Photosynthetic and respiratory processes in the needle of the Siberian Stone Pine, the Siberian Dwarf Pine and their hyb.pdf Явление естественной гибридизации широко распространено в растительном мире и играет важную роль в эволюции видов [1]. Большинство генных взаимодействий при гибридизации оказываются неблагоприятными или нейтральными, однако небольшая доля чужеродных генов благоприятно взаимодействует друг с другом, что может обеспечить дальнейшую эволюцию гибридного таксона [2]. Гибриды, как правило, обладают большей генетической изменчивостью и в связи с этим имеют больший эволюционный потенциал, чем родительские виды, благодаря объединению двух сильно различающихся генотипов [3]. Успешное приспособление гибридных особей к конкретным условиям существования проявляется как на морфологическом [4], так и на физиологическом [5-7] уровнях. Среди трех видов пятихвойных сосен (секция Quinquefoliae, подрод Strobus), обитающих на территории России, гибридизация отмечена между кедром сибирским (Pinus sibirica Du Tour) и кедровым стлаником (Pinus pumila (Pall.) Re gel) [8]. Ареал кедра сибирского простирается от Северного Урала на западе до водоразделов Лены и Амура на востоке. Северная граница ареала проходит по р. Игарка в низовьях р. Енисей, на юге граница доходит до верховий р. Ор-хон в Монголии. Кедровый стланик распространен по всей Восточной Сибири и Дальнему Востоку. Ареалы обоих видов перекрываются в Прибайкалье и Забайкалье. Именно здесь впервые были отмечены естественные гибриды между кедром и стлаником [8]. Кедр и стланик являются экологически различными видами. Кедр сибирский не выносит холодных почв, его северная и восточная границы совпадают с югозападной границей распространения вечно мерзлотных грунтов. На территории Восточной Сибири кедровые леса являются типичным элементом растительности горно-долинного ландшафта среднего и нижних поясов горных систем, климат которых можно охарактеризовать как умеренно холодный и достаточно влажный [9]. Кедровый стланик существует в области особо резко континентального климата северо-востока Азии, совпадающей с зоной вечной мерзлоты. На горных поднятиях в пределах ареала P. pumila образует густые заросли в подгольцовом поясе [10]. Кедр сибирский и кедровый стланик также имеют различную жизненную форму. P. sibirica - прямостоячее дерево, P. pumila существует в виде стелющегося древесного растения, поэтому стратегия выживания этих видов отличается и реализуется в первую очередь через особенности протекания физиологических процессов. Гибриды отличаются от родительских видов промежуточной формой роста, они не стелятся как кедровый стланик, а их ствол обычно искривлен в комлевой части и отклоняется от вертикали. Шишки гибридов по цвету похожи на шишки кедра сибирского, такие же фиолетовые, по размеру они мельче, чем у кедра сибирского, но крупнее, чем у кедрового стланика [8]. Исследования физиологических особенностей кедра сибирского, кедрового стланика и их гибридов немногочисленны. Например, ранее были показаны значительные отличия состояния пигментного фонда и водного режима хвои кедра сибирского, кедрового стланика и их гибридов в зимний период [11]. Известно, что процессы роста, а в конечном счете и продуктивности, заложенные в генотипе, большей частью ограничиваются их энергетическими возможностями, которые зависят от фотосинтетической и дыхательной деятельности [12]. Цель данной работы состояла в сравнительном исследовании ряда показателей, характеризующих фотосинтез и темновое дыхание хвои, у кедра сибирского, кедрового стланика и их естественных гибридов. Материалы и методики исследования Исследования проводили на стационаре «Кедр» Института мониторинга климатических и экологических систем СО РАН (56°13' с.ш., 84°51' в.д., 78 м над ур. м., юго-восток Западно-Сибирской равнины, южная тайга). Объектом исследования служили кедр сибирский, кедровый стланик и их естественные гибриды, представленные привоями на местный экотип кедра сибирского. Возраст прививок у исследованных видов и гибридов составлял 10 лет. Местом происхождения материнских деревьев был северный макросклон хребта Хамар-Дабан (Забайкалье). Гибриды отличаются от родительских видов промежуточной формой роста, они не стелятся, как кедровый стланик, а их ствол обычно искривлен в комлевой части и отклоняется от вертикали. Шишки гибридов по цвету похожи на шишки кедра сибирского, такие же фиолетовые, по размеру они мельче, чем у кедра сибирского, но крупнее, чем у кедрового стланика. В работе было использовано по 3 клона видов и 4 клона гибридов. Для исследования активности малатде-гидрогеназы использовали активно растущие почки, для всех остальных анализов проводили сбор хвои текущего года в конце июля, когда фотосинтетиче-ский аппарат полностью сформировался. Для характеристики фотосинтеза были выбраны два показателя: содержание фотосинтетических пигментов и скорость фотовосстановления феррицианида калия изолированными хлоропластами (реакция Хилла). Количество хлорофиллов а и b, а также сумму каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр UV-1601PC «Shimadzu», Япония) в этиловом спирте при длинах волн 665, 649, 440,5 нм соответственно, в одной вытяжке без их предварительного разделения [13]. Выделение хлоропластов проводили при температуре 2-4°С путем растирания хвои в среде следующего состава: 0,05 М Трис-НС1-буфер рН 8,0; 0,4 М сахароза; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ MgCl2; 0,5%-ный бычий альбумин [14]. Фотосинтетическую активность хло-ропластов определяли спектрофотометрическим методом по скорости фотовосстановления феррициани-да калия. Реакцию проводили в одинаковой реакционной среде при равном содержании хлорофилла в кювете. Реакционная среда содержала: 100 мкМ трис, рН 7,4; 10 мкМ NaCl; 10 мкМ MgCl2; 3 мкМ K3Fe(CN)6; 4 мкМ АДФ; 10 мкМ KH2PO4 [15]. Реакции измеряли при освещении кюветы белым светом интенсивностью 150 Вт/м2. Изучение дыхательных процессов хвои включало в себя исследование эмиссии СО2 при темновом дыхании хвои и анализ активности НАД-зависимой ма-латдегидрогеназы. Измерение эмиссии СО2 проводили на лазерном оптико-акустическом газоанализаторе в затемненных камерах. Образцы хвои (навеска 10 г) помещали в затемненную герметичную емкость объемом 0,5 л, заполненную воздухом. После темновой экспозиции хвои в течение 1, 2 и 3 ч проводили забор газа из емкости и продувку им измерительной ячейки газоанализатора. Методика проведения экспериментов подробно описана в наших предыдущих публикациях [16, 17]. Выделение митохондрий проводили при температуре 2-4°С при центрифугировании гомогената при 16 тыс. оборотов в минуту с использованием рефрижераторной центрифуги К-24 (ГДР). Среда выделения содержала 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,8; 5 мМ аскорбат натрия, 3 мМ цистеин, 1 мМ хлористый магний и 5 мМ дитиотрейтол [18]. Определение активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы проводили в среде: 0,05 М трис-HCl буфер, рН 9,1; 1,93 М малат натрия и 11 мМ НАД [19]. Содержание белка определяли по Лоури в параллельной пробе хвои, не содержащей дитиотрейтол [20]. Для анализа активности фермента использовали почки, так как добиться измерения активности данного фермента в сформировавшейся хвое не удалось из-за значительного содержания в ней терпенов, смол, флавоноидов. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения и стандартные отклонения. Для видов указаны средние значения, полученные для разных клонов. Поскольку гибриды между собой сильно различались, то их клоны рассматривались и сравнивались с видами каждый отдельно. Среднее значение для клонов высчитывалось на основании 46 аналитических повторностей. Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, критический уровень значимости приняли равным 0,05. Разными буквами отмечены значимые различия между вариантами. Статистическая обработка полученных данных и построение графиков выполнены в программе Microsoft Excel. Результаты исследования и обсуждение Состояние фотосинтетических пигментов хвои древесных растений является одним из важных показателей функционирования фотосинтетического аппарата. Проведенные исследования показали, что содержание хлорофилла а в хвое текущего года у кедрового стланика было достоверно ниже, чем у кедра сибирского, количество же хлорофилла b и соотношение хлорофиллов а/b отличалось у данных видов незначительно (табл. 1). Отличия в содержании каро-тиноидов исследованных видов были более значительными, кедровый стланик содержал на 38% меньше данных пигментов, чем кедр сибирский. Отношение же Хл а_+ b / каротиноиды у кедрового стланика было выше в основном за счет снижения доли каро-тиноидов в пигментном комплексе хлоропластов. Пигментный фонд гибридов количественно варьировал, тем не менее можно было выделить две группы клонов. У первой группы (гибриды 1 и 4) содержание фотосинтетических пигментов было близко к значению этого показателя у кедрового стланика. У второй группы (гибриды 2 и 3) количество пигментов было ближе к кедру сибирскому. Гибрид 1 характеризовался самым низким содержанием фотосинтетических пигментов (табл. 1). Исследования, проведенные на изолированных хлоропластах у видов и гибридов, показали их различную функциональную активность на уровне фотосистемы II (рис. 1). Скорость фотовосстановления феррицианида калия изолированными хлоропластами у кедрового стланика была ниже относительно кедра сибирского. У гибридов наблюдалась большая вариабельность скорости электрон-транспортных реакций. Гибриды 1 и 2 по данному параметру проявили себя несколько угнетенно в сравнении с родительскими видами, скорость реакции Хилла у них была ниже в 3,2 раза по сравнению с кедром сибирским и в 2,4 раза по сравнению с кедровым стлаником. У гибрида 3 скорость данной реакции была примерно такая же, как у кедра сибирского, а гибрид 4 характеризовался самой высокой активностью. Т а б л и ц а 1 Содержание фотосинтетических пигментов в хвое текущего года у гибридов и их родительских видов, мкг/г сухой массы Параметр Кедр Стланик Гибрид 1 Гибрид 2 Гибрид 3 Гибрид 4 Хлорофилл а 1764±18x 1582±25y 1452±21z 1715±15x 1694±27x 1518±28y Хлорофилл b 518±16x 495±11x 415±14y 517±13x 526±22x 453±16z Сумма каротиноидов 441±15x 273±10y 285±19y 404±11x 324±18z 294±14y Хл a/b 3,41 x 3,20 x 3,49 x 3,32 x 3,24 x 3,35 x Хл a+b /каротиноиды 4,02 x 5,49 y 5,11 y 4,25 x 5,23 y 5,17 y Примечание. Разными буквами отмечены значимые различия между вариантами. 700 кедр стланик гибрид1 гибрид2 гибридЗ гибрид4 Рис. 1. Скорость фотовосстановления феррицианида калия изолированными хлоропластами кедра сибирского, кедрового стланика и их гибридов. Представлены средние данные из 5 повторностей с доверительными интервалами Исследование темнового дыхания хвои выявило, что кедровый стланик выделяет больше углекислого газа через 1, 2 и 3 ч темновой экспозиции по сравнению с кедром сибирским (рис. 2). Так, через 3 ч различия между кедром сибирским и кедровым стлаником в содержании углекислого газа в камере достигли 46%. Эмиссия CO2 у гибридов была достоверно выше, чем у кедра сибирского, и близка к таковой у кедрового стланика (рис. 2). Время, минуты -кедр -гибрид2 - -стланик -гибрид3 гибрид1 гибрид4 Рис. 2. Скорость эмиссии СО2 при темновом дыхании хвои кедра сибирского, кедрового стланика и гибридов между ними. Представлены средние данные из 5 повторностей с доверительными интервалами Исследование активности НАД-зависимой малат-дегидрогеназы - ключевого фермента цикла Кребса -показало, что активность данного фермента у кедрового стланика была в 2-3 раза выше, чем у кедра сибирского (табл. 2). Все исследованные гибриды также характеризовались повышенной активностью малат-дегидрогеназы. Т а б л и ц а 2 Активность НАД-зависимой малатдегидрогеназы в почках кедра сибирского, кедрового стланика и гибридов между ними Объекты исследования Активность фермента, млЕ/мг белка Активность фермента, % Кедр 109,5±15,4 x 100 Стланик 369,5±30.2 y 337 Гибрид 1 184,9±14,8 z 169 Гибрид 2 204.7±26,8 z 187 Гибрид 3 281,4±18,1 w 257 Гибрид 4 345,6±23,6 y 316 Примечание. Разными буквами отмечены значимые различия между вариантами. Для сравнения всех исследованных показателей у родительских видов и гибридов изученные признаки были разбиты на две группы: фотосинтетические и дыхательные, и условно приняты у кедра сибирского за 1. Это позволило унифицировать все единицы измерения и через пропорцию рассчитать относительные значения всех показателей у гибридов и кедрового стланика. Затем были рассчитаны отклонения полученных относительных значений от 1, поэтому отклонение у кедра сибирского было равным 0. Максимальные отклонения были получены у кедрового стланика, гибриды занимали промежуточное положение (рис. 3). По фотосинтетическим показателям гибриды 2 и 3 были ближе к кедру сибирскому, а гибриды 1 и 4 - к кедровому стланику. По дыхательным параметрам все четыре гибрида были ближе к кедровому стланику. Рис. 3. Сравнение гибридов с родительскими видами по величине отклонений исследованных параметров относительно кедра сибирского. Штриховой линией показано среднее значение отклонения каждого параметра Сравнение кедра сибирского и кедрового стланика выявило значительные отличия этих двух видов по комплексу исследованных физиологических показателей. Низкое содержание фотосинтетических пигментов в хвое кедрового стланика по сравнению с кедром сибирским ранней весной и в течение всего вегетационного сезона отмечалось нами в предыдущих работах при выращивании этих видов на юге Томской области [11]. Если принять во внимание, что каротиноиды выполняют как светособирающую, так и защитную функции [21], то уменьшение доли этих пигментов в хлоропластах кедрового стланика свидетельствует, скорее всего, о снижении защитной функции у данного вида при произрастании в нетипичных для него условиях. При чрезвычайной изменчивости содержания пигментов полученный результат может быть свидетельством косвенной связи их количества с адаптивной изменчивостью. В литературе неоднократно показаны экологические аспекты специфики пигментного фонда хвои [22, 23]. Интерпретируя полученные результаты и сравнивая их с литературными данными, можно сказать, что накопление фото-синтетических пигментов - это адаптивная реакция, которая в большей степени зависит от возрастных, сезонных и экологических изменений, а по наследству, по-видимому, может передаваться только степень изменчивости данного параметра. В реализации фотосинтетической функции большое значение имеет не только общее содержание хлорофилла, но и его организация в пигмент - белковолипидные комплексы и фотосистемы. Первичные фотохимические процессы находятся в большой зависимости от внешних факторов среды, а также подвержены направленной физиолого-биохимической регуляции со стороны клетки. Известно, что первичные реакции фотосинтеза напрямую не связаны с количеством пигментов, а зависят от организации макромоле -кулярных комплексов на поверхности тилакоидов [21]. Существуют генетически обусловленные особенности структурно-функциональной организации фотосистем хлоропластов [24]. Скорость фотовосстановления феррицианида калия характеризует активность первичных фотохимических процессов фотосинтеза на уровне фотосистемы II, которая по сравнению с фотосистемой I быстрее реагирует на изменение экологических факторов [25, 26]. Наблюдаемая нами низкая функциональная активность хлоропластов у кедрового стланика указывает на различную организацию макромолекулярных комплексов хлоропластов на уровне фотосистемы II, которая, вероятно, зависит от генетических особенностей вида и характерных для каждого вида условий произрастания. Показатели, связанные с дыхательной функцией, наоборот, у кедрового стланика были выше по сравнению с кедром сибирским. О.А. Семихатовой [27] было показано, что в неблагоприятных условиях среды нарушается корреляция между дыханием и ростом вследствие возникновения дополнительных дыхательных затрат, связанных с адаптацией. Если учесть, что кедровый стланик хуже растет в прививках по сравнению с кедром сибирским [28], то, вероятно, большая часть ассимилятов, образующихся в процессе фотосинтеза хвои, у данного вида тратится на поддержание дыхания, а не на рост. Условия произрастания на юге Томской области для стланика являются неоптимальными и даже стрессовыми, поскольку находятся далеко за пределами ареала вида. Известно, что у сосен ДНК хлоропластов наследуются по отцовской линии, а ДНК митохондрий - по материнской [29]. Поэтому можно предположить, что физиологические функции, за которые ответственны эти органеллы, у гибридов проявят сходство с тем родительским видом, от которого они были унаследованы. Близкие значения дыхательных параметров у кедрового стланика и гибридов позволяют сделать предположение о том, что все исследованные гибриды унаследовали митохондрии от кедрового стланика, т.е. они произошли от опыления женских шишек кедрового стланика пыльцой кедра сибирского. По фотосинтетическим параметрам гибриды разделились на две группы, одна из которых проявила большее сходство с кедром сибирским, другая - с кедровым стлаником. Высокую изменчивость фотосинтетических параметров у гибридов можно объяснить тем, что биогенез хлоропластов и пигмент-белковых комплексов мембран тилакоидов находится под двойным генетическим контролем: хлоропласт-ной и ядерной ДНК [30]. Поскольку у гибридов ядерный геном содержит гены как кедрового стланика, так и кедра сибирского, возможны различные комбинации генов, ответственных за регуляцию физиологических процессов. Низкое значение функциональной активности хлоропластов на уровне фотосистемы II у гибридов 1 и 2, вероятно, детерминировано той или иной генетической комбинацией. С другой стороны, гибриды, как и кедровый стланик, могли испытывать экологический стресс в нетипичных для них условиях произрастания. Физиологические методы исследования крайне редко используются при изучении гибридов хвойных видов В литературе имеются немногочисленные и фрагментарные данные по энергопреобразующим процессам у различных гибридов. Так, интенсивность фотосинтеза и темного дыхания не различались у гибридов Pinus taeda L.xP. rigida Mill. и их родительских видов [31]. По другим данным, достоверно более высокие значения фотосинтеза и устьичной проводимости были показаны у гибридов первого поколения Picea sitchensis (Bong.) Carr.xP. glauca (Moench) Voss.xP. engelmannii Parry [5, 6]. В дальнейших исследованиях для полной характеристики гибридных растений необходимо использовать комплексный подход с учетом генетических, физиологических и морфологических методов. Заключение Проведенные исследования показали, что кедр сибирский, кедровый стланик и их естественные гибриды в одинаковых условиях произрастания отличались уровнем фотосинтетических пигментов и скоростью электрон-транспортных реакций на уровне фотосите-мы II, а также интенсивностью темнового дыхания и активностью малатдегидрогеназы. Кедровый стланик характеризовался низкими значениями фотосинтети-ческих показателей и высокой активностью дыхательных функций по сравнению с кедром сибирским. Гибриды сильно варьировали по фотосинтетическим параметрам, а по активности темнового дыхания были ближе к кедровому стланику. На юге Томской области жизненное состояние гибридов было лучше, чем у кедрового стланика, но хуже, чем у кедра сибирского. Гибриды, по-разному комбинируя генетический материал родительских видов, отличаются от них как по морфологическим, так и по физиологическим признакам. Поэтому в будущем целесообразно проводить анализ фотосинтетических и дыхательных параметров наряду с использованием генетических маркеров. Это позволит достичь более глубокого понимания физиологических процессов у гибридных особей.

Скачать электронную версию публикации