Occurrence and characteristics of Bacillus cereus group bacterial atmospheric aerosols in Novosibirsk region.pdf Введение Состав и структура сообществ бактерий, входящих в состав биоаэрозолей, формируется под воздействием многокомпонентных, меняющихся факторов среды, включающих погодные условия, географическое положение, время суток, сезон года, состав атмосферы, наличие точечных источников микроорганизмов [1, 2]. Спорообразующие бактерии группы Bacillus cereus, имеющие большое экономическое, медицинское и биологическое значение, встречаются повсеместно в почвах и воздухе, в том числе в аэрозолях пустынных [3] и тропических [4] широт, обнаруживаются в составе «органической» пыли, воздействующей на рабочих, связанных с растениеводством и производством сельскохозяйственной продукции во время полевых работ [5], и могут быть причиной возникновения инфекционных заболеваний. Транспортный перенос микроорганизмов в атмосфере фиксируется на значительные расстояния. Например, длина траектории переноса воздушных масс, содержащих бактерии цереусной группы, с юга Западной Сибири до Японии в течение 93 ч составила 4 700 км [6]. Кроме переноса на дальние расстояния, спорообразующие бактерии способны оставаться жизнеспособными и после вертикальных подъемов на высоту до 20 км [7, 8], что демонстрирует их устойчивость к УФ-индуцированному повреждению ДНК, высушиванию и экстремальным температурам [9]. Значительное внимание исследователей привлекли события, связанные с пылью в Азии и переносом ее в другие регионы, из-за их неблагоприятного воздействия на экосистемы и здоровье человека. Относительная численность видов Firmicutes существенно увеличилась в пылевых образцах (44,3 ± 5,0%) по сравнению с местными образцами без пыли (27,8 ± 4,3%) [10]. В цереусную группу бацилл до недавнего времени включали 12 видов рода Bacillus: B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis, B. gaemokensis, B. manliponensis, B. cytotoxicus, B. toyonensis, B. bingmayongensis, B. wiedmannii. С 2017 г. в эту группу отнесены еще 9 новых видов: B. paranthracis, B. pacificus, В. tropicus, В. albus, В. mobilis, В. luti, В. proteolyticus, В. nitratireducens, В. paramycoides [11]. Представители цереусной группы B. cereus, B. mycoides, B. weihenstephanensis, B. wiedmannii, B. cytotoxicus имеют целый ряд патогенных признаков, включая адгезины, энтеротоксины, гемолизины, являются причиной порчи пищевых продуктов [12]. B. anthracis - возбудитель сибирской язвы, B. thuringiensis - патоген насекомых, используемый в качестве биоконтролирующего агента [13]. Температурный оптимум роста большинства представителей цереусной группы бактерий позволяет отнести их к мезофиллам, однако B. weihenstephanensis, B. wiedmannii - психротоле-рантные, а B. cytotoxicus - термотолерантные микроорганизмы [14]. Причастность бактерии B. cereus к пищевым отравлениям известна с 1950-х гг. Микроорганизмы этого вида могут вызывать диарею, заболевание, похожее на газовую гангрену, пневмонию, менингиты, септицемию, бактериемию, И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. 62 эндофтальмит, эндокардит, сальпингит, кожные инфекции, инфицирование мочевыделительного тракта, встречаться в виде нозокомиальных инфекций [15]. Высокая ферментативная, антибиотическая, инсектицидная активности бактерий цереусной группы находят широкое применение в биотехнологии для разработки биопрепаратов различного назначения. Благодаря продукции гидролитических ферментов и широкого спектра антибиотических соединений, метаболиты B. cereus обладают высокой антимикробной активностью, в связи с чем биомасса спор введена в состав таких препаратов-пробиотиков, как «тойоцерин» [16], «бактисубтил», «флонивил», «цереобиоген» [17], других препаратов для медицины и ветеринарии [18]. Штаммы B. cereus патогенны для большого круга насекомых: чешуекрылых Lepidoptera, перепончатокрылых Hymenoptera, жесткокрылых Coleoptera, а также тараканов Leucophaea maderae. Считают, что факторами патогенности B. cereus служит фосфолипаза С. Однако ведущую роль среди возбудителей бактериальных болезней насекомых имеет чрезвычайно гетерогенный токсинопродуцирующий вид B. thuringiensis, штаммы которого различаются по целому ряду физиолого-биохимических признаков, способности к синтезу ферментов, бактерициноподобных веществ, а также инсектицидности и специфичности к насекомым [13]. Сравнение инсектицидной и антимикробной активностей растворов параспоральных включений B. thuringiensis выявило существование прямой корреляции между ними. Выяснено, что морфовары B. thuringiensis могут проявлять как взаимный антагонизм, так и противомикробное воздействие на B.megaterium, B. subtilis, B. laterosporus [19]. В связи с накопившимися сведениями о влиянии микробиоты атмосферы на климатические процессы, способности вызывать аллергические реакции и заболевания человека, транспортироваться на большие расстояния активность исследований биогенной компоненты атмосферы в мире значительно выросла, в то время как обширная территория Сибири по-прежнему относится к малоизученным территориям. Для Западной Сибири исследования аэрозолей атмосферы сравнительно немногочисленны: проведены мониторинговые исследования состава, концентрации культивируемых микроорганизмов и суммарного белка в атмосферных высотных и приземных аэрозолях над Караканским бором, на площадках в п. Ключи и п. Кольцово Новосибирской области, выделено и охарактеризовано большое количество культивируемых бактерий и грибов [20-22]; с применением молекулярнобиологических методов в приземных аэрозолях Сибирского региона исследованы таксономический состав, сезонная и суточная динамика микробных сообществ [23], пробы отобраны в диапазоне температур 48 °С (от 26 до -22 °C). Зимой по сравнению с летом наблюдали в 5-170 раз снижение выхода ДНК, извлеченной из биомассы, находящейся в воздухе. Отдельных исследований о наличии Bacillus cereus и других представителей цереусной группы в аэрозолях атмосферного воздуха территории Западной Сибири в литературе практически не представлено. Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 63 Восполнение недостающей информации о составе, концентрации микробиоты атмосферы Сибири, имеющей планетарное экологическое значение, поиск новых штаммов для обновления базы продуцентов биологически активных веществ с расширенным диапазоном действия, мониторинг патогенных микроорганизмов в аэрозолях воздуха для профилактики и предотвращения заболеваний - задачи с возрастающей актуальностью. Цель данного исследования - определение встречаемости и свойств бактерий группы B. cereus в приземных атмосферных аэрозолях и в аэрозолях высотных, полученных при самолетном зондировании атмосферы Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, оценка биотехнологического потенциала выделенных микробных изолятов. Материалы и методики исследования Отбор образцов аэрозолей. Приземные пробы воздуха отбирали на высоте 2 м в импинджеры с расходом 50 л/мин, содержащие 50 мл раствора Хенкса «БИОЛОТ» (Россия), по 30 мин 4 раза за сутки ежемесячно на площадке, используемой в качестве примера участка с антропогенной нагрузкой, расположенной в п. Кольцово Новосибирской области. Средний объем воздуха, пропущенный через импинджер, составлял около 1 500 л. Отбор высотных проб атмосферного воздуха осуществляли над территорией Кара-канского бора в 50 км к югу от Новосибирска (границы траектории полета самолета: 54°26'38'' с.ш., 82°30'47'' в.д.; 54°10'55'' с.ш., 81°44'00'' в.д.) с помощью лаборатории «Оптик-Э», смонтированной на самолете АН-30 и затем на ТУ-134. Караканский бор исследовали как пример относительно чистого экологического эталона. Пробы отбирали в дневное время, последовательно на высотах 7 000, 5 500, 4 000, 2 000, 1 500, 1 000 и 500 м в течение 6-10 мин с использованием импинджеров с расходом 50 л/мин, содержащих 50 мл раствора Хенкса. В зависимости от времени отбора объем высотной пробы воздуха составлял 300-500 л. Титр микроорганизмов в высотных и приземных пробах определяли в пересчете на 1 м3 атмосферного воздуха. Образцы атмосферных аэрозолей в трех повторах высевали на стандартные питательные среды [24]: рыбный питательный агар, крахмало-аммиачный агар, почвенный агар, среду Сабуро «ФБУН ГНЦ ПМБ» (Россия), жидкую и агаризованную среду LB «Difco» (США), позволяющие выявить микроорганизмы различных таксономических групп [24, 25], и инкубировали при температурах 28-30 и 6-10 °С в течение 3-20 суток. Индивидуальные колонии микроорганизмов использовали для получения чистых культур и последующего анализа фенотипических свойств. Влияние рН среды на рост микроорганизмов определяли при культивировании штаммов на вариантах агаризованной среды LB с рН 5,0, 7,0 и 9,0. Температурный диапазон роста определяли при культивировании штаммов на агаризованных средах И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. 64 при температурах 5, 20, 30, 37, 42 и 55 °С. Морфологию клеток микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 «Carl Zeiss» (Германия). Для дальнейшего исследования отобраны 25 бактериальных изолятов по фенотипическим и геномным признакам, соответствующих бактериям группы цереус. В качестве контрольных штаммов использованы типовые штаммы из состава коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора: штамм B. thuringiensis ssp. kurstaki В-916, штаммы B. thuringiensis ssp. galleriae B-966 и В-997, штаммы B. cereus B-1367 и В-277. Скрининг ферментативной активности культур. Липолитическую активность определяли на желточном агаре и агаризованной среде LB, содержащей эфиры жирных кислот, с добавлением 0,01% СaQ2. В качестве субстратов использовали 1,0% монолаурат (твин-20) и моноолеат (твин-80). Чашки со средой, засеянные испытуемыми культурами, выдерживали в термостате при 28-30 °С в течение 2 суток. Амилолитическую активность культур определяли при их высеве на крахмало-аммиачный агар, протеолитическую - по способности к гидролизу желатина и казеина молока [26]. Способность к гемолизу учитывали, высевая культуры на среду LB с добавлением крови барана. Нуклеазную активность исследовали на среде LB с добавлением ДНК «Sigma» (США) [26]. Содержание плазмидной ДНК в изолятах определяли скринингом по стандартной методике [26]. Способность к секреции РНКаз в культуральной среде ПДГГ при культивировании бактерий при температуре 30 °С в течение 18-24 ч определяли по накоплению кислото-растворимых продуктов, образующихся при гидролизе высокополимерной РНК дрожжей (1 мг/мл). За единицу активности ферментов принимали их количество, катализирующее образование 1 А260 кислоторастворимых продуктов в течение 60 мин при 37 °С в 50 мМ трис-HCl, pH 8,0. Состав среды ПДГГ (г/л): пептон - 9,27, дрожжевой экстракт - 5,00, NaCl - 3,00; 10 мл 50% глицерина, 2 мл 20% глюкозы; рН 7,0-7,2 [27]. Антибиотическую активность исследуемых штаммов определяли классическим диффузионным методом отсроченного антагонизма (метод перпендикулярных штрихов) [28] на среде LB при температуре 37 °С. В качестве патогенных тест-штаммов применяли: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 620, Klebsiella pneumoniae B-4894, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium 2606, Shigella sonnei 32 из состава коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Контроль характера и активности роста тест-штаммов - их параллельный посев на чашки Петри с той же питательной средой без испытуемой культуры. Чувствительность исследуемых культур к антибиотикам определяли дискодиффузионным методом с применением дисков производства НИЦФ (Россия). Генетический анализ бактериальных изолятов проведен с помощью ПЦР со специфическими праймерами на 16S рРНК [29]. Нуклеиновые кислоты Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 65 выделяли из суточных вегетативных клеток, контролируя отсутствие спорообразования микроскопически. Клетки бактериальных изолятов разрушали лизирующим буфером (набор реагентов для выделения ДНК/РНК, «НПФ Литех» (Россия)) и выделяли суммарную ДНК согласно прилагаемой к набору инструкции. ПЦР проведен с использованием буфера и полимеразы производства «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Для проведения ПЦР использовали следующую программу: 94 °С - 10 с, 60 °С - 15 с, 72 °С - 30 с, 40 циклов, затем 72 °С -7 мин. Продукты ПЦР анализировали в 2,0% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности 16S рРНК бактерий определяли на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl «Hitachi» (США) с использованием набора ABI prism Big Dye terminator V3.1 cycle. Для секвенирования использовали продукты амплификации длиной 1 360 п.о. Выравнивание проведено с помощью программы «Lasergene 9». Филогенетический анализ осуществлен с помощью программного обеспечения «MEGA 7». Выделенные штаммы микроорганизмов хранили при низкотемпературном замораживании в коллекции природных изолятов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Статистическая обработка данных. Расчет числа культивируемых микроорганизмов в пробах проведен по методу Кербера [30], при этом количество микроорганизмов усредняли по 3 параллелям высеянных проб. Среднегодовые суммарные величины численности культивируемых микроорганизмов рассчитывали как средние по повторностям ± доверительный интервал на уровне значимости 95%, применяя ^-критерий Стьюдента (р < 0,05). Результаты исследования и обсуждение На территории юга Западной Сибири с 1998 г. проводится мониторинг биогенной компоненты аэрозолей атмосферного воздуха на высотах до 7 км, заключающийся в изучении качественного и количественного состава культивируемых микроорганизмов. Общая концентрация микроорганизмов в аэрозолях Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, составляла в разных пробах в среднем от менее единицы до 5*105 КОЕ/м3, при этом концентрация психрофильных микроорганизмов, способных расти при температуре 6-10 °С, в разных образцах могла составлять от 3,20*102 до 1,13*105 КОЕ/м3. Среди выделенных микроорганизмов преобладали бактерии, средняя концентрация грибов в образцах не превышала 10% от общего количества изолятов. Встречаемость спорообразующих микроорганизмов в высотных пробах за годы мониторинга составляла от общего количества выделяемых минимум 0,5% в 2005 г. и максимум 55% в 2011 г.; для наземных образцов - 0,1% в 2002 г. и максимум - 83% в 2016 г. Содержание бактерий цереусной группы в разных образцах также значительно отличалось, составляя от 0,1 до 6,5% от общего количества выделяемых бацилл. Среднегодовое И.С. Андреева, А.С. Сафатое, Л.И. Пучкова и др. 66 значение содержания спорообразующих бактерий в высотных и приземных пробах атмосферных аэрозолей представлено на рис. 1. A Год пробоотбора [Sampling year] Рис. 1. Среднегодовое значение содержания спорообразующих бактерий в высотных (А) и приземных (В) пробах атмосферных аэрозолей Новосибирской области, % [Fig. 1. The average annual value of the content of the spore-forming bacteria in high-altitude (A) and surface (B) samples of atmospheric aerosols of Novosibirsk region], % Количество выделяемых культивируемых спорообразующих бактерий, значительно отличающееся в разные годы наблюдения, представлено на рис. 2, данные геномного анализа - на рис. 3. Интересно, что в исследуемых образцах аэрозолей, отобранных после длительного дождя или обильного снегопада, клетки микроорганизмов не обнаруживались или присутствовали в единичном количестве. В качестве примера такой ситуации можно привести результаты высевов зимних высотных аэрозолей от 22.12.2010, 29.01.2013, летних высотных - от 30.05.2000, 24.08.2008, приземных проб от 14-15.08.2012, от 18-19.08.2015, где культивируемые микроорганизмы отсутствовали, т.е. наблюдался своеобразный эффект вымывания частиц аэрозолей из атмосферы, что может быть одной из причин значительного отличия концентрации выделяемых микроорга- Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 67 низмов в разных образцах, а в результате - и в суммарных среднегодовых данных. Рис. 2. Суммарное количество культивируемых штаммов спорообразующих бактерий, ежегодно выделяемых из образцов высотных и приземных атмосферных аэрозолей Новосибирской области [Fig. 2. The total number of cultivated strains of spore-forming bacteria annually isolated from samples of high-altitude and surface atmospheric aerosols of the Novosibirsk region] Из приземных и высотных проб аэрозолей осени 2016 г., отобранных в период преобладания юго-западных ветров из Казахстана, характеризующихся повышенным содержанием пылевых компонентов и особо высокой численностью спорообразующих бактерий, выделены 225 бактериальных изолята, из которых 62 образовывали эндоспоры. Штаммы спорообразующих бактерий по определению фенотипических свойств и данных геномного анализа (см. рис. 3) отнесены к родам Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, Oceanobacillus и ряду других. Среди микробных изолятов этого периода преобладали бактерии рода Bacillus, по совокупности признаков отнесенные к видам B. beringensis, B. boroniphilus, B. megaterium, B. firmus, B. korlensis, B. pumilus, B. subtilis, B. brevis, B. licheniformis и другим. Бактерии, идентифицированные как Bacillus cereus (Bc) и Bacillus thuringiensis (Bt) подвидов Bt ssp. kurstaki, обнаружены как в высотных, так и в приземных пробах, штаммы Bt ssp. galleriae изолированы из приземных атмосферных аэрозолей. Следует отметить, что среди бактериальных изолятов цереусной группы отсутствовали патогенные бактерии Bacillus anthracis, так как клетки всех выделенных штаммов подвижны, обладали фосфолипазой, щелочной фосфатазой, проявляли гемолитическую, плазмокоагулазную активности, устойчивы к пенициллину, что не является свойственным для бактерий вида B. anthracis (табл. 1, 2). И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. 68 Рис. 3. Филогенетическоедерево,построенноедля бактерий,выделенных из аэрозолей атмосферного воздуха, на основесравнения с известными штаммами.Анализ проведен методом«объединенияближайших соседей» с использованием 2-параметрическоймодели Кимуры [Fig.3. Thephylogenetictreeconstmctedforbacteriaisolatedfromatmospheric aerosols basedon comparisonwith known strains. Theanalysis was carried out withthenearestneighbor method using theKimura 2-parametermodel] В литературе приводятся данные анализа сходных образцов, где авторами показано, что аэрозоли, привнесенные с пылью из Азии, также содержали большее количество видов бацилл (23,8% от общего количества), чем местные образцы без пыли (13,3%), включая виды, тесно связанные с Bacillus cereus. В изолятах B. cereus, выделенных из образцов аэрозолей, со- Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 69 держащих пыль, анализ генов энтеротоксинов подтвердил наличие факторов вирулентности [10]. Таблица 1 [Table 1] Признаки штаммов бацилл, близких на филогенетическом дереве к видам Bacillus cereus и Bacillus anthracis [Characteristics of bacilli strains that are close to the species Bacillus cereus and Bacillus anthracis on the phylogenetic tree] Штамм [Strain] Морфология клеток [Cell morphology] Размер клеток (мкм) [Cell size (pm)] Подвижность [Mobility] Эндоспоры [Endospores] Щелочная фосфатаза [Alkaline phosphatase] Фосфолипаза [Phospholipase] Плазмокоагулаза [Plasma coagulase] СД СД О s к 06 S 4 О 5 Устойчивость к пенициллину [Penicillin resistance] Пароспоральные кристаллы [Parosporal crystals] Cb-989 Палочки по 1-2 и в цепочках [1-2 rods and in chains] 1,0- 1,2x 3-5 + EST EC + + + + R - Cg-42 -«- -«- + -«- + + + + R - Cb-940 -«- -«- + -«- + + + + R - Cg-45 -«- -«- + -«- + + + + R - Cg-39 -«- -«- + -«- + + + + R + Cg-46 -«- -«- + -«- + + + + R - Cb-946 -«- -«- + -«- + + + + R - Cb-958 -«- -«- + -«- + + + + R - B. cereus ATCC 10702 -«- -«- + -«- + + + + R - B. cereus В-277 -«- -«- + -«- + + + + R - B. cereus* -«- -«- +/- -«- + + +/- + R - B. anthracis* -«- -«- - EC - - - - S - B. thuringi-ensis* -«- -«- +/- EST + + + + R + Примечание: * по [31]; «+» - положительное проявление признака; «-» - отрицательное проявление признака; «+/-» - вариабельное проявление признака; EC - споры эллиптические центральные, EST - споры эллиптические субтерминальные; R - устойчив к антибиотику, S - чувствителен к антибиотику. [Note: * according to [31]; “+” - Positive manifestation of the characteristic; “-” - Negative manifestation of the characteristic; “+/-” - Variable manifestation of the characteristic; EC - Elliptical central spores, EST - Elliptical subterminal spores; R - Antibiotic resistance, S - Antibiotic sensitivity]. Ферментативная активность. Биохимические признаки выделенных штаммов Bc и Bt довольно схожи: все исследуемые штаммы продуцировали каталазу, протеазы, обладали амилолитической, фосфатазной, желатиназ-ной, гемолитической активностями, выраженными в разной степени; гидролизовали глюкозу с образованием кислоты, но не газа, не утилизировали сахарозу и маннит, как правило, обладали плазмокоагулазной активностью. Выявлен штамм Bt Cb-527 с высокой нуклеазной активностью. За небольшим исключением отличия выделенных штаммов проявлялись в соответ- И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. 70 ствии с видовыми характеристиками [25] в наличии или отсутствии уреазы, липазной и липолитической активностей (табл. 2). Таблица 2 [Table 2] Биохимические признаки штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, выделенных из атмосферных аэрозолей [Biochemical characteristics of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains isolated from atmospheric airaerosols] Штамм [Strain] Кристаллы [Crystals] Амилаза [Amylase] Уреаза [Ureaza] Желатиназа [Gelatinase] Казеиназа [Caseinaza] Фосфолипазы [Phospholipases] Липаза [Lipase] Фосфатаза [Phosphatase] If 2 £ S « r«u Д 1-i 1-1 Плазмокоагулаза [Plasma coagulase] Гидролиз [Hydrolysis] Сахароза [Sucrose] Глюкоза [Glucose] Н § S3 Bc B-1367 - ± - + + + - + + + - К - Bc B-277 - + - + + + - + + + - K - Bc Cb-946 - + - ± + + - + + + - К - Bc Cb-958 - + - + + + - + + + - К - Bc Cb- 989 - + - + + + - + + + - К - Bc Cg-45 - + - + + + - + + + - К - Bc Cg-42 - + - + + + - + + + - К - Bc Cg-39 - + - ± + + - + + + - К - Bc Cg-46 - + - ± + + - + + + - К - Btk 24-17 + + + + + + + + ± + - К - Btk 18-15 + + + ± + + + + + - - К - Btk 32-04 + + + + + + - + ± + - К - Btk 50-04 + + + ± + + - + ± + - К - Btk 18-05 + + ± - + + - + + + - К - Btk 09-01-40 + + ± + + + + + + + - К - Btk 32-04 + + + + + + + + + + - К - Btk 63-04 + + + + + + + + ± ± - К - Btk 41-18 + + + + + + + + ± + - К - Btk 100-04 + + + + + + + + + + - К - Btk 118-17 + + ± + + + + + ± + - К - Btk 78-04 + + + + + + + + + ± - К - Btk 31-04 + + + + + + + + ± + - К - Btk 5-18 + + + ± + + + + ± ± - К - Btg Sn-50 + + + ± + - + + ± ± - К - Btg Sn-56 + + + ± + - + + ± ± - К - Btg Sn-60 + + + ± + - + + ± ± - К - Btg Sn-66 + + + ± + - + + ± ± - К - Bt Cb-527 + + - + + + - + + + - К - Btg B-996 + + + + + - + + ± + - К - Btg B-997 + + + + + - + + ± + - К - Btk B-916 + + + + + + + + ± + - К - B.cereus* - + - + + + - + + + - К - B. anthracis* - + + + + - + - - - + К - B. thuringiensis* + + + + + + + + + + - К - Примечание: * по [3 «+» - положительная реакция; «-» - отрицательная реакция; «±» - слабо выраженная реакция; «К» - гидролиз углевода с образованием кислоты; Вс -Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg -Bacillus thuringiensis ssp. galleriae. [Note: * according to [31]; “+” Positive reaction; “-” Negative reaction; “±” - Weakly expressed reaction; “K” - Hydrolysis of carbohydrate to form an acid; Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae]. Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 71 Сведения по резистентности к антибиотикам одинаково важны как при использовании микроорганизмов в биотехнологических процессах в качестве, например, селективного агента, так и для возможности ограничения развития вызываемых ими инфекций. Данные по резистентности исследуемых штаммов к антибиотикам представлены в табл. 3. Таблица 3 [Table 3] Чувствительность штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis к антибиотикам [Sensitivity of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains to antibiotics] Штамм [Strain] Антибиотики (м [Antibiotics (u жг/диск)/ зона подавления роста в мм g / disc) / growth inhibition zone in mm] Ванкомицин (30) [Vancomycin] Клиндамицин (2) [Clindamycin] Левофлоксацин (30) [Levofloxacin] Ципрофлоксацин (30) [Ciprofloxacin] Гентамицин (10) [Gentamicin] Линкомицин (15) [Lincomycin] Амикацин (30) [Amikacin] Канамицин (30) [Kanamycin] Цефаклор (30) [Cefaclor] Цефалексин (30) [Cephalexin] Цефалотин (30) [Cephalothin] Рифампицин (5) [Rifampicin] Меропенем (10) [Meropenem] Фузидин (10) [Fuzidin] Вс B 1367 22 22 25 25 20 12 20 20 25 18 15 12 17 18 Bc B-277 15 16 20 14 20 15 20 15 0 18 0 10 10 12 Вс Cb 946 0 19 22 24 24 0 12 0 15 22 0 12 0 15 Вс Cb 958 18 19 23 27 20 10 23 14 23 10 0 10 20 15 Вс Cb 989 30 15 30 27 0 10 0 35 35 12 14 16 20 20 Вс Сg 45 17 23 20 11 18 0 20 16 0 12 0 0 11 11 Вс Cg 42 13 0 0 20 12 0 0 15 0 16 0 0 12 12 Вс Cg 42 15 22 0 20 21 12 19 14 0 18 0 14 17 11 Вс Cg 39 8 0 14 27 11 12 25 15 28 15 12 15 24 22 Вс Cg 46 12 0 15 25 20 10 20 23 25 15 10 15 18 20 Btk 24-17 17 21 25 24 19 0 21 0 0 0 0 14 0 0 Btk 18-05 20 26 24 30 25 18 0 13 12 10 0 18 16 20 Btk 32-04 0 20 16 28 20 20 16 12 0 0 0 10 0 0 Btk 50-04 0 24 28 15 22 12 24 18 15 20 9 15 0 25 Btk 18-15 17 19 20 12 0 9 11 0 0 0 0 12 9 11 Btk 01-40 18 0 25 29 21 17 19 15 0 15 0 0 19 20 Btk 32-04 19 21 25 30 21 0 0 0 0 20 0 15 22 17 Btk 63-04 16 21 24 21 18 0 15 0 0 0 0 14 0 15 Btk 41-18 17 23 24 12 22 13 14 15 11 23 20 16 21 20 Btk 100-04 20 24 28 26 25 25 25 20 0 17 0 10 15 23 Btk 118-17 20 20 24 24 22 18 22 20 10 16 0 20 20 20 Btk 78-04 20 24 0 27 0 0 21 14 9 0 0 11 0 20 Btk 31-04 10 19 26 25 24 19 25 0 0 0 0 12 13 15 Btk 5-18 11 10 11 18 21 18 10 0 0 0 0 8 0 19 Bt Cb-527 17 20 20 23 21 0 21 20 20 20 27 12 14 12 Btg Sn-50 11 10 16 10 9 11 11 0 0 0 0 10 0 12 Btg Sn-56 17 24 22 24 20 16 18 13 0 0 0 14 14 12 Btg Sn-60 19 25 25 26 19 10 9 9 0 0 0 10 0 13 Btg Sn-66 17 23 23 0 21 13 10 17 0 0 0 11 9 12 Btk B-916 19 23 19 20 19 0 14 0 10 0 0 18 0 19 Btg B-996 0 26 23 0 20 20 19 18 10 15 10 10 0 10 Btg B-997 20 23 25 0 24 13 11 15 0 0 13 24 12 15 Примечание [Note]: Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae. И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. 72 В многочисленных литературных источниках отмечается, что большинство изолятов B. cereus устойчиво к пенициллинам и цефалоспоринам, что рассматривается как следствие продукции Р-лактамаз [32]. Ряд работ, касающихся изучения чувствительности штаммов B. cereus к антибиотикам, показывает, что за последние десятилетия к некоторым из препаратов начинает формироваться резистентность, не характерная ранее [33]. Исследования последних лет свидетельствуют о присутствии бактерий вида B. cereus, содержащих как множественные гены токсина, так и проявляющих мультиустойчивость к антибиотикам, в природных источниках и в качестве конта-минантов различных продуктов [34]. Выяснено, что все исследуемые в настоящей работе штаммы Bc и Bt резистентны к полимиксину, оксациллину, бензилпенициллину, а также к цефу-роксиму (данные в таблицу не внесены), что согласуется с литературными сведениями [33]. Исключение составляли штаммы Вс В-1367 и Bt Cb-527, проявившие к данным антибиотикам высокую чувствительность. Большая часть штаммов оказалась резистентной к цефалоспоринам (цефалексину, цефалотину и цефаклору). Важно отметить, что выделенные из аэрозолей штаммы Вс, кроме штамма Bc Cg-45, показали высокую чувствительность к ципрофлоксацину, но очень отличались по восприимчивости к ванкомицину, отмеченным на практике как антибиотики резерва, эффективные в лечении инфекции B. cereus (см. табл. 3). Высокую чувствительность все штаммы Bc и Bt проявили к рокситромицину, эритромицину и, за исключением штамма Bt 24-17, к линезолиду (данные в табл. 3 не приведены). Кроме штаммов Bt Cb-527 и Bc B-1367, все исследуемые штаммы цереусной группы оказались полирезистентными, проявляя устойчивость к шести-пятнадцати антибиотикам. Антибиотическая активность. В разной степени выделенные из аэрозолей штаммы Bt и Bc подавляли рост патогенных дрожжей C. albicans, наибольшую активность проявили штаммы Btk 24-17, 18-15, 09-01-40, 63-04 (табл. 4). Антифунгальное действие штаммов Bt обусловливается продукцией ферментов из класса гидролаз и антибиотических соединений [35]. Штамм Bt Cb-527 и ряд штаммов Bc дополнительно эффективно угнетали рост грам-положительных тест-штаммов S. aureus, B. subtilis. Грамотрицательные тестштаммы проявили значительно меньшую чувствительность к антибиотическому действию штаммов Bt и Bc: угнетение роста штамма E. coli наблюдали под воздействием секретируемых метаболитов штаммов Btk 5-18, 41-18, 0901-40; штаммы Btk 24-17, 63-04, 118-17 и 5-18 ограничивали рост штамма S. thyphimurium. Штамм K. pneumoniae проявил резистентность относительно всех штаммов Bt и Bc, используемых в опыте. Следует отметить также, что типовой коллекционный штамм Bc B-1367 значительно уступал природным аэроизолятам по устойчивости к антибиотикам и антимикробной активности (см. табл. 3, 4). Противомикробная активность бактерий цереусной группы, в частности B. thuringiensis, ранее показана по отношению к бактериям Bacillus subtilis, Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 73 Erwinia herbicola, Erwinia amylovory, Pantoea agglomerans, Enterococcus avium, Staphylococcus aureus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Bacillus thuringiensis [36], противогрибковая активность - по отношению к грибам рода Aspergillus [35]. Известна также литическая активность B. cereus к цианобактериям [37], показана продукция штаммов B. cereus UW85 двух фунгистатических антибиотиков, подавляющих рост патогенного гриба Phytophthora medicaginis [39]. Подтверждение cведений об активности бактерий цереусной группы против близкородственных бактерий [19, 35] - антагонизм штаммов B. thuringiensis ssp. galleriae B-996 и B-997 по отношению к штаммам B. cereus В-277 и В-1367. Зона лизиса этих бактерий под влиянием секретируемых метаболитов штаммов Btg B-996 и B-997 при применении метода отсроченного антагонизма составляла 16 мм (данные в табл. 3 не внесены). Зоны угнетения роста тест-штаммов в условиях проведенного опыта менее 10 мм пренебрежимо малы и отнесены к отрицательным результатам. Таблица 4 [Table 4] Антибиотическая активность штаммов Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, выделенных из атмосферных аэрозолей [Antibiotic activity of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains isolated from atmospheric aerosols] Штамм [Strain] Тест-штаммы пато ITest strains of patho генов / зона угнетения роста, мм gens / zone of growth inhibition, mml Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella typhimurium Shigella sonnei Bc B-1367 0 0 24 0 0 0 0 Bc B-277 20 12 25 0 0 OR OR Bc Cb-946 30 25 25 0 0 0 OR Bc Cb-958 25 25 23 0 0 0 0 Bc Cb-989 0 0 26 0 0 OR OR Bc Cg-45 0 0 10 0 0 0 0 Bc Cg-42 30 25 23 0 0 0 0 Bc Cg-39 20 30 15 0 0 0 0 Bc Cg-46 25 25 26 5 0 0 0 Btk 24-17 7 0 41 0 0 17 5 Btk 18-15 11 0 45 0 0 12 5 Btk 32-04 6 0 35 0 0 10 6 Btk 50-04 5 0 30 0 6 4 4 Btk 09-01-40 7 0 46 0 17 11 4 Btk 32-04 6 0 35 0 30 10 6 Btk 63-04 4 0 40 0 4 20 8 Btk 41-18 5 0 42 0 30 10 7 Btk 100-04 3 0 40 0 16 6 7 Btk 118-17 6 6 25 0 0 25 6 И.С. Андреева, А.С. Сафатов, Л.И. Пучкова и др. Окончание табл. 4 [Table 4 (end)] Штамм [Strain] Тест-штаммы пато [Test strains of patho генов / зона угнетения роста, мм gens / zone of growth inhibition, mm] Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella typhimurium Shigella sonnei Btk 78-04 9 0 41 0 6 14 5 Btk 31-04 3 0 28 0 6 4 4 Btk 5-18 10 0 30 0 33 30 11 Bt Cb-527 30 25 22 0 0 0 0 Btg Sn-50 0 0 40 0 0 0 0 Btg Sn-56 0 0 25 0 0 0 0 Btg Sn-60 7 0 40 0 0 0 0 Btg Sn-66 7 0 20 0 0 0 0 Btk B-916 5 0 40 0 0 5 0 Btg B-996 7 15 45 0 0 7 0 Btg B-997 7 10 40 0 0 7 0 Примечание [Note]: Вс - Bacillus cereus; Bt - Bacillus thuringiensis; Btk - Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki; Btg - Bacillus thuringiensis ssp. galleriae; ОR - ослабление роста [the weakening of growth]. 74 Штамм Cb-527, идентифицированный согласно фенотипическим признакам как Bacillus thuringiensis (колл. № В-1378), в отличие от других выделенных штаммов Bt имел неподвижные клетки, при культивировании в жидкой среде на термостатированной качалке образующие крупные агрегаты (хлопья) (рис. 4, А), которые при прекращении перемешивания среды в короткое время осаждались в виде рыхлого осадка (рис. 4, B). Есть мнение, что агрегация клеток может быть стратегией повышения их выживаемости в суровых условиях, таких, например, как высокая доза ультрафиолетового излучения на большой высоте [9]. Клетки штамма Bt Cb-527 образовывали мощные капсулы (рис. 4, C), что не характерно для типовых штаммов Bt, процесс активного образования эндоспор и параспоральных кристаллов при его выращивании в жидкой среде при температуре 37 °С начинался уже к 24 ч культивирования (у других выделенных штаммов Bt - на 3-5-е сутки). Штамм Bt Cb-527 отличался также от других изолированных из аэрозолей штаммов Bt высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам (к 17 из 21 антибиотика, использованного в опыте). В отличие от остальных штаммов Bt штамм Bt Cb-527 имел сходную со штаммами Bc высокую антимикробную активность относительно грамположительных штаммов S. aureus, B. subtilis (см. табл. 3). Обнаруженные особенности штамма Bt Cb-527 могут быть обусловлены характерным для цереусной группы обменом плазмидами как между B. thuringiensis, так и другими близкородственными видами, принадлежащими к группе Bacillus cereus [39]. Плазмидные ДНК представляют особый интерес как содержащие внехромосомные гены резистентности к Встречаемость и свойства бактерий цереусной группы 75 антибиотикам и другим факторам среды обитания. Анализ штаммов Bt и Bc, изолированных из аэрозолей, показал, что как характерно для этих видов [39], все они содержат плазмиды. Электрофореграммы, отражающие состав плаз-мидных ДНК и их подвижность, для всех штаммов оказались достаточно сходными. Анализ, подтверждающий резистентность штаммов к антибиотикам в зависимости от состава и наличия плазмид, в настоящей работе не проводили. Штамм Bt СЬ-527 продуцировал комплекс РНКаз с концентрацией до 350-400 е.а./мл культуральной жидкости (КЖ). Ранее проведенными экспериментами нами показана противовирусная активность отдельных фракций КЖ штаммов B. thuringiensis, содержащих внеклеточные низкомолекулярные (от 15 до 20 кДа) и высокомолекулярные РНКазы (порядка 55 кДа), по отношению к вирусу гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вирусу гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) [40], что согласуется с литературным данными о противовирусной активности бактериальных РНКаз против вирусов, в качестве нуклеиновой кислоты содержащих РНК [41]. Высокая концентрация РНКаз, секретируемых штаммом B. thuringiensis СЬ-527, свидетельствует о перспективности его использования для разработки препаратов, направленных на подавление размножения РНК-содержащих вирусов. Дополнительные исследования позволят более точно идентифицировать штамм Bt СЬ-527 и оптимизировать возможности его биотехнологического применения в качестве противовирусного средства. A B Рис. 4. Морфология клеток и особенности роста штамма Bacillus thuringiensis СЬ-527 в жидкой среде (фото И.С. Андреевой): А - клетки штамма B. thuringiensis СЬ-527 в скоплениях (хлопьях) при культивировании в жидкой среде (фазовый контраст, х2500); В - осадок клеток штамма B. thuringiensis СЬ-527 при культивировании в жидкой среде (слева), - штамм Bacillus cereus В-277, среда равномерно мутная (справа); С - кристаллы, споры и капсулы клеток штамма B. thuringiensis СЬ-527 (фазовый контраст, х2500) [Fig. 4. The morphology of cells and the growth characteristics of strain Bacillus thuringiensis СЬ-527 in a liquid medium (Photo Ьу Irina Andreeva): A. B. thuringiensis СЬ-527 strain cells in clusters (flakes) when cultured in a liquid medium (phase contrast, x2500); В. On the left - The sediment of cells of the B. thuringiensis СЬ-527 strain when cultured in a liquid medium; on the right - the Bacillus cereus B-277 strain, the medium is uniformly tuAid; С. Crystals, spores and capsules of B. thuringiensis СЬ-527 (phase contrast, x2500)] C И.С. Андреева, А.С. Сафатое, Л.И. Пучкова и др. 76 Заключение В результате многолетнего мониторинга биогенной компоненты атмосферы Новосибирской области, расположенной на юге Западной Сибири, показано, что значение концентрации микроорганизмов в исследуемых аэрозолях колебалось в разных пробах в среднем от менее единицы до 5»105 КОЕ/м3. Численность культивируемых спорообразующих бактерий, включая бактерии группы цереус, в разные временные периоды также была переменчива, титр выделяемых изолятов в разных пробах мог отличаться на 5 порядков. В исследованных образцах выделены бактерии B. cereus и B. thuringiensis, в том числе подвидов Bt ssp. kurstaki, Bt ssp. galleriae. Показано характерное для представителей этих таксонов наличие таких ферментов агрессии, как фосфолипазы, гемолизины, протеазы, нуклеолитические ферменты. За исключением штаммов Вс В-1367 и Bt Cb-527, все штаммы аэроизолятов B. cereus и B. thuringiensis проявили множественную устойчивость по отношению к антибиотикам, подтверждая литературные данные о все большем распространении полирезистентности среди выявляемых природных микробных изолятов. Выраженная антибиотическая активность штаммов B. cereus и B. thuringiensis показана относительно возбудителя кандидозов Candida albicans и грамположительных штаммов S. aureus и B. subtilis, в единичных случаях - против штаммов B. cereus. Из аэрозолей атмосферного воздуха выделен атипичный новый штамм B. thuringiensis Cb-527, обладающий высокой продукцией РНКаз, что позволяет рекомендовать его для разработки противовирусных препаратов против РНК содержащих вирусов. Штаммы B. cereus и B. thuringiensis, проявившие выраженную ферментативную, антибиотическую активность, депонированы в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора для дальнейших разработок в качестве источников ферментов и соединений, ингибирующих развитие патогенных микроорганизмов и вирусов.

Скачать электронную версию публикации