NEW METHOD OF EXPERIMENTAL MODELING OF DUODENAL ULCERS IN SMALL LABORATORY ANIMALS.pdf ВВЕДЕНИЕ Многофакторная этиология пептических язв [1], а также кровотечения и перфорации, возни- кающие у значительной части пациентов [2, 3], диктуют необходимость фундаментальных, в том числе и экспериментальных, исследований с целью выявления механизмов формирования язв, коррекции лечебной программы и профилак- тики язвенной болезни и ее осложнений. Одним из подтверждений актуальности данной пробле- мы служит большое количество используемых в эксперименте моделей язв [4-7]. В настоящее время в экспериментальной хирургии наиболее востребован способ модели- рования язвы двенадцатиперстной кишки (ДПК), предложенный S. Okabe и K. Amagase [8], однако он не лишен некоторых недостатков. Это создает предпосылки для поиска новых технических реше- ний моделирования дуоденальных язв у лабора- торных животных в условиях экспериментальной операционной. Цель исследования: разработка и экспери- ментальная апробация нового способа моделиро- вания язвы двенадцатиперстной кишки у мелких лабораторных животных. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Исследование проводили в условиях опера- ционного блока кафедры топографической ана- томии и оперативной хирургии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский универ- ситет» Минздрава России (ОмГМУ, г. Омск). В эксперимент были включены 30 белых беспородных крыс-самцов. Возраст животных составил 4 мес, масса тела 200-230 г. Работа проводилась с соблюдением морально-этических принципов в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных исследований, и межго- сударственным ГОСТ 33216-2014 [9]. Исследо- вание одобрено локальным этическим комитетом ОмГМУ (протокол №107 от 02.10.2018). Моделирование язвы ДПК (патент на изо- бретение № 2689865 от 29.05.2019) производи- лось инвазивным путем и включало: срединную минилапаротомную рану длиной 1,5-2,0 см; вы- ведение желудка и ДПК в рану; инъекцию по- вреждающего агента (70%-й раствор уксусной кислоты) в подслизистый слой стенки ДПК; ушивание лапаротомной раны. Операцию вы- полняли под эфирным наркозом. После мини- лапаротомии и выведения органов в операцион- ную рану, через пасть, пищевод и желудок экс- периментального животного в ДПК вводили тубус устройства для интраорганных внутри- просветных инъекций (далее УДИВИ) (рис. 1). УДИВИ (рис. 2) представлено двумя раз- личными по диаметру и длине полихлорвинило- выми трубками с радиусом изгиба около 140 мм (патент РФ №182779 от 31.08.2018). Наружная трубка (тубус) имеет внутренний диаметр 1,5 мм, наружный - 2,5 мм, длина ее меньше внутренней (инъектора) на 20 мм. Тубус предна- значен для защиты слизистой оболочки органов, через которые проводится УДИВИ, от повреж- дения кислотой, а также служит проводником для инъектора, непосредственно доставляющего повреждающий фактор в заданный участок стенки ДПК. Инъектор УДИВИ имеет наруж- ный диаметр 1,5-0,25 мм и внутренний диаметр 1,0 мм, торец его оснащен фиксированной стан- дартной укороченной инсулиновой иглой, име- ющей скос 45о и выступающей за просвет внут- ренней трубки на 4 мм (рис. 2, а). Проксимальная часть инъектора оснащена фиксированной стандартной иглой для внутримышечных инъекций (рис. 2, б) и ограничителем хода (полихлорвини- ловая прямоугольная пластина с прорезью в виде сужающегося конуса). Фиксация ограничителя хода на одной из насечек в проксимальной части инъектора позволяет ограничивать глубину вве- дения повреждающего агента. Рис. 1. Схема введения устройства для интраорганных внутрипросветных инъекций (УДИВИ) под контролем мини- лапаротомной раны: 1 - двенадцатиперстная кишка; 2 - торцовая часть УДИВИ, определяемая визуальным контролем; 3 - минилапаротомная рана; 4 - тубус (футляр) УДИВИ, проведенный через пасть крысы в ДПК; 5 - желудок Fig. 1. Scheme of introduction of the device for intraorgan intraluminal injections (DIII) under the control of a mini- laparotomic wound: 1 - duodenum; 2 - end part of DIII, determined by visual control; 3 - mini-laparotomic wound; 4 - DIII tube (case) passed through the rat's mouth in the duodenum; 5 - stomach а б Рис. 2. Устройство для интраорганных внутрипро- светных инъекций (а, б - схемы, в - фото): 1 - инъек- тор; 2 - ограничитель хода; 3 - стандартная игла для внутримышечных инъекций; 4 - тубус; 5 - стандартная укороченная инсулиновая игла; 6 - торец тубуса Fig. 2. Device for intraorgan intraluminal injections (а, б - diagrams, в - photo): where 1 - injector; 2 - travel stop; 3 - standard needle for intramuscular injection; 4 - tube; 5 - standard shortened insulin needle; 6 - end of the tube в Дистальный конец тубуса УДИВИ упирался со стороны слизистой в заданный участок стен- ки ДПК, контроль локализации торца тубуса осуществлялся со стороны минилапаротомной раны (рис. 3). Рис. 3. Визуальный и тактильный контроль локализации торца тубуса (инраоперационное фото): 1 - торец ту- буса УДИВИ; 2 - двенадцатиперстная кишка; 3 - желу- док Fig. 3. Visual and tactile control of localization of the end of the tube (intraoperative photo): 1 - end of the tube DIII; 2 - duodenum; 3 - stomach Затем в просвет тубуса вводили инъектор, заполненный раствором 70%-й уксусной кисло- ты, ограничитель хода устанавливали на 0,5 мм, что обеспечивало введение заданного объема раствора в подслизистый слой передней стенки ДПК. Визуальный и тактильный контроль цело- стности серозной оболочки ДПК осуществлялся из минилапаротомной раны. Животные были разделены на четыре группы в зависимости от объема вводимого раствора: крысам первой группы вводили 0,01 мл, второй - 0,02 мл, треть- ей - 0,03 мл, четвертой группы - 0,04 мл. После введения раствора уксусной кислоты УДИВИ удаляли из просвета желудочно-кишечного тракта. Минилапаротомную рану послойно ушивали наглухо. Послеоперационное наблюдение за каждым животным, находившимся в отдельной клетке, происходило в течение 6 ч. Крысы получали воду в неограниченном количестве, затем пе- реводились в клетку с типовым рационом пи- тания. Выведение животных из эксперимента с целью контроля за течением процесса зажив- ления язвенного дефекта стенки ДПК осуще- ствляли на 3-и, 5-е и 7-е сут после операции. Эвтаназию проводили путем передозировки диэтилового эфира, после чего производили релапаротомию с визуальной оценкой целост- ности и состояния стенки ДПК в зоне введения раствора уксусной кислоты, а также выраженности спаечного процесса в брюшной полости. Выделяли и резецировали исследуемый орган. Проводили вскрытие просвета ДПК для оценки состояния слизистой оболочки, определения размеров язв. Затем производили иссечение макропрепарата язвы для морфологического исследования (рис. 4). Рис. 4: Макропрепарат стенки ДПК с язвенным дефек- том: 1 - рубцующийся язвенный дефект стенки ДПК через 7 сут после инъенкции; 2 - фрагмент неизмененной стенки ДПК; 3 - фрагмент неизмененной стенки желудка; 4 - фрагмент пилорического отдела желудка Fig. 4. Macrodrug of the duodenal wall with ulcerative defect: 1 - scarring ulcerative defect of the duodenal wall 7 days after injection; 2 - a fragment of the unchanged duodenal wall; 3 - a fragment of the unchanged stomach wall; 4 - a fragment of the pyloric stomach Морфологическое исследование препаратов проводилось на базе патологоанатомического отделения БУЗОО «МСЧ №9» (г. Омск) с окра- шиванием срезов гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование и фотопрото- колирование выявленных изменений производи- лись с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeizz, Германия) с увеличением ×20, оснащенного цифровой камерой Сanon EOS 550D (Япония). При микроскопии оценивали тканевой и кле- точный состав в зоне язвенного дефекта, дина- мику заживления. Площадь язвенного дефекта (S, см2) высчи- тывали при помощи формулы площади эллипса (S = πab; где π = 3,14; а - величина большой полу- оси, равная половине длины язвенного кратера; b - величина малой полуоси, равная половине ширины язвенного кратера. Обработку полученных результатов прово- ди при использовании методов описательной статистики с помощью компьютерной про- граммы Statistica 6.0. Поскольку количествен- ные признаки не подчинялись нормальному распределению, для представления данных ис- пользовали непараметрический метод Манна- Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ Зависимость размеров экспериментально полученных язв ДПК от объема введенного в подслизистый слой 70%-го раствора уксусной кислоты в различные сроки послеоперационного периода представлена в таблице. Зависимость площади язвы ДПК в от объема введенного 70%-го раствора уксусной кислоты и времени от момента введения, Me [Q1; Q3] Dependence of the area of duodenal ulcer on the volume of injected 70% solution of acetic acid and time from the moment of administration, Me [Q1; Q3] Время от момента введения раствора Объем уксусной кислоты, мл 0,03 (n = 3) 0,02 (n = 3) 0,01 (n = 3) 3-и сут S = 0,75 S = 0,57 S = 0,31 [0,63; 0,88] [0,47; 0,66] [0,28; 0,31] 5-е сут S = 0,66 S = 0,39 S = 0,24 [0,55; 0,85] [0,31; 0,47] [0,19; 0,25] 7-е сут S = 0,38 S = 0,25 S = 0,13 [0,31; 0,55] [0,19; 0,31] [0,09; 0,14] Примечание. n -количество случаев, S - площадь язвенного дефекта, см2. В трех случаях при введении в подслизистый слой стенки ДПК 0,04 мл раствора 70%-й уксус- ной кислоты наблюдался тотальный некроз всех слоев с присоединением флегмоны кишки. Животные погибли на 2-е сут от распространенного перитонита на фоне перфорации некротизиро- ванной стенки ДПК. Морфологическая картина полученных яз- венных дефектов через 3 сут после введения 70%-го раствора уксусной кислоты в подслизи- стый слой стенки ДПК (рис. 5, а) была пред- ставлена выраженным отеком подслизистой оболочки, наличием эозинофильных лейкоцитов и кровоизлияний. В области дна язвы наблюда- лись пропитывание разрушенных тканей массами фибрина, лейкоцитарная экссудация и диапедез- ные кровоизлияния. Через 5 сут после операции (рис. 5, б) были выявлены морфологические признаки некроза тканей в дне язвенного дефекта со слабо выра- женной лейкоцитарной экссудацией, дном явля- лась разрушенная мышечная оболочка. В под- слизистой оболочке в области дна язвы опреде- лялась формирующаяся грануляционная ткань. На поверхности на зону дефекта с одной стороны наползала слизистая оболочка с минимальными изменениями. В препаратах, полученных через 7 сут от на- чала эксперимента (рис. 5, в) определялись мор- фологические признаки гиперплазии покровно- ямочного эпителия регенераторного типа над зоной разрастания зрелой грануляционной тка- ни. В подслизистой оболочке сохранялся отек тканей, расширение и полнокровие сосудов, умеренно выраженная полиморфно-клеточная инфильтрация с наличием эозинофильных лей- коцитов. а б в Рис. 5. Микропрепараты язвы ДПК крысы: 1 - язвенно-деструктивное поражение стенки ДПК (а - 3-и сут, б - 5-е сут, в - 7-е сут). Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. × 20 Fig. 5. Microdrugs of rat duodenal ulcer: 1 - ulcerative-destructive lesion of the duodenum wall (a - 3rd day, б - 5th day, в - 7th day). Staining with hematoxylin and eosin. Increase × 20 ОБСУЖДЕНИЕ Ведущим патогенетическим звеном, запус- кающим каскад патологических реакций возник- новения язвы ДПК у человека, является пепти- ческий фактор. Моделирование пептических язв, где процесс начинается с кислотного поврежде- ния участка слизистой оболочки, определило направление нашего экспериментального иссле- дования. Известен и наиболее часто применяет- ся в различных модификациях [8] способ моде- лирования язвы ДПК, предложенный S. Okabe, включающий лапаротомию, нанесение 100%-й уксусной кислоты на серозную оболочку стенки ДПК с последующей экспозицией 30 с. Согласно данной модели, через 3 сут в зоне, обработанной уксусной кислотой, должен сформироваться яз- венный дефект с вовлечением всех слоев стенки пораженного органа. Однако способ S. Okabe имеет некоторые недостатки: повреждение на- чинается со стороны серозной оболочки ДПК, далее за счет вовлечения в воспаление сосуди- стого русла возникают трофические нарушения в зоне поражения, при этом дефект слизистой оболочки формируется в последнюю очередь, что не соответствует процессу возникновения пептической язвы у человека, где серозная обо- лочка стенки кишки вовлекается последней. Предлагаемый способ моделирования язвы ДПК у экспериментальных животных, в отличие от классических способов, имеет следующие преимущества: 1) инъекция заданного объема ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES раствора кислоты в стенку ДПК производится при помощи УДИВИ со стороны просвета ор- гана, за счет этого язвенный дефект возникает в первые часы эксперимента; 2) осуществление инъекции возможно в строго заданную зону под минилапаротомным контролем и строго заданного объема за счет применения ограни- чителя хода УДИВИ, что позволяет моделиро- вать язву запрограммированной локализации и величины. Результаты проведенного исследования вы- явили пороговую дозу вводимого раствора ук- сусной кислоты (0,04 мл), превышение которой влечет за собой тотальный некроз стенки кишки с последующей перфорацией и гибелью живот- ного, а также взаимосвязь между размерами моделируемой язвы ДПК, объемом вводимой кислоты и сроками заживления. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Устройство для интраорганных внутрипро- светных инъекций обеспечивает новый подход к доставке повреждающего фактора в подслизи- стый слой стенки органа-мишени, что позволяет моделировать язвы желудочно-кишечного тракта у мелких лабораторных животных, наиболее при- ближенные к пептическим язвам у человека. Предложенный способ моделирования дуоде- нальных язв является воспроизводимым и может быть рекомендован к применению в экспери- ментальной хирургии.

Скачать электронную версию публикации