Estimation of genomic DNA damage in populations of the marsh frog (Pelophylax ridibundus Pallas, 1771) of the Bel.pdf Сокращения [Abbreviations]: DDI - индекс ДНК-комет [DDI - DNA damage index (comet assay)]; ПДК - предельно допустимая концентрация [Maximum permissible concentration]. Для цитирования: Снегин Э.А., Бархатов А.С., Киселев В.В., Юсупов С.Р., Снегина Е.А. Оценка степени повреждения геномной ДНК популяций озерной лягушки (Pelophylax ridibundus Pallas, 1771) Белгородской агломерации методом ДНК-комет // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. № 55. С. 58-76. doi: 10.17223/19988591/55/4 Введение Антропогенное загрязнение водных объектов - серьезная проблема устойчивости водных экосистем [1]. Основные источники загрязнения водных объектов - сточные воды, смывы сельскохозяйственных удобрений, Оценка степени повреждения геномной ДНК 59 пестицидов и автомобильных дорог [2]. Загрязнители, внесенные в водные экосистемы, приводят к геохимическим изменениям, что, в свою очередь, снижает качество физико-химических параметров водных объектов [3]. Многие из поллютантов, обладая высокой устойчивостью, представлены опасными мутагенами и канцерогенами. Вызванные ими нарушения в структуре и свойствах ДНК и РНК организмов могут иметь отдаленные последствия и сказываться на жизнедеятельности последующих поколений [4, 5]. Для объективной и качественной оценки воздействия генотоксичных поллютантов используются различные виды-биоиндикаторы. Наиболее информативными среди них являются гидробионты, так как водные объекты в первую очередь подвергаются воздействию широкого спектра загрязнителей окружающей среды [6, 7]. Бесхвостые земноводные, являясь связующим звеном в пищевых цепях, охватывающих водные и наземные сообщества, выступают в качестве важного компонента биоты водно-болотных угодий [8]. Тонкая и проницаемая кожа, а также жаберное дыхание на личиночной стадии позволяют этой группе животных активно накапливать поллютанты в организме [9]. В научной литературе описан ряд методов оценки степени повреждения ДНК: анализ хромосомных аберраций [10], обмен сестринских хроматид [11], щелочная элюция [12], анализ микроядер [13] и др. Однако в последние годы наиболее востребованным для этих целей является метод ДНК-комет (Comet assay), который позволяет оценивать повреждения генетического материала в результате действия большого спектра мутагенов [14-16]. Преимуществами метода являются его доступность и способность обнаруживать начальные и неспецифические повреждения ДНК в различных тканях. При этом повреждения ядерных нуклеиновых кислот просматриваются на уровне отдельных клеток, что делает его пригодным для большинства типов эукариотических организмов. Кроме того, метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать реакции организмов на самых ранних этапах воздействия генотоксикантов [17]. Гель-электрофорез изолированных клеток1 применяют в различных областях исследований, главным образом, при оценке безопасности химических веществ и лекарственных средств, для выявления степени эффективности репарации ДНК, а также в биомониторинге природных популяций [18]. Данный метод позволяет обнаружить разрывы цепей ДНК, которые при проведении гель-электрофореза образуют так называемые хвосты, или «кометы». При этом размер наблюдаемого хвоста указывает на степень повреждения ДНК [19]. В проведенном нами ранее предварительном исследовании с помощью метода ДНК-комет выявлено статистически значимое (р < 0,05) увеличение индекса ДНК-комет в одной популяции озерной лягушки, обитающей в условиях антропогенного загрязнения [20]. В дальнейшем эти исследования продолжены. 1 Гель-электрофорез изолированных клеток является синонимом метода ДНК-комет. [The Comet Assay also called single cell gel electrophoresis]. Э.А. Снегин, А.С. Бархатов, В.В. Киселев и др. 60 Цель данной работы - оценить с помощью метода ДНК-комет уровень повреждения ДНК в популяциях P ridibundus, обитающих в г. Белгороде и его окрестностях. Материалы и методики исследования Объект исследования - озерная лягушка (Pelophylax ridibundus Pallas, 1771). Данный вид адаптирован к жизни в условиях антропогенного влияния и активно заселяет трансформированные биотопы [8]. Отбор животных проводен в 6 точках г. Белгорода и его окрестностей (рис. 1, табл. 1). При описании биотопов использована классификационная схема, предложенная В.Л. Вершининым [21]. Все работы с подопытными животными в исследовании проведены в соответствии с международными этическими стандартами [22]. Из каждой точки исследования отобрано по 5 половозрелых особей, что составляло небольшую часть популяции. Животных перед вскрытием наркотизировали диэтиловым эфиром. Ввиду высокой чувствительности метода для предотвращения получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов анализ проводили в день сбора. В качестве материала для исследования использовали печень животного: данный орган обладает высокой чувствительностью к действию генотоксикантов и является основным местом биотрансформации ксенобиотиков [23]. Таблица 1 [Table 1] Пункты сбора [Collection sites] No Название пункта [Collection sitel Описание биотопа [Description of the biotope] Координаты [Coordinates] 1 Северский Донец [Seversky Donets] р. Северский Донец, г Белгород. Промышленная застройка [Seversky Donets river, Belgorod. Industrial buildings] 50°35'31.5"N 36°36'35.6"E 2 Оскочное [Oskochnoe] Пруд Оскочное, г. Белгород. Малоэтажная застройка [Oskochnoye pond, Belgorod. Low-rise development] 50°38'52.1"N 36°33'29.6"E 3 Ячневский [Yachnevskiy] Пруд Ячневский, г. Белгород. Малоэтажная застройка [Yachnevskiy pond, Belgorod. Low-rise development] 50°38'23.1"N 36°34'48.2"E 4 Севрюково [Sevrukovo] р. Разумная, Белгородский район. Окрестность с. Севрюково. Зеленая зона [Razumnaya river, Belgorod municipal district. The vicinity of Sevrukovo village. Green area] 50°36'55.3"N 36°46'21.9"E 5 Разумное [Razumnoe] Устье р. Разумная, г. Белгород. Малоэтажная застройка [Razumnaya river mouth, Belgorod. Low-rise development] 50°31'51.8"N 36°38'57.5"E 6 Везелка [Vezelka] р. Везелка, г. Белгород. Многоэтажная застройка [Vezelka river, Belgorod. High-rise development] 50°35'36.8"N 36°34'09.1"E 61 Оценка степени повреждения геномной ДНК Рис. 1. Пункты сбора Pelophylax ridibundus: 1 - Северский Донец; 2 - Оскочное; 3 - Ячневский; 4 - Севрюково; 5 - Разумное; 6 - Везелка [Fig. 1. Collection sites Pelophylax ridibundus: 1 - Seversky Donets; 2 - Oskochnoe; 3 - Yachnevskiy; 4 - Sevrukovo; 5 - Razumnoe; 6 - Vezelka] По завершении эвтаназии животного незамедлительно проводили вскрытие и выделение анализируемого органа. Ткань (150-200 мг) гомогенизировали на льду, затем переносили в пробирки с 2 мл свежеприготовленного охлажденного до +4 °С фосфатно-солевого буфера (pH 7,5), содержащего 20 mM динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA-Na2) и 10% диметилсульфоксид (ДМСО), дважды отмывали от клеток крови и растирали стеклянной палочкой в свежем буфере. Для осаждения крупных фрагментов ткани пробирки выдерживали 5 мин при комнатной температуре, после чего переносили 1,5 мл верхнего слоя в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в микроцентрифуге 5415 R («Eppendorf», Германия) при 1000 g в течение 10 мин при +4 °С. Супернатант удаляли, осадок клеток разводили в 1 мл охлажденного до +4 °С фосфатного солевого буфера. Для получения микропрепаратов 60 мкл клеточной суспензии смешивали с 240 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы (Тпл

Скачать электронную версию публикации