Determination of optimal growth conditions for gram-positive bacterium Gulosibacter sp. BS38, destructor of toxic.pdf Введение Интенсивное развитие химической промышленности и промышленного производства в целом привело к тому, что различные неприродные химические соединения, токсичные для живых организмов, в больших количествах попадают в окружающую среду. Одним из распространенных поллютантов является epsz'loи-капролактам (далее - капролактам, КАП), ежегодное ми- Определение оптимальных условий роста грамположительной бактерии 211 ровое производство которого достигает миллионов тонн. Это связано с разнообразными сферами применения получаемых на его основе полимерных материалов (нейлон-6) в различных отраслях промышленности, сельского хозяйства, медицины и быта. В процессе производства и полимеризации КАП образуются отходы, содержащие определенное количество капролактама и низкомолекулярных фракций олигомеров [1]. В настоящее время производственные отходы сжигаются или подвергаются захоронению, что приводит к загрязнению почв и грунтовых вод токсичными поллютантами. По литературным данным, КАП вызывает дерматиты, лихорадку и судороги у людей [1], индуцирует хромосомные аберрации у млекопитающих [2], а также ингибирует рост микроорганизмов, играющих важную роль в поддержании экологического равновесия почв [3]. Отсутствие системных исследований микробных деструкторов КАП является фактором, сдерживающим развитие экологичных и экономически выгодных технологий биологической очистки производственных отходов и биоремедиации загрязненных почв. Первоначально способность разлагать КАП обнаружена у бактерий рода Pseudomonas, которые, как известно, способны утилизировать широкий спектр органических соединений, в том числе токсичные поллютанты [4]. Позднее мы показали, что способность бактерий Pseudomonas к деградации КАП детерминируется САР плазмидами, которые содержат генетическую информацию, необходимую для полной минерализации ксенобиотика [5]. В настоящее время описаны капролактам-утилизирующие бактерии, относящиеся к различным таксономическим группам, однако существуют лишь единичные сообщения о грамположительных бактериях-деструкторах [6]. Особенности биодеградации КАП различными бактериальными штаммами, их разнообразие и филогения остаются мало изученными. Известно, что эффективному микробному разложению ксенобиотиков в загрязненных почвах препятствуют такие факторы, как неоптимальные значения рН, температуры, а также высокое содержание токсичных поллютантов. По этой причине не все микроорганизмы-деструкторы могут быть использованы в технологиях очистки окружающей среды. Выделение новых штаммов-деструкторов ксенобиотиков, изучение физиологии их роста на селективных средах при различных условиях может рассматриваться как первый шаг исследования их потенциальных возможностей для использования в биологической очистке производственных отходов. Цель работы - изучить характер роста бактерии-деструктора Gulosibacter sp. BS38 в минеральной среде с капролактамом в качестве единственного источника углерода и энергии в зависимости от концентрации субстрата, рН среды и температуры. Материалы и методики исследования Штамм-деструктор Gulosibacter sp. BS38 (JN787120) выделен ранее из почвенных образцов, загрязненных отходами производства КАП и нейло- 212 Т.З. Есикова на-6 «ОАО ЩекиноАзот» (г. Щекино, Тульская область), методом накопительной культуры [7]. Исследуемый штамм утилизировал КАП в качестве единственного источника углерода и энергии в отличие от ранее описанных бактерий-деструкторов, требующих для деградации ксенобиотика дополнительных источников углерода или факторов роста [8]. При изучении влияния условий культивирования на рост штамма оценивали такие параметры, как оптическая плотность (ОП), длительность лаг-фазы, а также максимальная удельная скорость роста культуры (μmax). Для определения условий оптимального роста штамма BS38 использовали жидкую минеральную среду Эванса [7], варьируя в зависимости от задачи эксперимента температуру, значение рН или количество субстрата в среде. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, в течение 100-120 ч в шейкере-инкубаторе («Multitron Pro», Швейцария) при 180 об/мин. Интенсивность роста культур оценивали спектрофотометрически по изменению ОП («UV Specord», Германия) при длине волны 590 нм. В качестве инокулята использовали культуру, выращенную на этой же среде (рН 7,5, температура культивирования 28°С, концентрация КАП 1,0 г/л) до оптической плотности 0,5, что по предварительным данным соответствовало примерно середине экспоненциальной фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием («Rotanta 460R», Германия) при 5000g, в течение 10 мин и вносили в колбы со стерильной средой до ОП 0,05. Температурный диапазон и оптимум определяли при 15, 28 и 37°C. В этом случае концентрация КАП составляла 1,0 г/л, а рН среды 7,5. Влияние рН на рост культуры оценивали в интервале от 6,0 до 10,0 с шагом в 0,5 единицы при температуре 28°С. Изменения рН среды осуществляли добавлением 3М NaOH или 1М HCl, после чего стерильно вносили раствор КАП до конечной концентрации 1,0 г/л. Для изучения влияния концентрации КАП на рост исследуемого штамма субстрат вносили в среду в количестве 0,5 и далее от 1,0 до 15,0 г/л (вес/об), увеличивая концентрацию ксенобиотика на 1,0 г/л. Бактерии культивировали при температуре 28°С и рН среды 7,5. Каждый вариант опыта выполнен в трех биологических повторностях. Для каждого значения ОП вычислены среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего арифметического. Статистическая обработка полученных данных и построение графиков выполнены в программе Microsoft Excel 2007. По полученным кривым роста вычисляли длительность лаг-периода и максимальную удельную скорость в экспоненциальной фазе роста по формуле In X1 - In X0 /^max =---f-t---’ t1 - t0 где X0 и Х1 - значения биомассы, соответствующие времени роста t0 и t1. Об увеличении биомассы судили по изменению оптической плотности культуральной жидкости [9]. Определение оптимальных условий роста грамположительной бактерии 213 Результаты исследования и обсуждение Проведенное ранее изучение морфологических, физиолого-биохимических признаков, а также анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма BS38 показало, что он является представителем класса Actinobacteria и относится к роду Gulosibacter [7]. Как известно, актинобактерии способны разлагать широкий спектр природных и man-made органических соединений [10], однако штамм-деструктор КАП, относящийся к роду Gulosibacter, описан впервые. Примечательно, что род Gulosibacter выделен в самостоятельный недавно и представлен в настоящее время всего 2 штаммами, причем один из них - G. molinativorax ON4t, выделенный в Португалии, способен осуществлять деградацию гербицида молината [11]. Интересно, что КАП является промежуточным продуктом разложения молината. Дальнейшее превращение КАП у G. molinativorax ON4T и Gulosibacter sp. BS38 происходит, по всей видимости, по общему биохимическому пути. Видовой статус штамма Gulosibacter sp. BS38 требует уточнения, поскольку высока вероятность принадлежности штамма BS38 к виду G. molinativorax. Возможность применения микроорганизмов для биологической очистки производственных отходов, содержащих КАП, в настоящее время только исследуется. Показано, что скорость и степень деградации КАП в сточных водах в первую очередь зависят от концентрации ксенобиотика [12]. По имеющимся данным, количество КАП в стоках может варьировать от 1 360 до 3 600 мг/л в зависимости от конкретного предприятия [1, 2], поэтому толерантность микроорганизмов-деструкторов к высоким концентрациям ксенобиотика может иметь принципиальное значение для их использования в технологиях биологической очистки отходов. Следует отметить, что концентрация КАП, оптимальная для большинства описанных бактерий-деструкторов, составляет 1,0-2,0 г/л [13-15]. Так, увеличение концентрации поллютанта до 5,0 г/л приводило к существенному снижению скорости роста и урожая клеток у бактерий Pseudomonas, а при концентрации КАП 10.0 г/л их рост полностью прекращался [13]. Максимальное количество КАП, при котором наблюдался рост бактерий Arthrobacter citreus и Alcaligenes faecalis, - 5,0 и 6,0 г/л соответственно [14], а штамм Proteus sp. NTS2 демонстрировал слабый рост при 10,0 г/л субстрата в среде [15]. Изучение ингибирующего влияния капролактама на рост исследуемого штамма проводили в диапазоне концентраций от 0,5 до 15,0 г/л. Длительность лаг-фазы при концентрации КАП 0,5 г/л минимальна (5 ч) по сравнению с другими вариантами опыта. Культура быстро достигала стационарной фазы роста, однако ОП культуры невысокая (0,55), что может свидетельствовать об исчерпании субстрата (рис. 1, А). Максимальная удельная скорость роста в этом случае составляла 0,057 ч-1. При концентрации КАП 1,0 и 2,0 г/л культура достигала наибольших значений ОП (0,71 и 0,73), удельная скорость роста также максимальная - 0,094 и 0,086 ч-1 соответственно. Несмотря на 214 Т.З. Есикова то, что рост штамма начинался после более длительного лаг-периода (около 15 ч), можно считать эти концентрации субстрата оптимальными. Дальнейшее повышение количества КАП в среде сопровождалось пропорциональным увеличением лаг-периода, замедлением удельной скорости роста, а также уменьшением оптической плотности культуры. При концентрации субстрата 10,0 г/л наблюдалось резкое снижение удельной скорости роста культуры (μmax 0,039 ч-1), однако он не прекратился полностью. Максимальное количество КАП, при котором еще сохранялся рост бактерий, составило 12,0 г/л, что выше, чем у описанных ранее бактерий-деструкторов КАП [13-15]. Длительность лаг-фазы в этом случае достигала 33-34 ч, ОП - 0,29, а μmax - 0,018 ч-1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый штамм способен расти при высоких концентрациях токсичного субстрата и может быть использован для очистки стоков, содержащих поллютант в широком диапазоне концентраций. А B Рис. 1. Динамика роста штамма Gulosibacter sp. BS38 в жидкой минеральной среде при различн^іх концентрациях epsilon-капролактама (г/л) (A), рН среды (B) и температуре культивирования (C). Представлены усредненные по трем измерениям данные с доверительными интервалами) [Fig. 1. Growth dynamics of Gulosibacter sp. BS38 in a liquid mineral medium at different epsilon-caprolactam concentrations, g/L (A), initial pH of the medium (B) and incubation temperature (C)] Определение оптимальных условий роста грамположительной бактерии 215 Изучение влияния рН и температуры культивирования на параметры роста штамма BS38 проводили при концентрации субстрата 1,0 г/л. Установлено, что лучший рост культуры наблюдался при 28°С и рН 7,5 (рис. 1, B, C). При этом температура культивирования преимущественно влияла на удельную скорость роста культуры (μmax 0,094, 0,052 и 0,038 ч 1 при 28, 37 и 15°С соответственно), тогда как изменение рН среды приводило также к значительному увеличению длительности лаг-фазы и снижению ОП (рис. 1, B). Следует отметить, что удельная скорость роста клеток и ОП культуры выше при значениях рН 9,0 и 10,0 (μmax 0,036 и 0,024 ч '), чем при рН 6,0 (μmaχ 0,019 ч '), что позволило отнести исследуемый штамм к алкалотоле-рантным бактериям. Поскольку стоки, образующиеся при производстве и переработке КАП, представляют собой щелочные растворы [16], то алка-лотолерантные бактерии-деструкторы являются наиболее перспективными для использования в биотехнологиях очистки производственных отходов. Заключение В данном исследовании установлено, что новый грамположительный штамм-деструктор Gulosibacter sp. BS38 обладает уникальной способностью использовать ер^у'/ои-капролактам в качестве единственного источника углерода в широком диапазоне значений температуры, рН среды и концентрации субстрата. Выявлено, что количество токсичного субстрата и показатель рН среды оказывают существенное влияние на удельную скорость роста, длительность лаг-фазы и оптическую плотность, тогда как температура культивирования преимущественно влияет только на удельную скорость роста культуры. Подобраны оптимальные условия культивирования бактерии: рН 7,5, температура 28°С, концентрация субстрата 1,0-2,0 г/л. Полученные в данной работе результаты являются основой для дальнейшего исследования возможности применения штамма Gulosibacter sp. BS38 для биологической очистки производственных отходов предприятий по производству epsilon-капролактама и полимеров на его основе.

Скачать электронную версию публикации