Genetically transformed root cultures (hairy roots) of Silene roemeri Friv. as the source of phytoecdysteroids.pdf Введение Культуры клеток, тканей и органов растений являются все более востребованными альтернативными источниками ценных вторичных метаболитов и используются для биосинтеза целого ряда веществ. Одним из относительно новых источников в биотехнологии получения БАВ растений является культура hairy roots («бородатые корни») - культура корней, полученная с помощью почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes, способной вызывать у многих видов растений болезнь корней, проявляющуюся в их неконтролируемом разрастании и ветвлении [1]. Генетическая трансформация достигается за счет встройки rolB генов с помощью Ri-плазмиды A. rhizogenes в геном растительной клетки. Данный ген кодирует тирозин-фосфатазу и используется для модуляции процессов вторичного метаболизма в культурах растительных клеток, стимулируя или ингибируя его [2]. В настоящее время разработаны некоторые технологии получения эк-дистероидов биотехнологическими методами (культуры клеток, тканей, трансформированных корней) [3]. В культуре клеток могут синтезироваться 20-гидроксиэкдизон (20E) и некоторые другие компоненты вторичного метаболизма у родов Ajuga, Serratula, Rhaponticum, Pteridium, Polypodium [4-7]. В ряде работ [8, 9] показано, что содержание экдистероидов в культуре клеток на порядок ниже, чем в природе. При продолжительном культивировании снижается общее содержание и изменяется долевое соотношение между индивидуальными соединениями. Кроме того, синтезируются неидентифи-цированные экдистероиды. Содержание 20E в культуре клеток для разных видов составляет от 0,001-0,01% у Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin [6] до 0,4-0,5% у Serratula coronata L., 0,7% у Ajuga reptans L. [4] и 0,4% у Ajuga lobata (D. Don) Kuntze [5]. Успешные результаты получены также с культурами клеток из заростков Polypodium vulgare L., производящими до 0,7% 20Е [7]. В ряде работ [8, 10] отмечено, что каллусные и суспензионные культуры экдистероидсодержащих видов синтезируют меньшее количество экдистероидов, чем культуры hairy roots, и для их биосинтеза требуется тканевая специализация. Эффективность использования культуры hairy roots показана для таких экдистероидсинтезирующих растений, как Ajuga turkes-tanica Briq. [11], A. reptans [12], Serratula tinctoria L. [13]. Представители многочисленного рода Silene L. (Caryophyllaceae), отличающиеся разнообразием структур и высокими уровнями экдистероидов, могут служить исходными объектами для культивирования каллусных культур и культуры hairy roots. Одним из видов суперпродуцентов фитоэкди-стероидов является Silene roemeri Friv. Экдистероиды в S. roemeri впервые выявлены разработанным способом на основе хроматографического анализа экстрактов семян [14]. Выделенные экдистероиды из интродуцирован-ных растений идентифицированы как 20-гидроксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В. Цель работы - получение культуры hairy roots Silene roemeri и изучение содержания фитоэкдистероидов в данной культуре. Материалы и методики исследования Методы получения и поддержания культуры hairy roots. Объектом исследования является Silene roemeri. Семена S. roemeri получены от растений, произрастающих на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада Томского государственного университета (СибБС ТГУ). Этот вид является суперпродуцентом экдистероидов. Для получения асептической культуры семена стерилизовали в 20%-ном растворе «Domestos» с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой и помещали на 0,6%-ный водный раствор агар-агара для проращивания. Условия культивирования семян - фотопериод 16/8 свет/темнота, 24±2°С. Штамм Agrobacterium rhizogenes А-4 RT получен из группы специализированного метаболизма корней Института физиологии растений РАН (г. Москва) в 2014 г. Культивирование проводили в чашках Петри на среде YEB, г/л: дрожжевой экстракт - 1, мясо-пептонный бульон - 5, сахароза - 6,6, MgSO4*7H2O - 3, агар - 7, pH = 7. Условия поддержания и сохранения культур: в темноте, первые двое суток при температуре +26°С, далее 28 суток при температуре +7°С. Трансформацию растений S. roemeri проводили по следующей схеме: стерильные проростки делили на лист, гипокотиль, корень, каждый тип эксплан-та делили на несколько частей и накалывали иголкой инсулинового шприца. Затем их инокулировали в течение 24 ч в жидкой питательной среде Мураси-ге-Скуга (MS) [15], содержащей суспензию агробактерий A. rhizogenes суточного возраста. После экспозиции инокуляты промывали стерильной средой У MS и помещали для проявления трансформации на агаризованную среду Уг MS с добавлением антибиотика - 500 мг/л цефотаксима. Через 3 недели после появления розетки корней их отделяли и пересаживали на ту же питательную среду с цефотаксимом (500 мг/л) для элиминирования бактерий. Повторную пересадку кончиков корней проводили на среду с 250 мг/л цефотаксима. Hairy roots культивировали на среде Гамборга (В5) [16] с добавлением 500 мг/л гидролизата казеина с интервалом 35 дней. Для пересадки брали примерно 200 мг сырой биомассы корней и помещали в конические колбы объемом 250 мл в 100 мл среды. pH доводили до 5,8 до автоклавирования. Условия культивирования: в темноте при 24±2°С и постоянном перемешивании при 90 об/мин («Elmi, S-3-02L», Латвия). В работе по оценке параметров роста и уровня биосинтеза вторичных метаболитов использована только одна линия hairy roots - hairy roots S. roemeri, полученная из частей корня. Сырую массу определяли после промывания корней от питательной среды под проточной водой и просушивания фильтровальной бумагой. Сухую биомассу определяли после высушивания корней при 100°С до постоянной массы. Индекс роста рассчитывали по формуле [17] (mmax - m0) I = m0 где m0 и mmax - масса корней в начале и конце культивирования соответственно. Наблюдения за параметрами роста культуры hairy roots проводили после 4-го и 5-го пассажей, для расчета индекса роста фиксировали сырую и сухую биомассу корней в начале и конце культивирования. Эксперименты проводили в двух повторностях. Статистическую обработку результатов и анализ полученных данных выполняли с использованием программы Microsoft Excel 7.0 и StatSoft STATISTICA 6.0 (LSD-test). Данные представлены в виде средних значений с доверительными интервалами, статистическая значимость различий определялась по Стьюденту (р < 0,05). Графики построены в программе Microsoft Excel 7.0. Методы исследоеания биологически актиеных еещесте растений. Экстракты из культур hairy roots получены методом реперколяции 70%-ным раствором этанола с последующим концентрированием с помощью ротационного испарителя («IKA RV 10 digital», Германия). Влажность сырья определяли на анализаторе влажности («ANB ML-50», Япония). Анализ содержания фитоэкдистероидов осуществляли в лаборатории фитохимии СБС методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. ВЭЖХ/УФ анализ выполнен на жидкостном хроматографе («Shimadzu LC20», Япония) с диодноматричным детектором. Хроматографическая колонка Perfect Sil Target ODS-3; 4,6^250 мм, размер зерна сорбента - 5 мкм, элюирование смесью ацетонитрила и изопропилового спирта (3:2; 5:2, v/v) в градиенте 0,1%-ной трифторуксусной кислоты от 15 до 35%. Скорость элюирования - 1 мл/мин. Аналитическая длина волны A,max = 254 нм для регистрации фитоэкдистероидов, время анализа 60 мин. Для нормально фазовой ВЭЖХ использовали следующую хроматографическую систему: подвижная фаза - циклогексан-изопропиловый спирт - вода (100:40:2.5, v/v), колонка Target 100 Sil. Для построения калибровочной кривой использовали смесь стандартных образцов 4 компонентов, включая 20Е. Смеси готовили путем разбавления 96%-ным этиловым спиртом. Концентрации 20Е в подготовленных смесях составили: 0,325; 0,1625; 0,08125 мг/мл. Отдельно снимали хроматограмму 20Е с концентрацией 1 мг/мл. Полученные данные имеют хорошую сходимость с хроматограммами смесей и были использованы при построении калибровочной кривой и уравнения для расчета содержания экдистероидов. Pасчет содержания экдистероидов осуществляли на основе площади пика 20Е в анализируемом образце экстракта и по уравнению кривой. Кроме того, этанольные экстракты анализировали качественно на пластинках для тонкослойной хроматографии (ТСХ), силикагель 60 F254 25 TLC, 20^20 см (алюминий) Merck в системе растворителей хлороформ -этанол в соотношении 3:1 (v:v). Результаты исследования и обсуждение Состав и содержание экдистероидов представителей рода Silene являются видоспецифичными и в значительной степени зависят от места произрастания, стадии развития и условий выращивания [14]. По этой причине использование культуры клеток и органов растений является важным альтернативным источником получения суммы и отдельных экдистероидов смолевок, а также модельной системой для изучения путей их биосинтеза. Трансформацию частей проростков S. roemeri наблюдали через 2 недели после инокуляции эксплантов со штаммами A. rhizogenes А-4 RT. Культура hairy roots идентифицирована по морфологическому признаку: на эксплан-тах развивались тонкие ветвящиеся корни 5-12 мм длиной. Полученные «бородатые корни» (рис. 1) культивировали на протяжении четырех пассажей, после чего проводили оценку параметров роста и развития. Индексы роста по сырой и сухой биомассе на 4-м и 5-м пассажах статистически значимо не различались (p < 0,05) (табл. 1). Рис. 1. Культура hairy roots Silene roemeri на среде В5, дополненной 500 мг/л гидролизата казеина. Масштаб: 1 см. Автор: А.А. Эрст [Fig. 1. Hairy roots Silene roemeri in B5 medium with an addition of 500 mgl-1 casein hydrolyzate. Scale: 1 cm. Photo by AA Erst] Т а б л и ц а 1 [Table 1] Индексы прироста биомассы культуры hairy roots Silene roemeri [Growth index of hairy roots Silene roemeri] № пассажа [Subculture cycle №] Сырая биомасса [Wet biomass] Сухая биомасса [Dry biomass] 4 8,3±1,4а 8,1±1,8а 5 9,6±1,9а 9,0±1,5а Примечание. Значения, за которыми следуют одинаковые буквы в колонке, статистически значимо не различаются (p

Скачать электронную версию публикации