалериат - для МСК [10]. На лабораторных животных при проведении острых и хронических экспериментов было установлено, что биоразрушение ПГА связано с его химической структурой, местом внедрения в организм и геометрической формой изделия. Деградация идет медленно, и гуморальным, и клеточным путями, в основном с поверхности полимера, без формирования ограниченных дефектов и быстрого уменьшения прочностных характеристик. В разрушении полимера участвуют макрофаги и образующиеся из них гигантские клетки инородных тел со значительным уровнем кислой фосфатазы, коррелирующей с концентрацией энзима в сыворотке крови животных. Главной мишенью для частиц ПГА является ткань печени, затем - почек и селезенки. Максимально быстрая деградация микрочастиц полимера идет в селезенке и печени. ПГА после синтеза можно использовать до 1 года, эти полимеры не вызывают некротических, воспалительных, склеротических или других нежелательных процессов в рядом расположенных тканях и in vivo не мешают репарации, что особенно важно для остеоимплантатов, эндопротезов, хирургических нитей и т.п. При этом деградация структуры полимера начинает проявляться при длительности эксперимента 12 нед и более [17, 18]. В ходе экспериментального исследования репаративного остеогенеза было установлено, что имплантаты, сделанные на основе полигидроксибутирата, приобретают значительные остеопластические свойства [9]. Вместе с этим, несмотря на результаты по биосовместимости ПГА, представленные разработчиками полимера, нами ранее были опубликованы не менее многочисленные данные об отсутствии биодеградации изделий из этого материала [19-23]. Морфологическими и радиовизиографическими методами изучали процессы регенерации поврежденного участка кости нижней челюсти крыс после применения ПГА (сополимер из 85% полигидроксибутирата и 15% полигидроксивалериата). На фоне использования полимера в течение всех 5 нед наблюдения сохранялось неизменным отверстие в кости, где находился ПГА. Признаков консолидации его с краем дефекта кости ни в одном случае не выявлено. Сам полимер был окружен фиброзной тканью с большим 38 Майбородин И.В., Михеева Т.В., Хоменюк С.В. и др. № 2 (69) июнь’ 2019 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии числом клеточных элементов. Свидетельств деградации искусственного материала на всех сроках эксперимента не обнаружено [19]. Были исследованы процессы регенерации поврежденного хряща коленного сустава крыс после имплантации полигидроксибутирата/полигидроксивалериата. После применения ПГА деструктивные изменения в поврежденных суставах были выражены значительно сильнее, чем при естественном ходе заживления. Ни в одном случае на всех сроках наблюдения ПГА не был обнаружен между суставными поверхностями. Однако иногда ПГА лежал свободно в боковых складках суставной капсулы. Значительно чаще небольшие фрагменты ПГА располагались в мягких тканях вокруг сустава, были инкапсулированы активно пролиферирующей фиброзной тканью и деформированы. Во всех случаях не отмечено явлений макрофагальной и лейкоцитарной реакции на инородное тело и признаков развития гранулематозного воспалительного процесса. Кроме того, отсутствовали свидетельства деградации ПГА [20]. Морфологическими методами изучалась реакция организма крыс через различное время после имплантации материалов из полигидроксибутирата/полигидроксивалериата. Обнаружено, что после имплантации полимера в брюшную полость начинается активный спаечный процесс, приводящий к формированию фиброзных спаек между ПГА и петлями кишечника. Имплантированные пленки из ПГА под кожей и в мышечной ткани инкапсулируются толстой фиброзной капсулой. При имплантации ПГА в состоянии ультратонких волокон во всех тканях образуются гранулемы инородного тела с перифокальным воспалением и склерозом окружающих тканей. В этих гранулемах происходят фрагментирование полимера и фагоцитоз макрофагами с формированием гигантских клеток инородных тел. Сделано заключение, что материалы из ПГА после имплантации в организм вызывают активную и выраженную хроническую гранулематозную воспалительную реакцию и очень медленно разрушаются макрофагами [21-23]. В связи с описанной нами ранее активной воспалительной реакцией, индуцированной присутствием ПГА в организме [21-23], и иммуномодуляторным эффектом клеточной терапии [24-28], которая может ингибировать и даже супрессировать острую [26-28] и хроническую [24, 25, 28] воспалительную реакцию, была определена цель исследования: изучить результаты влияния аутологичных мезенхимальных МСК костномозгового происхождения (АММСККП), адсорбированных на ПГА, на воспалительный процесс, сопровождающий имплантацию этого полимера в эксперименте. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В качестве модели были использованы самцы крыс инбредной линии Wag массой тела 180-200 г Возраст животных - 6 мес. Крысы получены из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск), содержание животных и работу с ними проводили на базе данного вивария. ПГА (сополимер гидроксипроизводных алкановых кислот, состоящий на 85% из полигидроксибутирата и 15% - из гидроксивалериата) в виде ультратонких волокон (авторское название) диаметром 20 мкм был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (г. Красноярск). Фрагменты ПГА размером 1 . 1 см стерилизовали замоченными в забуференном физиологическом растворе для культур клеток в автоклаве при температуре 120 °С, давлении в 1 атмосферу в течение 20 мин. АММСККП получали и культивировали в соответствии с нашими прошлыми работами [29, 30]. Стерильный фрагмент ПГА погружали в суспензию АММСККП на 2 ч для пассивной адсорбции, в связи с тем, что живые клетки, как и клетки перевиваемых клеточных культур, прикрепляются к любому твердому субстрату [31-33]. Область лопатки была выбрана вследствие того, что здесь имеется достаточно выраженная подкожная клетчатка, к которой возможен относительно легкий доступ. Кроме того, впоследствии животное не сможет преждевременно избавиться от швов. Под общим ингаляционным эфирным наркозом, в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом, скальпелем с одноразовым сменным лезвием производили разрез кожи длиной 1,5-2 см на спине животного между лопатками. Тупым способом (сомкнутым зажимом) формировали слепой канал длиной 1,5-2 см над правой лопаткой. В данный канал помещали ПГА, затем ушивали рану непрерывными викриловыми швами и снова обрабатывали кожу спиртом. Воспалительных осложнений в месте послеоперационных швов не обнаружено. В качестве контроля использовали животных с имплантацией ПГА без адсорбции АММСККП. В каждой группе было 12 крыс. Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3 и 4 нед после имплантации. На каждую дату наблюдения отводили по 12 крыс опытной и контрольной групп. Всего использовано 96 крыс. Биоптированный ПГА вместе с окружающими тканями фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм изучали Экспериментальная хирургия / Experimental surgery 39 Issues of Reconstructive and Plastic Surgery No. 2 (69) June’ 2019 при увеличении светового микроскопа Axioimager M1 (Karl Zeiss, Германия) до 1200 раз. Для исследования структурной организации тканей вокруг ПГА проводили измерения изображений, полученных при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, на экране компьютера с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axiovision (Karl Zeiss, Германия). При использовании объектива с увеличением .10 конечная площадь тестового прямоугольника была равна 1 400 000 мкм2 (стороны 1400 . 1000 мкм). С каждого среза проводили 3-5 измерений, с учетом рекомендаций, что для рандомизированного исследования достаточно трех срезов [34]. Дифференцирование кровеносных и лимфатических сосудов осуществляли в соответствии с данными J.R. Head, L.L. Seeling [34]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью прикладной статистической программы MS Excel 7.0 (Microsoft, США), получали среднее арифметическое значение M и стандартное отклонение s. Статистическую значимость различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента. Статистически значимым считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Во все сроки после имплантации ПГА в состоянии ультратонких волокон, полимер был расположен в тканях в месте операции и инкапсулирован тонкой прозрачной полоской ткани. В течение 1-2 нед ПГА в практически неизмененном виде очень легко извлекался из окружающих тканей, а последующие сроки материал был более прочно связан с ними (рис. 1). При попытке пассивной адсорбции АММСККП на ПГА имелись сомнения в результативности указанной процедуры. Несмотря на данные литературы, что культивируемые клетки из взвеси прикрепляются к любому твердому субстрату [31-33], а МСК очень хорошо взаимодействуют с ПГА [9-13, 15], в этом эксперименте создалось впечатление об отсутствии прикрепления АММСККП при пассивном сокультивировании с ПГА к его поверхности или крайне слабой адгезии к ней. При извлечении полимера из взвеси перед имплантацией клетки просто стекали по его поверхности вместе с культуральной средой. Но так как существует вероятность прикрепления отдельных клеточных элементов [9-16] или даже детрита с микросомальными фракциями АММСККП к ПГА, было принято решение о проведении данного эксперимента. Рис. 1. Результаты имплантации ПГА в подкожную клетчатку крысы: макропрепарат. Через 1 нед после операции ПГА расположен в месте имплантации и окружен тонким слоем соединительной ткани (стрелка) Fig. 1. Results of PHA implantation into rat subcutaneous tissue: gross specimen. One week after the implantation, PHA is located at the implantation site and surrounded by a thin layer of connective tissue (arrow) Только в течение первых 2 нед вокруг ПГА можно было обнаружить некое подобие обрывков капсулы из плотной волокнистой соединительной ткани с высоким содержанием лейкоцитов и эритроцитов (рис. 2, а, б). На отдельных участках препаратов визуализировалось большое количество нейтрофилов и грануляционных сосудов, и структуры рыхлой волокнистой или неоформленной соединительной ткани вокруг ПГА напоминали капсулу, формирующуюся вокруг абсцессов. Все перечисленное свидетельствует об очень высокой активности острого воспалительного процесса, значительной чужеродности имплантируемого материала или приобретении антигенных свойств собственными тканями организма при контакте с ПГА. Активность воспаления вокруг полимера не зависела от попытки адсорбции АММСККП на ПГА. Практически во всех наблюдениях, даже спустя 1 нед после операции, непосредственно между волокнами ПГА и в тканях рядом с полимером присутствовали гигантские клетки инородных тел. Частота обнаружения и размеры слившихся многоядерных макрофагов также не зависели от предварительного контакта полимера с АММСККП. Начиная с 3-й нед интенсивность воспаления несколько снижалась, воспалительная реакция сосредоточена в основном вокруг имплантированных волокон ПГА. Однако капсула вокруг имплантированного полимера так и не была сформирована. Весь полимер с окружающими 40 Майбородин И.В., Михеева Т.В., Хоменюк С.В. и др. № 2 (69) июнь’ 2019 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии тканями представлял собой обширную гранулему, расположенную в подкожно-жировой клетчатке. В подобных гранулемах была очень высокой лейкоцитарная инфильтрация, причем в цитограмме лейкоцитов даже на 3-4-й нед преобладали нейтрофилы и лимфоциты (рис. 3, а, б, 4). а б Рис. 2. Результаты имплантации ПГА в подкожную клетчатку крысы: а - через 1 нед после имплантации ПГА без АММСККП в подкожной клетчатке расположены фрагменты капсулы из плотной волокнистой соединительной ткани с гранулемами (стрелки), формирующимися вокруг волокон полимера, глубже расположены мышечные волокна; б - обширные гранулемы формируются в подкожной клетчатке на 1-й нед после внедрения ПГА с адсорбированными АММСККП. Окраска гематоксилином и эозином Fig. 2. Results of PHA implantation into rat subcutaneous tissue: a - one week after the implantation of PHA without AMSCBMO, fragments of a capsule of dense connective tissue with granulomas (arrows) formed around polymer fibers are located in subcutaneous tissue, muscle fibers are located in depth; б - vast granulomas are formed in subcutaneous tissue in the first week after implantation of PHA with adsorbed AMSCBMO. Hematoxylineosin staining а б Рис. 3. Результаты имплантации ПГА в подкожную клетчатку крысы: а - через 4 нед после имплантации ПГА без АММСККП в подкожно-жировой клетчатке расположена гранулема без капсулы; б - фрагмент рис. 3, а. Крупная псевдокиста образована согнутым в полное кольцо волокном ПГА и содержит внутри фибрин различной плотности, рядом расположены многочисленные нити полимера и гигантские клетки инородных тел. Окраска гематоксилином и эозином Fig. 3. Results of PHA implantation into rat subcutaneous tissue: а - four weeks after implantation of PHA without AМMSCBMO, a granuloma without a capsule is located in subcutaneous tissue; б - fragment of Fig. 3, а. A large pseudocyst is formed by a PHA fiber bent into a hollow ring and contains fibrin of different density, numerous polymer fibers and giant cells oа foreign bodies are located nearby. Hematoxylin-eosin staining Также обращало на себя внимание большое число гигантских клеток инородных тел, как расположенных вне нитей полимера, так и полностью окутывающих отдельные волокна, достигающих в диаметре 20 мкм. Иногда на поперечном срезе целая нить ПГА была полностью окружена одной крупной гигантской клеткой. Кроме того, в структурах гранулем были расположены многоядерные макрофаги со слившейся Экспериментальная хирургия / Experimental surgery 41 Issues of Reconstructive and Plastic Surgery No. 2 (69) June’ 2019 цитоплазмой без фрагментов ПГА внутри, но по диаметру соответствующие нитям полимера (рис. 3, б). В некоторых случаях возле таких многоядерных клеток (или непосредственно в их цитоплазме) содержались очень мелкие частицы ПГА. В связи с этим можно сделать предположение, что подобные слившиеся макрофаги присутствуют на месте волокон, к моменту исследования уже полностью лизированных. Рис. 4. Результаты имплантации ПГА в подкожную клетчатку крысы: на 4-й нед имплантированный ПГА с адсорбированными АММСККП расположен в гранулеме. Капсулы нет, гранулема непосредственно граничит со склерозированной клетчаткой. Окраска гематоксилином и эозином Fig. 4. Results of PHA implantation into rat subcutaneous tissue: in the fourth week, implanted PHA with adsorbed AMMSCBMO is located in granuloma. Capsule is absent, granuloma joins sclerosed fiber. Hematoxylin-eosin staining Необходимо отдельно обратить внимание на кольцеобразную фигуру диаметром 100-150 мкм, образованную согнутым волокном полимера (см. рис. 3). В гранулемах с имплантированным материалом были расположены своеобразные псевдокисты (без эпителиальной выстилки), образованные при изгибании полимерных волокон в полное кольцо: оболочки псевдокист всегда включали нити ПГА. В указанные сроки наблюдения внутри этих псевдокист содержался только фибрин разной плотности. Считается, что способные к сокращению клеточные элементы соединительной ткани - миофибробласты при имплантации инородного тела содержатся в основном в капсуле из плотной волокнистой соединительной ткани, окружающей внедренный объект [35-37]. Миофибробласты принимают участие в минимизации объема, занятого инородным телом, уменьшении его размеров, фрагментации и элиминации по ходу раневого канала или перемещении по пути наименьшего механического сопротивления. Несмотря на отсутствие капсулы вокруг ПГА, в этом наблюдении также обнаружено сгибание и, вероятно, в дальнейшем переламывание, измельчение волокон полимера. Несомненно, что миофибробласты присутствуют и непосредственно в гранулемах: в рыхлой волокнистой и неоформленной соединительной ткани, окружающей волокна ПГА и в значительной мере инфильтрированной лейкоцитами, содержащей многочисленные сосуды грануляций и многоядерные макрофаги со слившейся цитоплазмой. В результате сократительной деятельности миофибробластов волокна полимера сгибаются вплоть до формирования полных кольцевых фигур. Скорее всего, при дальнейшей деформации возможно переламывание таких волокон. Обнаружение описанных кольцеобразных структур, образованных из изогнутых нитей ПГА в тканях, служит доказательством отсутствия полной интеграции этого полимера в организме, процессы деформации с последующей фрагментацией инородного объекта достаточно активны и через 4 нед после имплантации. Таким образом, происходит измельчение крупных инородных тел до такого состояния, что они могут быть фагоцитированы клетками макрофагального ряда. Кроме того, измельчение объекта увеличивает площадь его поверхности, что, ускоряет его гидролитическую деградацию или разрушение под воздействием лизосомальных ферментов фагоцитов, выбрасываемых из клеток наружу [38] для лизиса крупных чужеродных объектов. Можно заключить, что гистологическая картина практически не отличалась от наших ранее опубликованных результатов, на основании которых сделан вывод о длительной воспалительной реакции, отсутствии быстрой деградации и полной бионесовместимости изделий из ПГА с организмом [19-23]. Вместе с тем, представленные здесь данные противоречат результатам, показывающим биосовместимость, отсутствие воспалительных и некротических изменений в месте внедрения полимера в организм, а также хорошую адгезию культивируемых клеток, в том числе МСК, к ПГА [1-18]. С использованием морфометрии и статистической обработкой полученных данных были исследованы показатели васкуляризации и клеточной инфильтрации непосредственно в гранулеме, среди ультратонких волокон. Процент площади среза гранулемы, занимаемый кровеносными сосудами, на 3-й и 4-й нед после имплантации ПГА без АММСККП сократился относительно данных на 1-й нед на 69,2 и 83,7% соответственно (табл. 1). Объемная плотность лимфатических сосудов на 4-й нед после имплантации полимера без 42 Майбородин И.В., Михеева Т.В., Хоменюк С.В. и др. № 2 (69) июнь’ 2019 Вопросы реконструктивной и пластической хирургии адсорбированных АММСККП стала меньше на 56,1% по сравнению с состоянием на 1-й нед (табл. 1). Любое повреждение тканей с последующим острым или хроническим, гнойным или асептическим воспалением приводит к изменениям тока крови и лимфы в заинтересованных тканях из-за тромбоза, блокады сосудистого русла детритом или даже прямой деструкции сосудистых оболочек. Это предохраняет организм от диссеминации инфекции и других антигенов из места травмы и воспаления посредством сосудистого русла. По мере репарации тканей, как минимум, операционного разреза, и уменьшения антигенного воздействия, сосудистые нарушения постепенно восстанавливаются. Однако, так как выраженная воспалительная реакция, имеющая острый характер и поддерживаемая ПГА, сохраняется в течение всего времени наблюдения, объем сосудистого русла сокращается медленно и незначительно, и остается высоким даже по истечении 4 нед эксперимента. Процент площади среза, занимаемый кровеносными сосудами, на 3-й и 4-й нед после имплантации ПГА с адсорбированными АММСККП был меньше на 85,4 и 87,7% соответственно, по сравнению с состоянием на 1-й нед (табл. 2). Объемная плотность лимфатических сосудов на 4-й нед после имплантации полимера с АММСККП сократилась на 69,3% относительно данных на 1-й нед (табл. 2). Статистически значимых различий в состоянии васкуляризации гранулемы, обусловленных использованием АММСККП, адсорбированных на ПГА, на каждом сроке после имплантации не обнаружено (табл. 1, 2). На основании иммуномодуляторного действия МСК [24-28] мы ожидали более быстрое уменьшение объема сосудистого русла гранулемы. Но, во-первых, не было зафиксировано адсорбции АММСККП на полимере. Во-вторых, если ожидаемый иммуномодуляторный эффект и был, он быстро нивелировался очень выраженной воспалительной реакцией. В-третьих, иммуномодуляторное влияние АММСККП в данном случае могло быть просто замаскировано сопутствующим активным гранулематозным воспалением. Таблица 1. Структурная организация гранулемы вокруг ПГА в виде ультратонких волокон, имплантированных без АММСККП (M ± .) Table1. Structural organization of granuloma around PHA in the form of ultrathin fibers implanted without AMSCBMO (M ± .) Срок после имплантации Параметр 1 нед 2 нед 3 нед 4 нед Кровеносные капилляры (АА) 12,40 ± 1,98 8,83 ± 1,70 7,33 ± 1,50* 6,75 ± 1,66* Лимфатические капилляры (АА) 14,70 ± 1,97 12,80 ± 1,70 11,8 ± 1,82 9,42 ± 1,51* Интерстициальные пространства (АА) 5,58 ± 1,08 4,75 ± 0,622 3,58 ± 1,24 3,08 ± 1,31 Численная плотность всех клеточных элементов (NA) 942 ± 108 717 ± 119 733 ± 107 758 ± 116 Гигантские клетки инородных тел, % 2,25 ± 0,87 2,67 ± 0,99 2,75 ± 0,87 4,83 ± 0,72* Примечание. Здесь и в табл. 2: АА - относительная площадь структур на срезе, %); NA - численная плотность клеток на 105 мкм2 площади среза; * - р . 0,05 - по сравнению с показателями на 1-й нед. Таблица 2. Структурная организация гранулемы вокруг ПГА в виде ультратонких волокон, имплантированных с применением АММСККП (M ± .) Table 2. Structural organization of granuloma around PHA in the form of ultrathin fibers implanted with AMSCBMO (M ± .) Срок после имплантации Параметр 1 нед 2 нед 3 нед 4 нед Кровеносные капилляры (АА) 12,20 ± 2,33 9,33 ± 1,83 6,58 ± 1,51 6,50 ± 1,57 Лимфатические капилляры (АА) 15,10 ± 1,56 11,9 ± 2,15 11,80 ± 1,64 8,92 ± 1,16 Интерстициальные пространства (АА) 4,67 ± 1,78 4,92 ± 0,67 3,67 ± 0,98 3,33 ± 0,89 Численная плотность всех клеточных элементов (NA) 950 ± 117 783 ± 93 750 ± 109 708 ± 108 Гигантские клетки инородных тел, % 2,33 ± 0,89 2,50 ± 0,91 2,83 ± 0,84 4,92 ± 0,79 Экспериментальная хирургия / Experimental surgery 43 Issues of Reconstructive and Plastic Surgery No. 2 (69) June’ 2019 Гранулема, образованная вокруг ПГА в состоянии ультратонких волокон, независимо от адсорбции АММСККП на этом полимере, характеризуется высоким уровнем клеточной инфильтрации на всех сроках наблюдения. Это, наиболее вероятно, указывает на постоянно высокую активность воспалительного процесса, вызванного не только хирургическим вмешательством, но и, главным образом, присутствием самого ПГА в организме (табл. 1, 2, рис. 2-4). Относительное содержание гигантских клеток инородных тел среди других клеточных элементов к 4-й нед после имплантации ПГА без применения клеточных технологий и на фоне внедрения полимера с адсорбированными АММСККП увеличилось в 2,1 раза по сравнению с состоянием на 1-й нед (табл. 1, 2, рис. 3, б). Такое нарастание численности многоядерных макрофагов со слившейся цитоплазмой по мере увеличения времени после операции, скорее всего, свидетельствует о выраженной макрофагальной реакции на ПГА и очень медленном макрофагальном лизисе или даже о невозможности такового, об отсутствии деградации этого полимера и отсутствии его биосовместимости. Вместо утихания острого воспаления, деградации инородного тела или его инкапсуляции, отграничения от организма соединительной тканью, происходит нарастание макрофагальной инфильтрации тканей и прогрессивное формирование гигантских клеток инородных тел. Не исключено, что ПГА стимулирует именно макрофагальные реакции, отсюда происходят и очень активный гранулематозный воспалительный процесс, и формирование гранулем, и быстрое, уже в течение 1-й нед, образование большого числа гигантских клеток инородных тел. Других отличий клеточной инфильтрации, как между разными сроками послеоперационного периода, так и между результатами имплантации без АММСККП и с таковыми найдено не было. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, согласно литературным данным, ПГА должны способствовать пролиферации и дифференцированию МСК. На лабораторных животных при проведении острых и хронических экспериментов было обнаружено, что деградация полимера идет медленно, без формирования ограниченных дефектов и быстрого уменьшения прочностных характеристик. Полимеры на основе ПГА не вызывают некротических, воспалительных, склеротических или других нежелательных процессов в рядом расположенных тканях и in vivo не мешают репарации, что особенно важно для остеоимплантатов, эндопротезов, хирургических нитей и т.п. Однако в данном эксперименте не найдено адгезии АММСККП к поверхности полимера в состоянии ультратонких волокон при пассивной адсорбции. Были обнаружены обширные гранулемы инородных тел, формирующиеся вокруг ПГА, значительные воспалительные и некротические изменения тканей в этих гранулемах. Таким образом, полученная гистологическая картина полностью противоречит результатам производителей ПГА и исследователей, показывающим биосовместимость, отсутствие воспалительных и некротических изменений в месте внедрения полимера в организм, а также хорошую адгезию к нему культивируемых клеток, в том числе МСК. Различий, обусловленных адсорбцией АММСККП на ПГА, в состоянии васкуляризации гранулемы, сформированной вокруг волокон полимера, на каждом сроке после имплантации отмечено не было. После внедрения полимера без АММСККП и с адсорбированными АММСККП происходило постепенное уменьшение объемной плотности сосудистого русла. В клеточном составе гранулемы можно отметить раннее появление и быстрое нарастание относительного содержания гигантских клеток инородных тел, что также не зависело от применения клеточных технологий. По-видимому, если изменения, вызванные адсорбцией АММСККП, все-таки и были, они или маскировались, или очень быстро нивелировались выраженной воспалительной реакцией, вызванной присутствием полимера на основе ПГА в тканях.

Скачать электронную версию публикации