SOME FEATURES OF THE BAIKAL SPONGE MITOCHONDRIAL GENOME ORGANIZATION.pdf Губки (Porifera) являются древнейшими многокле-у позвоночных и в А+Т-богатой области у беспозвоноч-точными животными, дивергировавшими от своегоных. Последовательности вокруг сайта начала реплика-общего предка около 580 млн лет назад [1]. Губки сто-ции, которые могут формировать петли, являются до-ят у основания древа многоклеточных и представляютвольно консервативными и непосредственно участвуютсобой интересный объект для исследования процессовв инициации репликации [12, 13]. Даже для мтДНК че-эволюции животных. До сих пор не изучены механиз-ловека и быка эти вторичные структуры являются высо-мы, направления и скорость эволюции губок. Остаетсякоконсервативными и имеют характерное строение:незавершенной и систематика пресноводных губок, вА+Т-богатые петли и G+C-богатые стебли [13].частности байкальских.Из беспозвоночных в настоящее время наиболееВ оз. Байкал спонгиофауна представлена семейст-изученными являются митохондриальные геномы на-вами Lubomirskiidae (Rezvoj) и Spongillidae (Gray). Се-секомых. Например, у дрозофилы, как и у многих дру-мейство Lubomirskiidae является эндемичным и вклю-гих беспозвоночных, сайт начала репликации для ми-чает в себя 4 рода, представленные 14 видами [2]. Точ-норной цепи находится в средней части большого не-ный возраст байкальской эндемичной спонгиофауны докодирующего региона в А+Т-богатой области [14],сих пор не установлен. По палеонтологическим дан-причем образующиеся в этой области вторичныеным семейство Lubomirskiidae существовало в оз. Бай-структуры значительно отличаются между высокимикал уже около 3 млн лет назад [3]. Губки этого семей-таксонами (семействами, порядками) [15]. У близко-ства являются близкородственными и представляютродственных видов животных, напротив, может на-собой интересный объект для исследования современ-блюдаться высокое сходство последовательностей кон-ных процессов видообразования.трольного региона [16].Ранее было показано, что сравнительный анализУ более низкоорганизованных многоклеточных жи-традиционно используемых ядерных генов 18S рРНК,вотных, таких как книдарии, предполагаемые кон-ITS1 и ITS2 районов рРНК, равно как и митохондри-трольные регионы показаны в разных межгенных об-ального гена COX1, не позволяет достоверно опреде-ластях митохондриального генома. Эти районы содер-лить филогенетические отношения внутри байкальско-жат консервативные блоки последовательностей, аго эндемичного семейства [4, 5]. В связи с этим назрелатакже множественные прямые и инвертированные по-необходимость сравнения полных митохондриальныхвторы, способные к образованию стабильных шпилекгеномов.[17, 18]. Для губок недавно были представлены данныеВ последнее время изучению митохондриальных ге-о предположительном контрольном регионе, располо-номов губок уделяется большое внимание. Определеныженном в самом протяженном межгенном промежутке,нуклеотидные последовательности 23 полных митохон-обладающем признаками контрольного района высшихдриальных геномов губок класса Demospongiae (Sollas)многоклеточных [19].[6-10], в том числе байкальской губки Lubomirskia bai-Как известно, скорость эволюции митохондриаль-calensis (Pallas) [11] и Ephydatia muelleri (Lieberkuhn),ной ДНК животных в 10 раз выше скорости эволюциивероятного предка Lubomirskiidae [6]. Было показано,ядерного генома [20]. В результате исследований ми-что митохондриальные геномы этих двух видов губоктохондриальных геномов губок показано, что в отли-имеют не только идентичный набор генов, но и их рас-чие от других животных, большинство видов Demos-положение. Однако размеры геномов значительно отли-pongiae имеют низкую скорость эволюции нуклеотид-чаются (более чем на 4000 пн) за счет увеличения меж-ной последовательности генов мтДНК, в том числе игенных районов у Lubomirskia baicalensis [11].отряд Haplosclerida (Topsent), к которому относятсяОсобый интерес вызывают именно межгенные рай-семейства Lubomirskiidae и Spongillidae [21]. Однакооны митохондриальных геномов губок, учитывая то,имеются высоковариабельные некодирующие последо-что до сих пор нет данных о механизмах регуляциивательности, сосредоточенные между генами, протя-репликации и транскрипции мтДНК у этого типа жи-женность которых, по данным Д.В. Лаврова, составляетвотных. Как известно, у разных групп животных в не-от 2 до 24% от общего размера генома [6]. Интересно,кодирующих регионах расположены регуляторные по-что у книдарий, так же как и у губок, скорость эволю-следовательности, отвечающие за начало репликацииции митохондриальных генов ниже, чем у другихмитохондриального генома: в так называемой D-петлегрупп животных [22, 23]. При филогенетическом ис-209следовании книдарий было показано, что использование индивидуальных белок-кодирующих митохондри-альных генов позволяет достоверно разделить лишь семейства, а комплексное использование всех генов NAD позволяет определить филогенетические взаимоотношения только до уровня родов. Использование не-кодирующих регионов для этих целей также является проблематичным из-за их короткой длины и небольшого количества филогенетически-информативных сайтов, несмотря на высокую изменчивость данных районов. Однако некодирующие регионы были успешно использованы в качестве диагностических маркеров при определении границ видов [24] и популяционном анализе книдарий [17].Целью настоящей работы является выявление структурных особенностей митохондриального генома, отличающих байкальских эндемичных губок от космо-политных, и поиск предполагаемых регуляторных элементов в межгенных областях губок семейства Lubomirskiidae.Образцы губок были собраны в южной и центральной котловинах оз. Байкал во время экспедиционных работ в 2007 и 2008 гг. с глубин 5-25 м с помощью водолазов.Выделение суммарной ДНК образцов байкальских губок проводили путем лизиса ткани в SDS-буфере в присутствии протеиназы К по методу [25].Для амплификации межгенных фрагментов митохондриального генома были использованы праймеры на консервативные учаcтки последовательностей генов транспортных РНК: тРНК-Met и тРНК-Tyr: (trnY-trnML) 5'-GATGGCAGAGCGGTAATGC-3', (trnM-trnYR) 5'-GTAGGTTCGAGTCCTGCCT-3'. Полиме-разную цепную реакцию проводили в амплификаторе фирмы DNA Engin DYADTM (MJ Research) с параметрами: первичная денатурация 95ºС - 2 мин, затем 30-35 циклов в режиме - 96ºС - 2 c, 60ºС - 30 с, 72ºС -1 мин 30 с с последующей выдержкой при 72ºС в течение 10 мин.Амплифицированные фрагменты ДНК анализиро-вали методом горизонтального электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле. Выделение продукта из геля проводили методом замораживания-оттаивания. Опре-деление нуклеотидных последовательностей проводи-ли на секвенаторе CEQTM 8800 (Beckman Coulter).Множественное выравнивание нуклеотидных по-следовательностей межгенных районов осуществляли с использованием программ MAFFT v. 6.240 [26] и BioEdit. Построение вторичных структур межгенных районов осуществляли с помощью сервера Mfold (version 3.2) при температуре +4ºС [27]. Поиск откры-тых рамок считывания проводили с использованием программы Unipro UGENE, предсказание локализации трансмембранного домена в предполагаемом белке осуществляли с помощью сервера SignalP 3.0.В результате исследования были определены нук-леотидные последовательности фрагмента митохонд-риального генома, включающего два высоковариа-бельных участка между генами тРНК-Tyr и тРНК-Met, разделенные геном тРНК-Ile. Все 20 проанализирован-ных образцов губок относятся к байкальскому семей-ству Lubomirskiidae, к представителям 3 родов (номера в GenBank GU980930-GU980944, GU057852-GU057856). Длина амплифицированных последова-тельностей варьировала от 475 до 908 пн, что связано с присутствием множественных делеций / вставок.В районе между генами тРНК-Tyr и тРНК-Ile у всех исследуемых байкальских губок мы обнаружи-ли открытую рамку считывания, которая начинается с кодона AUG в позиции 28 в консервативном блоке у всех байкальских губок. У космополитной губки E. muelleri эта открытая рамка считывания не обна-ружена, что позволяет считать ее одним из отличи-тельных признаков губок семейства Lubomirskiidae. В результате сравнительного анализа аминокислот-ных последовательностей предполагаемого белка было выявлено, что найденная открытая рамка счи-тывания может кодировать 3 типа белков (рис. 1).Рис. 1. Расположение открытой рамки считывания на схеме митохондриального генома L. baicalensis (Lavrov, 2009): 1, 2, 3 - типы предполагаемых белков; блок С - консервативный район в 21 аминокислоту, блок D - трансмембранный доменВсе транслируемые последовательности на N-концегает 72-74 аминокислоты за исключением одной после-имеют высококонсервативную область в 21 аминокислотудовательности в 60 аминокислот, при этом все нуклео-(блок С), которая входит в состав района, определенноготидные делеции в пределах этого района кратны трем.как трансмембранный домен (блок D) с сайтом расщеп-Вторую группу составляют 8 экземпляров губок, у кото-ления между аминокислотами 37 и 38. Исходя из трехрых транслируемая последовательность оканчивается втипов предполагаемого белка, мы условно поделили всепозиции 38, именно в месте предсказанного сайта расще-исследуемые губки на 3 группы, не связанные с родовойпления. В третью группу входят оставшиеся 6 губок, упринадлежностью. В первую группу входят 6 экземпля-которых после консервативного блока кодируется другойров губок, у которых длина предполагаемого белка дости-белок, общая длина которого варьирует от 44 до 50 ами-210нокислот, при этом стоп-кодоном служит либо UAG, ли-бо, редко, UAA.Наличие консервативного региона, входящего в со-став предполагаемого трансмембранного домена, а также тот факт, что все нуклеотидные делеции в преде-лах предполагаемой транслируемой последовательно-сти кратны трем, дает нам возможность предположить, что этот белок действительно может существовать.Кроме открытых рамок считывания в межгенных районах митохондриальных геномов байкальских гу-бок также присутствуют множество прямых и инверти-рованных повторов.При моделировании вторичных структур в иссле-дуемых межгенных районах у всех байкальских губок показаны множественные инвертированные повторы, которые могут образовывать шпильки. Так, в пределах найденной открытой рамки считывания у большинства байкальских губок находятся три гомологичные шпильки (рис. 2-4), причем последняя шпилька нахо-дится либо непосредственно перед стоп-кодоном, либо включает его в себя (рис. 4). Эта шпилька была недавно описана в митохондриальном геноме L. baicalensis как H1s [11]. Первая шпилька является строго консерва-тивной (рис. 2).Рис. 2. Первая шпилька, консервативная среди L. baicalensis, B. intermedia profundalis и S. papyraceaРис. 3. Вторая шпилька: а - у B. intermedia profundalis и S. papyracea, б - у L. baicalensisРис. 4. Третья шпилька: а - у S. papyracea; б - у B. intermedia profundalis; в - у L. baicalensisЧетвертая шпилька располагается вне открытойУ всех байкальских губок в районе между генамирамки считывания около гена тРНК-Ile (рис. 5), опи-тРНК-Tyr и тРНК-Ile присутствует 5 консервативныхсанная ранее как H3 [11]. У L. baicalensis и S. pa-блоков последовательностей, сходство по которым ме-pyracea (Dybowski) имеется пятая гомологичная А+Т-жду всеми исследуемыми образцами губок варьируетбогатая шпилька, которая находится либо передот 68,4 до 100%, за исключением последовательностишпилькой № 4 (Н3), либо после нее (рис. 6). ПриS. papyracea, сходство с которой в этих блоках изменя-сравнении этих вторичных элементов заметна тенден-ется от 47 до 100%.ция удлинения самих шпилек у L. baicalensis в резуль-Для более подробного анализа распределениятате вставок комплементарных пар нуклеотидов (та-шпилек был выбран район между генами тРНК-Tyr икие вставки на рисунках выделены рамкой). СледуеттРНК-Ile представителей 3 родов губок: L. baicalen-отметить, что среди гомологичных шпилек у разныхsis, Baikalospongia intermedia profundalis (Rezvoj) игубок петли могут сильно варьировать.S. papyracea.211В результате моделирования вторичных структур у profundalis - 9 шпилек, и меньшее количество шпилек L. baicalensis обнаружено 12 шпилек, у B. intermedia присутствует у S. papyracea - 8.Рис. 5. Четвертая шпилька: а - у S. papyracea; б - у B. intermedia profundalis; в - у L. baicalensisАGTААT-G| А-Т |G GG-CG-C|Т-А|А-ТА-ТТ-АТ-АC-GC-GC-GC-GТ-АТ-АА-ТА-ТТ-АТ-А5'-Д-Т-3' 5'-А-Т-3'Рис. 6. Пятая шпилька: а - у S. papyracea; б - у L. baicalensisВ результате сравнительного анализа вторичныхи инвертированных повторов, но также и открытыхструктур выбранных последовательностей были обна-рамок считывания. Подробное изучение некодирую-ружены 4 гомологичные шпильки у всех трех видовщих регионов митохондриальных геномов губок по-губок и одна шпилька, которая имеется только у L. bai-зволит углубиться в понимание процессов регуляцииcalensis и S. papyracea, о которых говорилось ранее.репликации и транскрипции. В дальнейшем мы плани-В результате проведенных нами исследований пока-руем установить пригодность выбранных межгенныхзано, что увеличение размеров межгенных последова-районов в качестве молекулярно-генетических марке-тельностей митохондриального генома байкальскихров для идентификации близкородственных видов гу-губок происходит не только за счет появления прямыхбок семейства Lubomirskiidae.

Скачать электронную версию публикации