Physiological and biochemical adaptation indicators of the Azov sea roach Rutilus rutilus (L.) at various stages of its .pdf Введение Каждый период жизненного цикла рыб характеризуется специфическими особенностями метаболизма, без которых невозможно нормальное осуществление жизненных процессов в популяции [1]. Метаболические процессы являются одним из инструментов реализации адаптационных возможностей организма на абиотические (температура, гидрохимические особенности водоема) и биотические (качество и доступность кормовой базы, наличие тех или иных инвазий) факторы среды. Наиболее распространенными биохимическими тестами функционального состояния рыб в аспекте реализации адаптационного потенциала особи на разных этапах цикла являются определения таких биологических параметров, как содержание влаги, белка и липидов в тканях и органах. Биологическая ценность и информативность этих показателей подтверждены большим количеством теоретических и экспериментальных работ [2-6]. Достаточно информативными являются и индексы жизненно важных органов рыб, динамика которых порой зависит от зрелости гонад и сезонных изменений метаболизма [7]. Для диагностики состояния организма особую важность приобретает знание нормы, диапазона значений исследуемых показателей, характеризующих эту «норму», позволяющих нормальному протеканию всех жизненно важных процессов организма, связанных с репродукцией и поддержанием жизнеспособности организма в изменяющихся условиях среды [8, 9]. Тарань представляет собой полупроходную форму плотвы Rutilus ruti-lus (L, 1758), которая эволюционно возникла в условиях относительно рас-пресненного Азовского моря. Это важный промысловый вид Азовского моря, основные нерестилища тарани находятся в Азово-Кубанском и Азово-Донском районах. Распространение азовской популяции тарани в морской части ареала неравномерно и зависит от солености воды и продуктивности кормовых площадей [10]. В настоящее время ареал тарани занимает прибрежную зону восточной и северо-восточной части Азовского моря. Распределение тарани в прибрежной зоне моря ограничивается глубинами 4-8 м. Изогалина 11% - это верхняя граница оптимальной солености для тарани. В результате зарегулирования стока Азовского моря в середине 1970-х гг. соленость вод увеличилась до критических значений и составила в среднем 13,8%. В этот период было отмечено снижение численности и ухудшение качества рыб в популяции азовской тарани [11]. В 1990-е гг. соленость вод менялась от 10,6 до 11%, т.е. была сопоставимой с величинами, отмечавшимися в годы естественного режима стока рек бассейна [12]. В дальнейшем отмечалось незначительное снижение солености, к 2006 г. она достигла 9,3%. Период 2000-2013 гг. характеризовался распреснением Азовского моря до значений, свойственных естественным условиям [13]. С 2013 г. вследствие климатических и антропогенных преобразований материкового стока в Азовское море, особенно стока р. Дон, отмечена тенденция роста этого показателя. В 2018 г. значение среднегодовой солёности незначительно превысило 13,8%, а в 2020 г. значения этого показателя достигли максимальных значений для периода наблюдений 1960-2019 гг. и составили 14,5% [14]. Таким образом, до 2018 г. соленость Азовского моря была на оптимальном для популяции тарани уровне. Все описанные гидрохимические флуктуации оказывали существенное влияние на динамику тарани, так как в значительных пределах изменялась площадь нагульной части ареала как для взрослых особей, так и для молоди. В ответ на снижение благоприятности среды обитания отмечались общее уменьшение размерно-массовых характеристик производителей, идущих на нерест, уменьшение на один год сроков первого созревания особей [15]. Все это находит отражение в изменении показателей метаболизма рыб. Результаты мониторинга физиологического состояния нерестовой части популяции тарани в разные периоды жизненного цикла, проводимого нами с 1991 г., позволяют определить количественные границы содержания запасных и лабильных веществ в организме рыб, характерные для современного (благополучного для тарани) состояния экосистемы Азовского моря. В дальнейшем такие данные должны учитываться при оценке «нормальности» или «ненормальности» состояния организма в изменяющихся условиях среды [9]. Цель данного исследования - анализ многолетних данных по динамике содержания белка и общих липидов в мышцах, печени и гонадах тарани, общего белка, альбуминов, глобулинов, холестерина и липидов сыворотки крови, индекса печени, определение референсных диапазонов этих показателей. Материалы и методики исследования Представленные нами материалы получены за более чем двадцатипятилетний период исследования (с 1991 по 2020 г.) современного состояния популяции азовской тарани. В разные периоды жизненного цикла, включающие нерестовое, нагульное и зимовальное состояние, проводился сбор проб в морских рейсах, из уловов береговых ставников в разных районах Азовского моря, а также в период подходов производителей к нерестововыростным хозяйствам (НВХ) Азово-Кубанского района. Ежегодно в каждый сезон для анализа отбирали по 20 самок и 10 самцов. Исследовано более 3 000 половозрелых особей в возрасте 3-5 лет. Сбор материала осуществляли согласно стандартной методике И.Ф. Правдина (1966) [16]. Каждую особь измеряли с точностью до 0,1 см и взвешивали с точностью до 0,05 г. Для определения возраста использовали чешую. По внешнему виду гонад определяли половую принадлежность и стадию зрелости половых продуктов в соответствии со шкалой зрелости, предложенной В.А. Мейен (1940) [17]. Пробы мышц вырезали из большой боковой мышцы тела рыбы выше боковой линии. Кровь собирали из каудальной вены с помощью стерильного пластикового шприца объемом 2 см3, помещали в сухую пластиковую пробирку Эппендорфа (Eppendorf Russia & CIS). Отделение жидкой части (сыворотки) от клеток крови осуществляли методом центрифугирования с использованием центрифуги СМ-12-08 (Россия) в течение 10 мин при 4 500 об/мин. Полученную сыворотку хранили при -18 °С [18]. После забора крови рыбу вскрывали, выделяли печень, взвешивали с точностью до 0,001 г для расчета гепатосоматического индекса (М печени / М тела х 100). Затем каждую рыбу осматривали для выявления внешних и внутренних аномалий или поражений. Определение влаги проведено весовым методом [19]. Для определения массовой доли липидов в образцах ткани осуществляли непрерывную экстракцию по методу Сокслета [19] с использованием полуавтоматического анализатора содержания жиров FA-46 (Bioevopeak Co., Ltd, China). Метод основан на экстракции жира органическим растворителем (эфир диэтиловый) из сухой навески и последующим определении его массы взвешиванием. Содержание белка в тканях определяли по методике Лоури [20] с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Сыворотка крови без следов гемолиза использована для определения количества общего белка, альбумина и глобулинов, холестерина и липидов. Анализ состава сыворотки крови проведен с помощью автоматического биохимического анализатора Stat Fax 4500 (Awareness Technology, USA) наборами реагентов компании Абрис+ (Санкт-Петербург, Россия). Массив данных обрабатывали статистически с использованием ^-критерия Стьюдента, отличия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для установления референсных значений использовали интердецильный размах, содержащий в себе центральные 80% наблюдений, т.е. те наблюдения, которые располагаются между 10-м и 90-м процентилями. Для количественной оценки тесноты связи между исследованными показателями использовали коэффициент корреляции CR. Данные в таблице и на рисунках представлены в виде средней и ошибки средней (M ± тМ). Статистическая обработка полученных данных и построение графических изображений (гистограммы) осуществлялись с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2010, StatSoft Statistica 12 for Windows. Результаты исследования и обсуждение У тарани в соответствии с периодами жизненного цикла происходят изменения яичников и семенников, которые связаны с присутствием в них определенных комплексов половых клеток, находящихся на разных фазах развития. Стадия II у половозрелых особей начинается после окончания VI стадии (посленерестовый период), т.е. с мая, и продолжается по июнь-июль. Этот процесс может продолжаться до 1,5 месяца. Продолжительность созревания гонад III стадии длится 1-1,5 месяца (до конца августа). Это период активного нагула тарани (летний и осенний нагул). Стадия зрелости IV у самок тарани наступает с октября и продолжается до марта-апреля. Всю зиму яичники находятся в IV стадии зрелости (зимовальный период). Гонады самцов в этот период менее зрелые (стадии III-IV). Ранней весной переход гонад из IV (преднерестовый период) в V стадию совершается быстро, в течение нескольких дней. Затем наступает нерест. Анализ многолетней динамики физиологических показателей тарани свидетельствует об их высокой зависимости от периода жизненного цикла и, соответственно, от стадий зрелости половых продуктов. Средние величины некоторых показателей и их референсные значения приведены в таблице. Многолетние данные по физиологическим показателям тарани в разные периоды цикла [Long-term data on the physiological parameters of roach in different periods of the cycle], M ± тм Показатель [Indicator] Летний нагульный период [Summer feeding period] Осенний нагульный период [Autumn feeding period] Зимовальный период [Wintering period] Нерестовый период [Spawning period] ? ? ? ? Липиды гонад [Gonadal lipids], % * 61,3±1,5 56,7±1, 16,1±0,8 41,2±2,8 9,9±0,5 18,5±0,5 8,6±0,4 21,4±0,4 Референсные значения, [The reference values], % * 42-75 40-69 6-30 28-60 6-14 8-27 5-4 9-35 Липиды печени [Liver lipids], % * 50,4±1,3 50,2±1,1 29,3±2,4 33,7±3,2 19,7±3,6 19,9±5,2 10,1±0,5 10,9±0,8 Референсные значения [The reference values], % * 40-61 43-56 20-50 20-55 11-24 10-32 5-16 5-17 Липиды мышц [Muscle lipids], % * 7,1±1,1 9,2±0,8 8,1±0,5 10,2±0,7 6,3±0,4 9,3±0,6 5,7±0,2 6,0±0,4 Референсные значения [The reference values], % * 5-20 5-13 5-12 7-16 4-11 4-14 3,5-11 4-14 П р о д о л ж е н и е т а б л и ц ы [T a b l e (continuade)] Показатель [Indicator] Летний нагульный период [Summer feeding period] Осенний нагульный период [Autumn feeding period] Зимовальный период [Wintering period] Нерестовый период [Spawning period] 3 ? 3 ? 3 ? 3 Белок гонад, мг/г [Gonadal protein, mg/g] 115±6 64±3 202±7 82±4 217±8 80±5 203±4 84±5 Референсные значения, мг/г [The reference values, mg/g] 65-166 48-104 140-264 59-104 151-284 56-118 131-270 68-121 Белок печени, мг/г [Liver protein, mg/g] 161±6 166±6 156±6 136±8 124±8 149±4 148±3 132±7 Референсные значения, мг/г [The reference values, mg/g] 112-211 127 206 105-206 92-180 92-136 104-157 104-213 91-173 Белок мышц, мг/г [Muscle protein, mg/g] 154±4 148±7 157±5 161±6 156±5 148±6 142±3 144±4 Референсные значения, мг/г [The reference values, mg/g] 119-189 114 183 118-195 122-199 111-200 107-189 102-187 100-189 Количество исследованных рыб, экз. [The number of fish studied, pcs.] 360 270 220 180 180 150 530 380 Белок сыворотки крови, г/л [Blood serum protein, g/l] - - 81,1±5,5 82,0±7,8 - - 65,7±1,4 63,9±1,9 Референсные значения [The reference values, g/l] - - 58,5 110,0 64,1 99,7 - - 45,1 87,2 36,4 87,1 Холестерин сыворотки крови [Blood serum cholesterol], mmol/l - - 10,7±1,3 13,4±1,4 - - 9,0±0,5 8,8±0,6 Референсные значения, г/л [The reference values, mmol/l] - - 5,9-13,1 10,1 15,9 - - 5,4-11,9 4,0-12,1 О к о н ч а н и е т а б л и ц ы [T a b l e (end)] Показатель [Indicator] Летний нагульный период [Summer feeding period] Осенний нагульный период [Autumn feeding period] Зимовальный период [Wintering period] Нерестовый период [Spawning period] ? 3 ? 3 ? 3 ? 3 Липиды сыворотки крови, г/л [Blood serum lipids, g/l] - 2,2±0,1 2,6±0,0,3 - 1,8±0,3 2,0±0,1 Референсные значения, г/л [The reference values, g/l] - - 1,8-3,2 2,0-3,8 - - 0,8-2,4 1,1-2,5 Количество исследованных рыб, экз. [The number of fish studied, pcs.] - - 250 180 - - 320 270 * Содержание жира на сухое вещество [* Fat content per dry substance]. Печень - один из ведущих органов в процессах метаболизма, поэтому кроме показателей обмена мы использовали и такой показатель, как индекс печени. В значительной мере состояние печени определяется экологическим качеством внешней среды, однако эти проблемы в рамках данной статьи не рассматриваются. Важная функция этого органа - синтез и депонирование запасных веществ (белков, липидов, углеводов в виде гликогенов) [2]. Поэтому от количества накопления этих резервных веществ в гепатоцитах зависят и размеры органа. В период нагула у рыб с гонадами IIIII стадии зрелости индекс печени максимальный, так как идет активное питание рыб (1,66% у самок и 1,61% у самцов), различия по полу отсутствуют (р = 0,63). В конце осеннего периода, когда происходят значительные траты на созревание гонад (IV стадия зрелости у самок и III стадия зрелости у самцов), индекс печени уменьшается до 1,21% у самок и 1,29% у самцов, причем здесь не наблюдалось статистически значимых различий в зависимости от пола (р = 0,69). В период зимовки относительные размеры печени минимальные - 1,07% как у самок, так и самцов. Весной перед нерестом отмечается увеличение индекса до 1,36 у самок и 1,39 у самцов, что свидетельствует об активизации деятельности печени (различия по полу отсутствуют, р = 0,22). После нереста, когда тарань начинает питаться, относительные размеры печени увеличиваются. Таким образом, изменения этого показателя не зависят от пола, а определяются периодом жизненного цикла, достигая максимального значения в период активного нагула (рис. 1). Ресурсы, поступающие в организм, идут, с одной стороны, на соматический рост, поддерживающий обмен, и на формирование репродуктивных тканей. Важное место в этом процессе занимают липиды (суммарный жир). У рыб липиды могут находиться в печени, в мышцах, висцеральной жировой ткани; места хранения, так называемые жировые депо, зависят от вида рыб [21, 22]. Содержание липидов у представителей разных видов рыб значительно изменяется по сезонам [23-26]. Особенности и периодичность липидного обмена в значительной степени определяют характер созревания рыб и время вступления их в процесс нереста [27, 28]. Особенно активно используются липиды на заключительной стадии созревания ооцитов [25], а также в период нерестовых миграций [27, 29]. Рис. 1. Индекс печени (%) самок и самцов тарани в разные периоды [Fig. 1. Liver Index (%) of female and male roach in different periods] (M ± тм) Известно, что у особей одного поколения, в организме которых не достигнут определенный уровень содержания резервных органических веществ, ооциты протоплазматического роста (II стадия зрелости) не переходят в период трофоплазматического роста (III стадия зрелости) [30]. При дефиците липидов созревание рыб не только замедляется, в критических ситуациях их половые продукты резорбируются [31-33]. У половозрелой тарани в нагульный период, который охватывает конец весны, лето и осень, происходит интенсивное накопление липидов, и только после этого начинается довольно быстрый гонадогенез. В зиму тарань уходит со сформированными половыми продуктами IV стадии зрелости. Основная часть жировых запасов у тарани сосредоточена в так называемом висцеральном жире, в том числе на поверхности гонад. Жир буквально обволакивает гонады как самок, так и самцов. В нагульный летний период различия в содержании общих липидов в гонадах у самок и самцов невысокие (p < 0,05). По многолетним данным, количество липидов гонад достигает у самок 61,3%, у самцов 56,7%. В конце осеннего периода, когда у самок уже сформированы зрелые гонады (IV незавершенная стадия зрелости), содержание общих липидов снижается до 16,1%. У самцов, у которых в этот период гонады III стадии зрелости, их содержание остается еще высоким - 41,1% (различия по полу статистически значимые, p < 0,0001). В зимний период содержание общих липидов в гонадах снижается до 9,9% у самок и 18,5% у самцов (p < 0,0001). Самое большое падение количества общих липидов отмечается в нерестовый период, когда его запасы у самок истощены (рис. 2). В это время определяется только жир, содержащийся непосредственно в зрелой икре в виде жировой капли (среднемноголетнее значение 8,6%). Референсный диапазон содержания общих липидов в зрелых гонадах самок перед нерестом составляет 5-14%, содержание общих липидов ниже 4% для самок является критическим. У самцов в гонадах содержание липидов высокое (до 21,4%), жир рассредоточен в строме семенников в виде жировых вакуолей. Различия по полу статистически значимые, p < 0,0001. Такие различия являются следствием более высокого темпа накопления в яйцеклетках нелипидных веществ (прежде всего, белков), что сильно увеличивает общее содержание сухих веществ в гонадах, достигающее почти 50% у самок и 25% у самцов. При сравнении содержания общих липидов в гонадах в сезонном аспекте отмечены различия между всеми сезонами. К примеру, для самок по оси «зима-лето» p < 0,0001, «весна-лето» p < 0,0001. Таким образом, различия по содержанию липидов в гонадах тарани зависят как от пола, так и от сезона. Летний период Осенний период Зимний период Весенний период [Summer period] [Autumn period] [Winter period] [Spring period] □ 2 ■

Скачать электронную версию публикации