Accumulation and toxic effects of boron-containing drugs in SW-620 models.pdf Сокращения: БНЗТ - бор-нейтронозахватная терапия; BPA борфенилаланин; BSH - боркаптат. Введение По данным Всемирной организации здравоохранения, колоректальный рак входит в тройку лидеров по причинам смерти среди прочих онкологических заболеваний [1]. Данный вид онкопатологии стоит на втором месте по распространенности в США, по данным Американского онкологического сообщества [2], и заболеваемость в других экономически развитых странах продолжает расти. Колоректальный рак сопровождается симптомами на поздних стадиях, поэтому часто врачам приходится бороться с распространенным опухолевым процессом. Бор-нейтронозахватная терапия (БНЗТ) -это форма бинарной лучевой терапии, основанная на высокой способности нерадиоактивного ядра 10В поглощать тепловой нейтрон, в результате чего образуются а-частица и ядро лития-7. Данные продукты реакции 10B(n,a)7Li имеют высокий темп торможения и малую длину пробега, таким образом, выделенная энергия ограничивается размером одной клетки [3]. БНЗТ ранее активно применялась для лечения пациентов со злокачественными глиомами [4], меланомой [5], раком головы и шеи [6]. Описан также ряд онкологических заболеваний, которые пытались лечить при помощи БНЗТ: метастазы в печень, рецидивирующие опухоли молочных желез, менингиома и меланома вульвы [7-10]. Для определения возможности проведения БНЗТ на ускорительном источнике нейтронов в качестве опции лечения пациентов с диагнозом колоректальный рак необходимо провести предварительные исследования на клетках и лабораторных животных. На первом этапе необходимо провести оценку безопасности применяемых препаратов in vitro и in vivo, а также изучить биораспределение 10В в организме для определения времени максимальной концентрации его в опухоли и минимального в органах и крови. Такой подход позволяет подобрать оптимальные дозы борсодержащих препаратов и время для облучения, когда наибольшее лучевое воздействие приходится на опухолевые клетки, накопившие максимум бора. В большинстве работ по БНЗТ представлены сертифицированные борсодержащие препараты L-p-борфенилаланин (BPA) и боркаптат натрия (BSH). Командой под руководством A. Soloway в США [11] первым синтезирован BSH, который имеет в своем составе 12 атомов 10В. Особенностью его накопления является то, что содержания бора в опухоли и в крови приблизительно сопоставимы, однако соотношение концентрации в опухолевой и окружающей здоровой тканях составляет 3/1 и является подходящим для проведения БНЗТ. Механизм накопления бора в опухоли - пассивная диффузия через опухоль-ассоциированные капилляры. Исследователи из США Накопление и токсические эффекты борсодержащих препаратов 99 вводили BSH внутривенно и внутрикаротидно крысам с внутримозговой опухолью F98. При применении препарата в концентрации 65 мг/кг массы тела летальных случаев и признаков токсичности не описано [12]. В исследованиях Morris et al. отмечено, что при внутривенном введении BSH в дозе 100 мг/кг летальных случаев также не наблюдалось, однако доза 200 мг/кг оказывалась летальной для крыс [13]. BPA, который начали применять для лечения пациентов с меланомой в 1987 г. [14], содержит только 1 атом 10В в своей структуре. Идея его использования основана на повышенном захвате предшественников меланина меланомой [15]. Однако отмечено также его накопление в беспигментных опухолях, что позволило использовать его для терапии других злокачественных новообразований [16]. Ученые из США изобрели модель для прогноза фармакокинетики BPA, вводимого пациентам внутривенно. В своей работе они предлагают использовать препарат в дозировке 350 мг/кг [17]. Финские ученые под руководством L. Kankaanranta использовали BPA в дозе 290450 мг/кг в клинических исследованиях, однако при внутривенном введении максимальной дозировки отмечены побочные эффекты [18]. Цель данной работы - определение безопасных концентраций препаратов BPA и BSH для клеточной линии SW-620 и оценка биораспределения 10В после введения этих препаратов иммунодефицитным мышам SCID с гетеротопическими SW-620 ксенографтами. Материалы и методики исследования Препараты. В исследовании использованы BPA и BSH, обогащенные изотопом 10В (> 99,5%, Katchem Ltd., Чехия). Раствор BPA готовили на деионизованной воде с добавлением фруктозы (Sigma-Aldrich, США) в молярном избытке [19]. Концентрация 10В в готовом растворе составляла 3 350 мкг/мл. BSH растворяли в растворе натрия хлорида 0,9% (Renewal, Россия), с концентрацией 10В 13 630 мкг/мл. Полученные растворы хранили в холодильнике при температуре +4 °С. Исследование цитотоксичности BPA и BSH in vitro. Линия клеток колоректальной аденокарциномы человека (SW-620) получена в ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ИЦИГ СО РАН (Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). Для определения безопасной концентрации препаратов BPA и BSH применен МТТ-тест. Клетки высевали в 96-луночный планшет по 2»104 клеток/лунку. Через сутки в разные лунки добавлены препараты бора до конечных концентраций 10В в растворе: 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1 280 мкг/мл по 5 повторов для каждой экспериментальной точки, клетки инкубировали в двух временных интервалах - 24 и 48 ч. Контроль - клетки, которые инкубировали без препаратов. Затем в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H] тетразолия с мета- А.И. Касатова, В.В. Каныгин, Е.Л. Завьялов и др. 100 зульфатом феназина (Cell Titer 96® AQueous One Solution, Promega, США). Планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 2 ч, оптическую плотность растворов определяли на планшетном ридере «BioRad iMark Microplate reader» (США) при длине волны 490 нм. Данные представлены как процент выживаемости относительно контроля. Токсичность при внутривенном введении препаратов бора мышам SCID в стандартных концентрациях. Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманного отношения к животным в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и соответствуют принципам Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, изданного «US NIH» (№ 85-23, пересмотрено в 1985 г.). Для определения токсичности препаратов BPA и BSH в стандартных (по данным литературы) дозировках проводили их внутривенное введение (в ретроорбитальный синус) животным, по 3 особи на каждый препарат. Животным из контрольной группы внутривенно вводили натрия хлорид 0,9% (Renewal, Россия). Три раза в неделю регистрировали следующие параметры: состояние кожных покровов, места инъекции, двигательную активность и поведение. Через 2 мес после начала эксперимента мышей подвергали плановой эвтаназии в соответствии с требованиями гуманного отношения к животным с последующим забором органов: почки, печень, легкие, мозг и сердце, которые фиксировали в растворе формальдегида. Биораспределение 10В при внутривенном введении препаратов BPA и BSH мышам с подкожными ксенографтами SW-620. В работе использована культура опухолевых клеток колоректальной аденокарциномы человека SW-620, полученная из ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ИЦИГ СО РАН. Клетки культивировали в среде DМЕМ/ F12 (1:1) (Биолот, Россия), содержащей 10% фетальной сыворотки (Gybco, США), 50 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Россия). Исследование выполнено на иммунодефицитных самцах мышей SCID (SHO-PrkdcscldHrta) SPF-статуса в возрасте 6-7 нед с гетеротопической опухолью, полученной после инъекции суспензии, содержащей 1*107 клеток SW-620 подкожно в область правого бедра. Животных содержали в Центре генетических ресурсов лабораторных животных на базе ЦКП «SPF-виварий» (ИЦИГ СО РАН) однополыми семейными группами по 2-5 особей в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) системы Opti Mice (Animal Care Systems) в контролируемых условиях: световом режиме (свет/темнота 14/10) с рассветом в 01:00, при температуре 22-26 °C, относительной влажности 30-60%. Корм Ssniff (Германия) и вода после обратного осмоса, обогащенная минеральной смесью «Северянка», животным предоставлялись ad libitum. Всех животных разделили на 5 групп на каждый препарат бора (4 экспериментальные и 1 контрольная), по 3 самца мышей в каждой группе. По достижении ксенографтами объемов 300-500 мм3 или 8-9 мм в диаметре начинали введение мышам изучаемых препаратов. Препараты бора вводили Накопление и токсические эффекты борсодержащих препаратов 101 внутривенно в ретроорбитальный синус: ВРА в концентрации 350 мкг/г и BSH - 100 мкг/кг. Через 1, 2, 3 и 4 ч после инъекции животных подвергали эвтаназии в соответствии с требованиями гуманного отношения к животным, проводили забор органов (кровь, мозг, опухоль, почки, печень), которые замораживали и хранили при -20 °С. Пробоподготовку части материала (кровь, почки) проводили методом мокрого озоления с применением концентрированной азотной кислоты HNO3 («ос.ч.» 27-5) и нагревания до 90 °С на Dry Block Heater 2 («IKA», Германия), для пробоподготовки образцов с высоким содержанием жиров (мозг, опухоль, печень) использовали микроволновую печь MARS-5 (США) и автоклавы НР-500 и смесь HNO3 и 30%-ной Н2О2 (1:0,2). Для оценки концентрации 10В в образцах применяли метод атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (АЭС ИСП) на спектрометре высокого разрешения iCAP-6500 («Thermo», США) в ИНХ СО РАН (Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН, г. Новосибирск, Россия). Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и пакета STATISTICA 8 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при 95% (р < 0,05). Значения объемов опухоли приведены как среднее (М) и стандартное отклонение (SD). Результаты исследования и обсуждение Исследование цитотоксичности BPA и BSH in vitro. Для проведения БНЗТ необходимо выбрать препарат и оценить его безопасность. Для этого авторы использовали МТТ-тест, который позволяет выявить ранние цитотоксические эффекты препаратов, содержащих бор. Ранние цитотоксические эффекты препарата BSH отмечены при концентрации 10В 640 мкг/мл после инкубации 24 (р = 0,009) и 48 часов (р = 0,009), когда выживаемость клеток снизилась до 87 и 80,5% соответственно. Максимально безопасной концентрацией BSH для in vitro исследований можно считать дозу 320 мкг/мл 10В, так как выживаемость клеток в опытных группах при этом статистически значимо не отличалась от контрольной и составила 96 и 95,5% для 24 и 48 ч инкубации с препаратом соответственно. Для препарата BPA первые статистически значимые отличия по выживаемости клеток в опытных и контрольных группах появились при концентрации 10В в растворе 320 мкг/мл как после 24, так и 48 ч инкубации с препаратом. При этом процент выживших клеток - 65 (р = 0,016) и 51 (р = 0,009) соответственно. Безопасная концентрация на уровне 320 мкг/мл, когда выживаемость статистически значимо не снижалась и уменьшалась не более чем на 9% (рис. 1). Ранее нами проведены исследования цитотоксичности этих борсодержащих препаратов на других клеточных линиях. В результате показано, что А.И. Касатова, В.В. Каныгин, Е.Л. Завьялов и др. 102 для линии U87 глиобластомы человека максимальной безопасной концентрацией 10В при инкубации с BPA в течение 24 ч является доза 160 мкг/мл, а при использовании BSH - 80 мкг/мл [20]. Рис. 1. Определение дозозависимых цитотоксических эффектов препаратов BPA и BSH при помощи МТТ-теста через 24 и 48 ч с начала инкубации (M±SD) (*р < 0,05; **р < 0,01) [Fig. 1. Determination of dose-dependent cytotoxic effects of BPA and BSH drugs using MTT test 24 and 48 hours after the start of incubation (M±SD) (*р < 0,05; **р < 0,01)] По-видимому, линия U87 более чувствительна к препаратам бора, чем SW-620. Кроме того, изучены также поздние цитотоксические эффекты BPA и BSH на линию глиобластомы при помощи клоногенного теста. В результате установлено, что максимально безопасна концентрация 10В 40 мкг/мл [20]. Другая группа ученых, используя клоногенный анализ выявила, что инкубация клеток U251, T98G и V-79 с BPA в концентрации 10B 100 мкг/мл в течение 2 ч не приводила к снижению пролиферации клеток [21]. В исследовании, проведенном U. De Simone et al. на линиях человеческой астроцитомы D384, нейробластомы SH-SY5Y и первичных фибробластах F26, также изучали цитотоксичность BPA при помощи МТТ-теста, и обнаружено, что инкубация клеток в течение 24 и 48 ч в концентрации 10В 40-100 мкг/мл значительно снижала жизнеспособность опухолевых линий, в то время как жизнеспособность фибробластов снижалась только при концентрации 10В 100 мкг/мл [22]. Определение токсичности препаратов бора при внутривенном введении мышам SCID в стандартных концентрациях. Оценка токсичности препаратов in vivo выявила возможность внутривенного введения BPA в дозировке 350 мг/кг массы тела, BSH - 100 мг/кг массы тела. Через 2 мес после введения препаратов летальности не наблюдалось, активность животных из Накопление и токсические эффекты борсодержащих препаратов 103 опытных групп соответствовала активности в контрольной группе. По данным гистологического исследования, морфологических изменений дистрофического порядка через 2 мес после введения препаратов не обнаружено (рис. 2). Рис. 2. Тканевые срезы мышей SCID: 1 - почка. Полнокровие сосудов; 2 - печень. Гепатоциты без существенных патологических изменений. Центральные вены расширены, полнокровны; 3 - легкие. Полнокровие сосудов интерстиция и межальвеолярных перегородок; 4 - мозг. Минимальный перицеллюлярный отек; 5 - сердце. В камерах кровь. Автор фото О.И. Соловьева [Fig. 2. Tissue sections of SCID mice: 1 - Kidney. Congestion of blood vessels; 2 - Liver. Hepatocytes without significant pathological changes. Central veins dilated and plethoric; 3 - Lungs. Congestion of the vessels of the interstitium and interalveolar septa; 4 - Brain. Minimal pericellular edema; 5 - Heart. Some blood in the cardiac chambers. Photo by Olga I. Solovieva] Тестирование биораспределения 10В при внутривенном введении препаратов BPA и BSH мышам с подкожными ксенографтами SW-620. В предыдущих исследованиях установлено, что для успешного проведения БНЗТ необходимо получить концентрацию 10В в опухолевой ткани равную 20-35 мкг/г, а соотношение 10В опухоль/окружающая здоровая ткань должно составить 3/1 [23]. Определили динамику накопления 10В в опухоли, крови и органах после введения препаратов в стандартных концентрациях. В нашем эксперименте, используя метод АЭС ИСП, мы определяли динамику накопления 10В в опухоли, крови и органах после внутривенного введения препаратов в стандартных концентрациях. В результате для BPA максимальное накопление 10В опухолевой тканью зарегистрировано для временных точек 1 и 2 ч и составило 8,0 и 8,7 мкг/г соответственно. При этом соотношение концентраций 10В в образцах опухоли и крови определено как 0,6 для точки 1 ч и 1,7 для точки 2 ч. Также обнаружено, что больше всего 10В накапливается А.И. Касатова, В.В. Каныгин, Е.Л. Завьялов и др. 104 в почках на всем протяжении эксперимента (рис. 3). Временная точка 2 ч может считаться потенциально наиболее подходящей для проведения БНЗТ, однако концентрация бора в опухолевой ткани недостаточна. 45 40 35 30 га и Я я Он 25 20 15 а 10 5 0 3 4 Время,ч [Time, hours] • Кровь [Blood] • Опухоль [Tumor] • Мозг [Brain] • Почка [Kidney] • Печень [Liver] Рис. 3. Биораспределение 10В в органах интереса мышей SCID после внутривенной инъекции ВРА на временных точках 1, 2, 3 и 4 [Fig. 3. Biodistribution of 10В in organs of interest of SCID mice after intravenous injection of ВРА for time points of 1, 2, 3 and 4 hours] После введения ВSH значительного пика накопления опухолью не отмечено. Максимальная концентрация 10В в опухоли составила 5,7 мкг/г. Больше всего 10В накапливали печень, почки и кровь (рис. 4). Кровь [Blood] ^Опухоль [Tumor] Мозг [Brain] Почка [Kidney] Рис. 4. Биораспределение 10В в органах интереса мышей SCID после внутривенной инъекции ВSH на временных точках 1, 2, 3 и 4 ч [Fig. 4. Biodistribution of 10В in organs of interest of SCID mice after intravenous injection of ВSH for time points of 1, 2, 3 and 4 hours] Накопление и токсические эффекты борсодержащих препаратов 105 По-видимому, дальнейшие исследования по увеличению дозы препарата и выбору иного пути введения могут позволить увеличить накопление 10В опухолью и уменьшить его концентрацию в окружающих тканях. В работе [24] авторы изучали накопление 10В на модели подкожного ксено-графта U87 у мышей SCID после внутривенного введения BPA и ВSH и также выявили большую селективность в накоплении бора опухолью после введения борфенилаланина. Так, для ВРА содержание 10В составило 12 и 11 мкг/г опухоли для временных точек 1 и 2 ч соответственно. Максимальное отношение концентраций 10В в образцах опухоли и крови 1,6 для точки 2 ч. Для BSH максимальное отношение концентраций 10В в опухоли и крови составило 1,1 на временной точке 3 ч, однако абсолютное содержание бора в опухоли при этом составило 3 мкг/г. Возможно, BPA является более перспективным препаратом для БНЗТ при его внутривенном введении, чем BSH. Группа ученых из Японии исследовала накопление бора после введения BSH в дозе 100 мг/кг в хвостовую вену крысам с ксенографтом 9L глиомы. Бутионин сульфоксимин (Buthionine sulfoximine) использовали в экспериментальной группе как вещество, потенциально улучшающее накопление бора в опухоли. Выявлено, что концентрация 10В в опухоли для временной точки 3 ч составила 5 мкг/г опухолевой ткани, в то время как в группе BSH + бутионин сульфоксимин накопление бора в опухоли увеличилось и составило 26 мкг/г. Проведенное G. Morris et al. исследование на крысиной модели глиомы C6 выявило значительно более высокое накопление 10В в опухоли после введения BPA с предварительным внутрибрюшинным введением препарата Леводопа по сравнению с группой животных, которым данный препарат не вводился [13]. Таким образом, по-видимому, дальнейшие исследования по увеличению дозы препарата и выбору иного пути введения могут позволить увеличить накопление 10В опухолью и уменьшить его концентрацию в окружающих тканях. Использование дополнительных препаратов, улучшающих проникновение бора в опухоль, может также быть эффективным и должно приниматься во внимание [25]. Заключение Определение безопасных концентраций боркаптата и борфенилаланина на клетки SW-620 показало, что инкубация клеток в течение 24 и 48 ч с данными препаратами в концентрациях 10В 10-320 мкг/мл не оказывает значительного цитотоксического эффекта. Внутривенное введение вышеупомянутых препаратов иммунодефицитным мышам SCID в дозах 350 мг BPA/кг и 100 мг BSH/кг массы тела животного является безопасным, однако не приводит к достаточному накоплению 10В в опухолевой ткани. Авторы предполагают, что изменение пути введения и повышение дозировок и использование комбинаций препаратов может повысить эффективность накопления бора. А.И. Касатова, В.В. Каныгин, Е.Л. Завьялов и др. 106 Авторы выражают искреннюю признательность В.Р. Касатовой за помощь в подготовке иллюстративного материала.

Скачать электронную версию публикации