Detection of toxic Microcystisin Lake Kotokelskoe (Buryatia).pdf Род Microcystis (Ktitz.) Elenk. - один из самых широко распространенных среди синезеленых водорослей или цианобактерий - часто вызывает «цветение» воды в продуктивных водоемах. Некоторые виды Microcystis продуцируют токсичные циклические пептиды - микроцисти-ны, состоящие из 7 аминокислот: цикло-(с-А1а-Х-гг MeAsp-ZrAdda-D-Glu-Mdha), где D-Ala - D-аланин, D-MeAsp - D-эритро-Р-метиласпарагиновая кислота, Adda - 3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил-10-фенил-дека-4,6-диеноевая кислота, D-Glu - D-глутамат, Mdha-Л^-метиддещдроаланин, X и Z - вариабельные L-амино-кислоты. Кроме одноклеточных колониальных микроцис-тисов, обычными возбудителями «цветения» водоемов, синтезирующими микроцистины, являются нитчатые цианобактерий АпаЪаепа [1] и Planktothrix [2]. Известно более 65 вариантов микроцистинов, различающихся в основном вариабельными аминокислотами и деметили-рованием MeAsp и Mdha [1]. Среди них наиболее часто встречается микроцистин-LR, где вариабельные L-амино-кислоты представлены лейцином и аргинином, он также наиболее токсичен [3, 4]. RR- (аргинин-аргинин) и YR-(тирозин-аргинин) изоформы менее распространены. Варианты микроцистинов могут присутствовать в период «цветения» по несколько одновременно или каждый по отдельности. Токсины накапливаются в окружающей водной среде, аккумулируются в моллюсках, рыбе и других гидробионтах, далее передаются по трофической цепи теплокровным наземным животным и человеку. Известны также отравления травоядных млекопитающих на водопое при попадании в пищеварительный тракт как фитопланктона, так и самой воды. Определенную опасность представляет загрязнение цианотоксинами источников водоснабжения и водозаборов. Отравление может произойти при купании во время «цветения» воды [4]. Клинические симптомы при интоксикации микроцистином: диарея, топшота, озноб, слабость [5]. Токсичность микроцистинов определяется их активным транспортом в клетки печени (гепатоциты) с последующим ингибированием эукариотической серин/треонин фосфатазы 1 и 2А [6]. Adda и D-глутамат играют ключевую роль в токсичности микроцистинов, именно этот участок взаимодействует с фосфатазами. В результате ингибирования фосфатаз происходит лизис гепатоцитов, кровоизлияния и застой крови в печени, что приводит к значительному увеличению ее размеров [6].В последнее время во многих странах мира по рекомендации Всемирной организации здравоохранения (1998) проводится мониторинг цианотоксинов в питьевой воде, при этом установленная ВОЗ предельно допустимая концентрация микроцистина-LR составляет 1 мкг/л. Одна из основных задач контроля качества питьевой воды - выявление видов, способных синтезировать токсины. Во время «цветения» в воде могут присутствовать как микроцистин-продуцирующие, так и нетоксичные штаммы одного вида, их невозможно отличить от друг от друга микроскопически. Наиболее быстрым и точным методом выявления токсикогенных цианобактерий является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с праймерами, специфичными к генам, ответственным за синтез токсинов.Микроцистины синтезируются нерибосомно большим мультиферментным комплексом, состоящим из различных модулей, включая нерибосомную пептид-синтетазу (NRPS), поликетидсинтазу (PKS), а также дополнительные модифицирующие ферменты [7]. Эти модули катализируют активацию, модификацию и конденсацию специфических аминокислот. Кластер генов, кодирующий ферменты для синтеза микроцистинов (тсу), определен у двух штаммов М. aeruginosa PCC 7806 [7] и К-139 [8], он имеет длину 55 тыс. п. н. и состоит из 10 открытых рамок считывания.В настоящей работе поиск потенциально токсичных цианобактерий проводили с помощью маркеров, которые позволяют выявить нуклеотидную последовательность, кодирующую домен аминотрансферазы (АМТ) гена тсуЕ. АМТ входит в состав всех известных мик-роцистин-синтетаз и, как недавно показано [9], нодуля-рин-синтетазы (ncla), которая кодирует синтез другого известного гепатотоксина - нодулярина, продуцируемого видами рода Nodularia. АМТ локализуется в PKS-модуле тсуЕ- и ndaF-тепов и играет ключевую роль в биосинтезе микроцистинов и нодуляринов, выполняя перенос аминогруппы на Adda мотив [7, 9].Озеро Котокельское (52°50' с.ш., 108°10' в.д.) -крупный промысловый водоем Бурятии - расположено в 2 км к востоку от Байкала. Длина озера 15 км, наибольшая ширина 6 км, глубина 12 м. Котокельское является объектом туристско-рекреационной зоны Прибайкалья, здесь находится множество турбаз и пансионатов. Летом 2008 г. на озере зарегистрирована массо-172вая гибель рыб, водоплавающих птиц и домашних кошек, отмечено 16 случаев отравлений человека, связанных с употреблением в пищу леща, выловленного в озере. У всех пострадавших были симптомы Гаффской болезни или, согласно медицинской терминологии, алиментарно-токсической пароксизмальной миоглоби-нурии. Отравлений вследствие купания в озере не регистрировали [10]. Этиология Гаффской болезни, также называемой юксовско-сартланской, остается невыясненной, одной из возможных причин является действие биологически активных веществ цианобактерий [4]. В настоящее время на озере действует запрет на употребление в пищу рыбы, купание и использование воды для бытовых и хозяйственных нужд [10].Материалы и методыПробы фитопланктона были отобраны сетью Ап-штейна в августе 2008 г. у пос. Исток в прибрежной зоне озера и зафиксированы 4% формалином для микроскопического наблюдения и 80% этанолом для моле-кулярно-биологического анализа. Одновременно с отбором проб была определена температура и прозрачность воды по диску Секки.Для изучения видового состава и численности цианобактерий использовали световой микроскоп Axio-vert 200 (Zeiss, Германия).ДНК выделяли методом адсорбции на силикагеле с использованием набора ДНК-Сорб (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Россия) по инструкции производителя. ГЩР проводили на приборе Mini Cycler (MJ Research, Bio-Rad, США) с применением реагентов фирмы «Ампли-сенс» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва) в объеме 15 мкл (концентрация ДНК 200-300 нг). Для выявления генов синтеза микроцистинов и нодуларинов использовали универсальные праймеры HepF и HepR [11]. Реакцию проводили по следующей программе: 2 мин - 92°С и далее 35 циклов: 92°С - 20 с, 52°С - 30 с, 72°С - 1 мин, в последнем цикле этап элонгация удлинен до 6 мин. В положительной контрольной реакции использовали ДНК токсичного штамма Microcystis aeruginosa CALU 972, любезно предоставленного Л.Н. Волошко (БИН, С.Петербург), в отрицательной контрольной реакции - ДНК штамма Synechococcus sp. ВАС 98111.Анализ полученных ГЩР-продуктов проводили с помощью горизонтального электрофореза в 1% агароз-ном геле с использованием 0,5% ТАЕ буфера (20 мМ трис-ОН, 0,5 мМ ЭДГА, 7,8 мМ СН3СООН, рН 7,6). В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага 1, обработанную рестриктазой Pst I («Сиб Энзим», Новосибирск). Полосы с последовательностями длиной около 400 п. н. вырезали и проводили элю-цию нуклеотидного материала методом замораживания-оттаивания. Очищенные фрагменты клонировали в векторе pGEM-T-Easy Vector System (Promega, США) в компетентных клетках Е. coli штамм XL-1. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе Beckman CEQta 8800 (Beckman Coulter Inc., США). Полученные хромато граммы обрабатывали программой Chromas (www.technelysi-um.com.au/chro- mas.html). Нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями базы данных GenBank спомощьюпрограммыBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ). Выравнивание последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили при помощи пакета программ MEGA, версия 4.0 [12]. Полученные последовательности депонированы в базу данных GenBank под номерами GQ366342-GQ366346.Результаты и обсуждениеТемпература воды на поверхности оз. Котокельское в исследуемый период составляла 20°С, прозрачность по диску Секки достигала 1 м. В фитопланктоне доминировали цианобактерий Aphanocapsa holsatica (Lemm.) Cronb. et Kom. (82% общей численности). Такие виды, как Anabaena spiroides Kleb., Aphanocapsa conferta (W. et G.S. West) K.-Legn. et Cronb., Aphanothece clathrata W. et G.S. West, Microcystis aeruginosa (Ktitz.) Ktitz., Plankto-lyngbya contorta (Lemm.) An. et Kom., P. limnetica (Lemm.) K.-Legn. et Cronb., Coelosphaerium kuetzingianum Nag. и Snowella lacustris (Chodat) Kom. et Hindak составляли менее 6%. В колониальной слизи Microcystis aeruginosa встречалась Pseudanabaena voronichinii An.Озеро Котокельское интенсивно исследовалось в 30-50-х гг. прошлого столетия, что, в первую очередь, связано с его промысловым значением. Ежегодный улов рыбы в начале XX в. составлял более 1 200 т [13]. В этот период наиболее подробно исследованы температурный режим, гидрохимические параметры, флора и фауна озера. Показано, что воды озера летом значительно прогреваются, иногда до 25,8°С, прозрачность воды летом падает до 0,6-0,8 м вследствие сильного развития планктона, зимой увеличивается до 5 м, поверхностные слои воды достаточно насыщены кислородом, а у дна отмечается его дефицит [13].Уже длительное время исследователи отмечают доминирующую роль синезеленых водорослей (цианобактерий) в альгофлоре озера. В пробах планктона ранее обнаружены Merismopedia sp., Chroococcus sp., Microcystis pulverea, M. pulverea f. incerta, M. aeruginosa, Aphanothece sp., Gloeococcus schroeteri, Coelosphaerium sp., C. kuetzingianum, C. natans, Gomphosphaeria lacustris, Snowella rosea, Anabaena flos-aquae, A. scheremeti-evi, A. spiroides, A. circinalis, A. lemmermannii, Apha-nizomenon flos-aquae, Gloeotrichia ehinulata [13-16]. В Котокельском развивается «сибирский» комплекс видов, типичный для неглубоких хорошо прогреваемых продуктивных озер, видовой состав фитопланктона сходен с таковым, описанным Г.И. Поповской [17], для прибрежных участков бухт, соров и заливов Байкала. «Сибирский» комплекс видов значительно отличается от холоднолюбивого «байкальского», свойственного пелагиали Байкала, в котором преобладают диатомовые водоросли [17]. Первые исследователи озера относили Котокельское к группе водоемов, обособившихся от Байкала вследствие понижения уровня последнего. Г.Ю. Верещагин [18] и М.М. Кожов [14] считали, что озеро в прошлом могло быть заливом Байкала. В подтверждение ранее существовавшей связи между двумя озерами в Котокельском были найдены два вида байкальских гаммарид и эндемик Байкала - рачок Epischura baicalensis [19, 20]. В настоящее время от173Байкала оз. Котокельское отделено небольшой горной цепью, но связано с ним через систему мелких рек. Сток озерных вод в Байкал осуществляется на севере посредством небольших рек Исток и Турка.В нашей работе мы провели поиск микроцистин- и нодулярин-продуцирующих цианобактерий, содержащих домен аминотрансферазы в тсуЕ- и ndaF-тепах микроцистин и нодулярин-синтетаз. АМТ-домен, ам-плифицированный с помощью Нер-праймеров, ранее найден у Microcystis, Anabaena, Nodularia, Nostoc, Plank-tothrix, Phormidium из разных водоемов, причем его наличие 100% коррелировало с продукцией гепатотоксич-ных микроцистинов и нодуляринов [11]. При ПЦР-анализе с праймерами к гену АМТ нами получен положительный результат, что позволило сделать вывод о наличии в оз. Котокельском потенциально токсичных цианобактерий. Сравнительный анализ последовательностей из Котокельского и имеющихся в базе данных GenBank выявил высокую степень гомологии пяти ам-пликонов с дасуЕ-генами токсичных представителей рода Microcystis из разных мест обитания. Последовательности Microcystis sp. К1, К2 и К4 имеют 97-99% гомоло-гаи с последовательностями штаммов М. aeruginosa NIES-843, М. aeruginosa К-139 и М. viridis NIES-102, выделенных при токсичных цветениях озера Касумигаура, Япония [8, 11, 21]. Последовательности Microcystis sp. КЗ и К5 на 98% сходны с последовательностями штаммов М. aeruginosa PCC 7806, РСС 7005, UTEX В 2667 из озер Нидерландов, США и Канады и некультивируемого Microcystis sp. (EU099028) из планктона р. Нил, Египет [11]. Последовательностей с высокой степенью гомологии к генам нодулярин-синтетазы не найдено. При микроскопическом анализе фитопланктона оз. Котокельское виды рода Nodularia также не были обнаружены, как и в более ранних исследованиях.Филогенетический анализ последовательностей генов тсуЕ и ndaF показал, что представители родов Microcystis, Anabaena, Nodularia, Planktothrix и Phormidium образуют на древе отдельные кластеры с высоким уровнем bootstrap-поддержки (70-97%) (рис. 1). Полученные нами последовательности входят в кластер цианобактерий рода Microcystis, представленный, в основном, различными изолятами М. aeruginosa, который является самым известным и распространенным токсичным видом.(i.l(М. aeruginosa РСС 7005, AY817160. США, ко. Мендога М. aeruginosa UTEX В 2667. AY8171 6Z Kaiia.ii . оэ. Лнтл Рида М. acrugtno.su РСС 7806, АМ77В952, Нидерланды, водохр. Бракм&Е!59 J- Miovailix sp.. EU099028, Египет, р. Нал Microcystis tp. КЗ. GQ366344Vbeicracystis ар. К5. CQ36634677М. aeruginosa NIES-843, AP009552, Япония, оз. Касумигаура74М i/™//sNlES-102,AY817159, Япония, оэ. КасумигаураМ. aeruginosa К-139, AB03Z549. Япония, оз. КасумигаураMicrocystis sp. KZ. ПОЗД6МЗMicmcyslis sp. Kt. GQ366342L Microcystis sn. K4. GQ366345a;M. aeruginosa UTEX LB 2664, AY81716L. ЮАР, водохр. ВинбургWCyanobaL-terium 2006/PI8. EF579700, Кения, т. Эльментейра im)\OsciHaturia lPlaitktfllri.r) sp. 19R,AY81716570'Pltinktothrtx agardhit NIVA-CYA126/8. AJ441056 99 1 PhanmJhmi sp. 2-26Ы. AYS 17166 > Phmwidium sp. I -6c. AY81716799 I A.flos-aquae NIVA-CYA 269/6, EU9167725397Anabaena lenimenntinnii 66A, EU916759 Nodularia sphaawarpu PCC 7804, AY817171 i Nodularia spiunigena HEM.AYK1T17Q9991 i-Xmhilaria xpuwigena NSOR10, AY210783Nastoc sp. IO-102-I, AY566858Рис. 1. Корневое филогенетическое древо цианобактерий, основанное на результатах секвенирования генов микроцистин-и нодуляринсинтетаз (тсуЕ, ndaF), построенное с использованием метода ближайших соседей. Эволюционные расстоянияопределены по модели Кимуры. Цифрами показаны результаты «bootstrapw-aHarroa. Жирным шрифтом выделеныпоследовательности, полученные в данной работе. Масштаб соответствует двум заменам на 100 п. н.Ранее с помощью генетического маркера тсуА мы выявили присутствие токсикогенного М. aeruginosa в фитопланктоне Усть-Илимского водохранилища [22]. В Братском водохранилище найдена Anabaena sp., содержащая гены микроцистин-синтетазы [23]. Эти водохранилища ангарского каскада характеризуются как мезо-трофные с наличием эвтрофных участков. Содержание органических веществ и биогенов в водохранилищах в несколько раз превышает ПДК вследствие сбросов промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод из очистных сооружений городов и населенных пунктов Иркутской области [24]. На оз. Котокельском в послед-ние годы наблюдаются явные признаки эвтрофирования, проявляющегося, в первую очередь, в массовом развитии цианобактерий. Известно, что цианобактериальным «цветениям» водоемов и продукции токсинов способствует высокая концентрация биогенов, низкое отношение содержания азота к фосфору (N : Р < 25) и ряд других факторов [1, 2]. По последним данным, предельно допустимая концентрация фосфатов, принятая в России для рыбохозяйственных водоемов (0,05 мг/л), в оз. Котокельском превышена в 10 раз [10]. В лабораторных экспериментах показано, что концентрация микроцис-тина падает в несколько раз, когда при культивировании174M. aeruginosa в среде наблюдается минимальное содержание азота. Оптимальная температура для большинства токсин-продуцирующих цианобактерий лежит в пределах 20-25°С [25]. Анализ проб из 241 озера в США выявил, что концентрация микроцистинов повышается с увеличением трофического статуса озер [26]. Фактором, способствующим распространению цианобактериально-го «цветения», является способность Microcystis мигрировать в водоемах [27]. Представители карповых рыб, в частности карась и плотва, могут стимулировать развитие Microcystis напрямую - при транзитном прохождении данной цианобактерий через их кишечники, и косвенно: экскретируя фосфор и взмучивая донные отложения при добывании пищи, что приводит к резкому увеличению потока биогенов из осадков в толщу воды [28]. Вследствие аккумуляции микроцистина в рыбе в 100 г ее мышечной массы может содержаться 2,64-49,7 мкг/г микроцистина-LR, что в 1,3-25 раз больше нормы допустимого суточного потребления, установленной ВОЗ [29].Таким образом, анализ фитопланктона с помощью световой микроскопии показал, что в оз. Котокельском в августе 2008 г. наблюдалось массовое развитие колониальных цианобактерий Aphanocapsa и Microcystis. На основании полученных молекулярно-филогенетических данных можно заключить, что в озере присутствуют токсикогенные цианобактерий рода Microcystis. Наличие токсичных цианобактерий в оз. Котокельском представляет собой определенную угрозу для жителей Байкальского региона. Учитывая рекреационную и промысловую важность озера, наблюдающиеся здесь случаи массового отравления людей и животных, а также прямую водную связь с Байкалом, исследования по выявлению токсичных цианобактерий в Котокельском следует сделать регулярными.

Скачать электронную версию публикации