Diversity of Psychrophilic Colonies and Their Biotechnological Potential.pdf Введение Среди микроорганизмов, способных к росту при низких температурах, выделяют две физиологические группы - облигатные и факультативные психрофилы (иногда называемые психротрофами) [1, 2]. Они различаются по своим экологическим нишам и механизмам адаптации к холоду. Обли-гатно психрофильные микроорганизмы растут при температурах ниже 20 °С (оптимум ниже 15 °С) вплоть до отрицательных значений температур. Факультативные психрофилы способны расти и развиваться при 0 °С с температурным оптимумом от 25 до 30 °C и температурным максимумом около 35 °С. Таким образом, факультативные психрофилы способны расти в условиях, благоприятных для мезофилов [3, 4], при этом осуществляют полный цикл развития при низких температурах [5]. При понижении температуры нормальные процессы жизнедеятельности клеток нарушаются: наблюдается снижение активности ферментов и текучести мембран [6], нарушается транспорт питательных веществ и продуктов метаболизма [7], снижается скорость транскрипции, трансляции и деления клеток, наблюдаются холодная денатурация и сворачивание белка 30 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий [8]. В низкотемпературных экосистемах, как правило, доминируют бактерии [9]. Психрофильные бактерии выработали ряд адаптаций, позволяющих им существовать в подобных условиях. Одной из таких адаптаций является использование ферментов, обладающих высокой удельной активностью при низких температурах. Такие ферменты обычно называются холодоактивными [3]. Возрастающий интерес мирового научного сообщества к психрофиль-ным микроорганизмам связан с их холодоактивными ферментами, которые являются перспективным ресурсом применения в биотехнологии и промышленности. Благодаря высокой каталитической активности при температурах ниже 25 °C, они являются превосходным биокатализатором, не требующим нагревания, что обеспечивает более высокое качество продукции, устойчивость и эффективность промышленных процессов [8]. Помимо активности при низких температурах, интересна также высокая термолабильность холодоактивных ферментов, которая обеспечивает возможность быстрой инактивации этих ферментов путем мягкой термической обработки, что представляет особый интерес в пищевой промышленности [10, 11]. В обзоре мы рассматриваем отдельные рода психрофильных бактерий, существующие мировые тенденции к изучению холодоактивных ферментов, их применение и место в промышленной биотехнологии. Особое внимание уделили биоразнообразию психрофильных бактерий, способных производить промышленно значимые ферменты. Таким образом, основная цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить разнообразие психрофиль-ных бактерий, а также возможность их применения в биотехнологии. Многообразие сред обитания психрофилов Природные экологические ниши психрофилов многочисленны и многообразны. Психрофилы формируют постоянную микрофлору регионов вечного холода, полярных регионов и океанов. Океаны занимают большую часть холодных местообитаний (70%), за ними следуют заснеженные массивы суши (15%), а остальные составляют микроклиматические холодные зоны и антропогенные холодные области [1]. Бактерии данной группы обнаружены в почве, воде или связаны с растениями и животными [12]. В лесных криогенных почвах севера Средней Сибири выявлено преимущественное развитие комплексов психротолерантных бактерий и микро-мицетов [13]. Психрофильные бактерии обнаружены также в высокогорье -альпийских почвах [14]. Из заболоченной почвы тундры выделен первый психрофильный метанотроф Methylobacter psychrophilus (грамотрицатель-ные кокки и диплококки), оптимальная температура его роста составляла 510 °С [15]. В тундре обнаружено метанотрофное психрофильное сообщество бактерий, из которого выделен психротолерантный аэробный гетеротрофный представитель простекобактерий рода Caulobacter [16]. Важным местообитанием психрофильных микроорганизмов являются низкотемпературные водоёмы. Исследования В.В. Парфеновой с соавт. по-31 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology казали, что температурный оптимум роста большинства байкальских бактерий находится в области от 18 до 22°С [17]. Следует подчеркнуть, что пси-хрофилы широко распространены в природе, поскольку они формируют постоянную микрофлору регионов вечного холода. В настоящее время из донных отложений и морских вод Арктики и Антарктики выделено и описано много новых родов психрофилов и психротрофов семейства Flavobacteriaceae [18, 19] и Chryseobacterium [20]. Большинство бактерий, выделенных из морского льда, пигментированы, хорошо адаптированы к холоду, а некоторые способны образовывать газовые пузырьки [4]. Психрофильные микроорганизмы обнаружены в пещерах. Изучение микробиоты пещер Средней Сибири [21] показало присутствие в естественных микробных сообществах психрофильных и психротолерантных бактерий, способных к росту в интервале температур от 3 до 20 и от 3 до 28 °С соответственно. При этом общая численность бактерий в пещерах во многих случаях соответствует численности бактерий и в наземных экосистемах региона или даже превосходит её [22]. В тысячелетних льдах пещеры Скэри-шоара (горы Апусени, Румыния) обнаружены психрофильные бактерии, демонстрирующие широкий спектр устойчивости к противомикробным препаратам и значительную каталитическую активность, являясь, таким образом, ценными кандидатами для биомедицинских и биотехнологических применений [23]. Обнаружение микроорганизмов в древних кристаллических структурах льда свидетельствует о принципиальной возможности явления сверхдлительного анабиоза, о сохранении жизнеспособности древнего поколения без деления в течение продолжительного временного периода [9, 24]. Психротрофы более широко распространены, чем облигатные психро-филы. При температуре 0 °С облигатные психрофилы растут быстрее, что в конечном счете и обеспечивает их доминирование в местах обитания с постоянно низкими значениями температуры [25]. В условиях умеренного климата весной, когда температура поднимается до 25-30 °С, она становится мощным селективным фактором, благоприятным для психротолерантных микроорганизмов и исключающим облигатные формы [26]. В регионах с постоянно низкими температурами психрофильные бактерии играют существенную роль в превращении веществ. В таких условиях деятельность ме-зофильной микрофлоры полностью блокирована низкими температурами, однако благодаря психрофилам круговорот веществ не прерывается [4]. Биоразнообразие психрофильных бактерий Психрофилы не образуют единой или хотя бы нескольких филогенетических групп [1, 27]. Из выделенных и охарактеризованных таксономических групп психрофильных микроорганизмов подавляющее большинство составляют бактерии [4, 12]. Среди них есть палочки, кокки, вибрионы, грамотрица-тельные и грамположительные, образующие споры и не образующие их, строгие аэробы, факультативные и строгие анаэробы [28]. Психрофильные формы обнаружены среди представителей родов Vibrio, Aliivibrio, Pseudomonas, 32 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Alteromonas, Arthobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Nitro-bacter, Nitrozomonas, Micrococcus, Myxococcus, Sorangium, Proteus, Psychro-bacter, Psychromonas, Streptococcus, Flavobacterium, Janthinobacterium и др. [5, 7, 28, 29]. В 1970-е гг. обнаружили фаги психрофильных бактерий, которые в большинстве случаев сами проявляют психрофильные свойства. Выделены фаги, специфичные для грамотрицательных бактерий, в частности, для видов Pseudomonas и некоторых морских бактерий, и для грамположитель-ных (например, Micrococcus cryophilus) [29]. Среди фототрофных микроорганизмов встречаются психрофилы, способные развиваться на поверхности снега или льда. Опубликованы сведения о составе микробного сообщества «красного снега» прибрежного района Восточной Антарктиды, характерная окраска которого обусловлена наличием пигмента астаксантина, накапливающегося в результате роста фототрофных бактерий на поверхности снега, принадлежащих к нескольким таксономических группам Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria [30]. Представители родов Vibrio и Aliivibrio Vibrio - род грамотрицательных бактерий, обладающих формой изогнутой палочки (запятой). Виды вибрионов, обычно встречающиеся в соленой воде, являются факультативными анаэробами, которые дают положительный результат на оксидазу и не образуют спор. Все представители рода подвижны. Они могут иметь полярный или латеральный жгутик с оболочками или без них [31]. H. Urbanczyk et al. продемонстрировали филогенетические и фенотипические отличия группы микроорганизмов от других родов семейства Vibrionaceae и предложили новый род Aliivibrio. Род Aliivibrio включает четыре вида: Aliivibrio fischeri и три психротолерант-ных вида - Aliivibrio salmonicida, Aliivibrio wodanis и Aliivibrio logei [32]. Из дренажного бассейна завода по переработке рыбопродуктов выделен штамм психротрофной бактерии Vibrio rumoiensis с оптимальной температурой активности каталазы около 30 °С. Этот штамм предложено применять для очистки сточных вод с низким энергопотреблением [33]. Aliivibrio salmonicida - грамотрицательная морская бактерия, являющаяся причиной холодноводного вибриоза у атлантического лосося (Salmo salar), трески (Gadus morhua) и иногда радужной форели (Oncorhynchus mykiss). С. Karlsen et al. выделили из суспензии клеток A. salmonicida Pal-подобный белок - липопротеин [34], который можно считать потенциально полезным компонентом при разработке вакцин и исследованиях патогенности в будущем. Недавние исследования доказали, что A. salmonicida может разлагать и метаболизировать хитин [35]. Хитиназная активность бактерий является перспективным источником в качестве потенциального биоинсектицида и биофунгицида [36]. С.А. Хрульнова с соавт. изучили Quorum sensing, регуляцию экспрессии lux-генов и структуру lux-оперона у бактерий Aliivibrio logei, которые являют-33 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology ся психрофилами (растут при 4 °С, и не растут при 30 °С). Эти вибрионы обнаруживаются исключительно в световых органах кальмаров рода Sepiola, обитающих в глубоких и холодных водах Атлантики [37]. Полученные знания в области исследования Quorum sensing позволяют применять их в борьбе с резистентностью антибиотиков по отношению к биопленкам, так как Quorum Sensing действует как механизм, который определяет регуляцию скоординированного поведения бактерий на уровне популяции. Представители рода Pseudomonas Pseudomonas - род грамотрицательных аэробных неспорообразующих бактерий. Представители рода Pseudomonas подвижны и имеют форму прямых или изогнутых палочек и два полярно расположенных жгутика [31]. Они широко используются в хозяйственной практике, для производства антибиотиков, извлечения остаточной нефти из скважин, для борьбы с загрязнением окружающей среды, а также в качестве моделей для многочисленных теоретических исследований [2, 33]. Из пресной воды Антарктики выделен психрофильный штамм Pseudomonas antarctica, который проявляет антимикробную активность за счет содержания кластера генов, кодирующих микроцин В, ингибирующий регуляцию ДНК. Кроме того, P. antarctica может продуцировать пиоцины R-типа, а также содержит полный набор белков для биосинтеза аденозилкобала-мина и, возможно, стимулирует рост растений путем подачи молекул пирролохинолина квионона [38]. В исследованиях S. Kumar et al. задокументирован протеом гималайского психрофильного диазотрофа Pseudomonas helmanticensis и показана его сеть взаимодействия белок-белок при холодовом стрессе [39]. Данные исследования позволяют подробно изучить механизм адаптации психрофильных бактерий к холодовому стрессу, выявить многообещающих кандидатов для изучения эволюции резистомы окружающей среды и получения новых активных биомолекул для борьбы с кризисом антибиотиков и ценных биокатализаторов, активных при низких температурах. Известны случаи обнаружения биокатализаторов, обладающих высокоэффективным и энергосберегающим каталитическим свойством, у адаптивных к холоду бактерий [40]. Y. Luo et al. выделили липазу В68 из Pseudomonas fluorescens, которая имеет большие перспективы применения в производстве биодизельного топлива. Поскольку производство биодизельного топлива осуществляется посредством действия липазы при температуре 35-50 °C, наличие высокоактивной липазы при низкой оптимальной температуре может обеспечить существенную экономию энергопотребления [41]. Такая психрофильная липаза (LIPB68) может представлять собой высококонкурентный энергосберегающий биокатализатор. Представители рода Achromobacter Achromobacter - род бактерий, входящий в семейство Alcaligenaceae порядка Burkholderiales. Клетки представляют собой грамотрицательные 34 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий прямые палочки и подвижны за счет использования от 1 до 20 перитрихи-альных жгутиков. Они строго аэробны и встречаются в воде (пресной и морской) и почве [31]. Из образцов почв, загрязненных органофосфонатами, выделили бактерии Achromobacter sp. MPS 12, Achromobacter xylosoxydans GPK 1 [42] и Achromobacter sp. ВКМ В-2694 [43], способные использовать в качестве единственных источников фосфора глифосфат или метилфосфоновую кислоту. Высокая деструктивная активность изолятов сохранялась при длительном хранении клеток в лиофильно высушенном состоянии, при замораживании до -20 °С [42, 43]. Эти штаммы можно использовать для очистки почвы и поверхностных вод, загрязненных фосфорорганическими соединениями. Представители рода Arthrobacter Все виды рода Arthrobacter - грамположительные облигатные аэробы, которые представляют собой палочки во время экспоненциального роста и кокки в стационарной фазе. Они обитают в почве, илах, подземных пещерах, морских, ледниковых илах, сточных водах, воздушных поверхностях растений, овощах, рыбах и различных видах животных [31]. Некоторые виды являются психрофильными и психротрофными, могут использовать ароматические соединения [44], широкий спектр органических субстратов и не требуют витаминов и других органических факторов роста [45]. Более 600 различных каротиноидов вырабатываются бактериями, водорослями, грибами, растениями и животными. Одним из представителей является психротрофный штамм Arthrobacter agilis, выделенный из морского льда Антарктики, обладающий свойством вырабатывать красный пигмент каротиноид типа С-50 [46]. На сегодняшний день каротиноиды бактериоруберинового типа С-50 выделены только из экс-тремофильных бактерий и нескольких архей, включая виды Halobacterium [47] и Haloferax [48]. Все эти организмы требуют адаптивных механизмов, чтобы справляться с экстремальными условиями окружающей среды и производством бактериоруберина, пигменты могут способствовать такой адаптации. Это наблюдение согласуется с концепцией адаптивной роли бактериоруберинов в стабилизации мембран при низкой температуре [46]. Известен еще один психрофильный штамм Arthrobacter psychro-chitiniphilus ARC 42 ВКПМ Ас-2076, который обладает способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов при температуре от 2,5 до 20 °С, что делает его уникальным и наиболее перспективным в использовании для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами [49]. Штаммы рода Arthrobacter активно применяются не только как деструкторы нефти и нефтепродуктов, а также в разложении гербицидов. Их использование способствует более эффективному усвоению элементов минерального питания из почвы и удобрений, усиливает ростовые процессы, защищает от бактериальных и грибковых инфекций, повышает толе-35 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology рантность растений к неблагоприятным факторам среды и увеличивает продуктивность посевов [50]. Выделенный из почвы штамм Arthrobacter sp. метаболизировал диурон при температуре 18 °С, что говорит о его пси-хротолерантных свойствах. Преобразование диурона в различных концентрациях являлось более эффективным в присутствии альтернативных источников углерода и азота [51]. Представители рода Pseudoalteromonas Pseudoalteromonas представлен многочисленными морскими видами гетеротрофных грамотрицательных жгутиковых бактерий. В 1995 г. G. Gauthier et al. предложили выделить Pseudoalteromonas в качестве нового рода, который следует отделить от Alteromonas. Представители этого рода производят ряд соединений, активных против различных организмов-мишеней, которые могут принести большую пользу клеткам Pseudoalteromonas в их конкуренции за питательные вещества и колонизации поверхностей [52, 53]. Ферменты психрофильных микроорганизмов характеризуются не только выраженной термолабильностью, но и высокой удельной активностью при низких и умеренных температурах. Психрофильная а-амилаза, выделенная из Pseudoalteromonas haloplanktis, имеет в семь раз более высокие значения скорости реакции при 4 °C, чем один из ее мезофильных аналогов. В теории теплостойкость, а также высокая удельная активность являются следствием повышенной молекулярной гибкости, требующей в качестве компенсации снижения скорости реакции при низких температурах [54]. Из-за своей высокой удельной активности при низких температурах психрофильная а-амилаза представляет большой потенциальный интерес применения в промышленных процессах, таких как производство моющих средств, пивоварение и выпечка [55]. Проведены исследования, направленные на изучение свойств фермента щелочной фосфатазы, выделенной из психрофильной бактерии Pseudo-alteromonas undina. Согласно полученным данным, щелочная фосфатаза, выделенная из P. undina P2, является термолабильным ферментом и может быть использована в молекулярной биологии для удаления концевых фосфатных групп из молекул нуклеиновых кислот [56]. Представители рода Bacillus Bacillus - род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры, являются аэробами или факультативными анаэробами, большинство представителей - хемоорганогетеротрофы. Некоторые виды способны к нитратредукции [31]. Бактерии рода Bacillus, выделенные из почвы и воды, продемонстрировали оптимальную температуру роста от -4,5 до 30 °С [57]. Психрофиль-ный фермент аланинрацемазы, выделенный из Bacillus psychrosaccharolyti-cus, обладает более высокой каталитической активностью, чем соответствующий термофильный фермент при высоких температурах [58]. 36 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий В последнее время большой научный интерес направлен на изучение и образование бактериями наночастиц различных металлов. Все процессы биосинтеза наночастиц золота, о которых сообщалось до настоящего времени, использовали температуру более 20 °С [59]. Однако в 2020 г. K.R. Das et al. провели исследования психротолерантного штамма Bacillus sp. GL1.3, который может внеклеточно синтезировать наночастицы золота размером 30-50 нм при температуре 4 °С. Эти наночастицы обладают анти-SRB-эффектом в зависимости от дозы, что может быть полезно для профилактики различных заболеваний, вызванных сульфатредуцирующими бактериями (SRB) [60]. Наночастицы золота обладают огромным потенциалом в различных областях биомедицины, иммунологии, для очистки от загрязняющих веществ и различных промышленных применений. Изучение влияния метаболитов Bacillus sp. М3, выделенного из многолетнемерзлых пород, на уровень секреции мононуклеарами про- (ФНО-а, ИЛ-1Р, ИЛ-8, ИЛ-2, ИФН-ү) и противовостпалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов как показателей иммунологической реактивности, представляется актуальным в перспективе создания новых иммунотропных препаратов [61]. Представители рода Clostridium Бактерии рода Clostridium - грамположительные облигатные анаэробные спорообразующие бактерии, у которых размер споры превышает поперечник клетки, и поэтому они принимают форму веретена, теннисной ракетки или булавки [31]. Clostridium принимают участие в круговороте веществ в природе. Благодаря спорообразованию они способны длительно выживать, а при определенных условиях - вегетировать в объектах окружающей среды [62]. Существуют случаи выделения психротрофных микроорганизмов рода Clostridium, которые не являются токсичными для человека, однако имеют огромное экономическое влияние на мясную промышленность. J. Wambui и R. Stephan выделили Clostridium estertheticum из вакуумно упакованного мяса. Авторы в своей работе предполагают, что именно этот микроорганизм является причиной «взрыва вакуумной упаковки с мясом», так как порча продукта происходит без нарушения температурного режима [63]. C. estertheticum предлагается применять для обнаружения порчи мясной продукции с целью предотвращения взрыва вакуумной упаковки [64]. В 2022 г. зафиксированы результаты эксперимента, показывающие, что C. estertheticum производит стабильные бактериоцины, обладающие активностью против клинически значимых патогенов [65]. Описано несколько психрофильных клостридий в Антарктических микробных матах с температурным оптимумом роста в диапазоне 4-16 °С, способных ферментировать глюкозу, фруктозу, инулин и ксилозу [66]. Психрофильные бактерии продуцируют различные соединения, чтобы защитить себя от внутриклеточного замерзания или свести к минимуму вредное воздействие формирования кристаллов льда. Один из механизмов -37 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology это образование антифризных белков [67]. Антифризные белки считаются перспективным биотехнологическим продуктом для применения в медицине и пищевой, косметической, топливной и других отраслях промышленности [68]. Штамм Clostridium tagluense А121 образует антифризные белки, за счет генома кодирущего четыре гена белков холодового шока, которые действуют как шапероны для мРНК во время холодового шока [69]. Одним из важных способов выживания бактерий считается образование внутриклеточных полимерных веществ (полисахаридов, липидов, полифосфатов) [1]. Известно, что Clostridium algoriphilum обладает свойством накапливать полисахарид в клетке. Предполагается, что полисахарид бактерии C. algoriphilum не только напрямую участвует в биохимических реакциях, но и может способствовать образованию оптимальной цитоплазматической вязкости для низкотемпературного протекания биохимических реакций. Это в конечном итоге приводит к выживанию C. algoriphilum в условиях криопэга (подземные природные засоленные воды, имеющие отрицательную температуру) [70]. Представители рода Micrococcus Micrococcus - род сферических бактерий семейства Micrococcaceae. Бактерии рода Micrococcus имеют грамположительные сферические клетки диаметром примерно от 0,5 до 3 мкм и обычно появляются тетрадами. Они каталазоположительны, оксидазоположительны, индолотрицательны и цитратотрицательны [31]. Все микрококки содержат «животный крахмал» гликоген, который выполняет роль запасного вещества клетки. У большинства видов оптимум температуры роста 25-30 °С. Многие виды микрококков могут развиваться при 5-8 °С [71]. На китайской станции Great-Wall в Антарктиде, выделен адаптированный к холоду Micrococcus antarcticus (штамм T2T), сохраняющий жизнеспособность при 0 °С с оптимальной температурой роста 16 °C, гидролизующий крахмал и твин (20, 40, 80) [71]. Из M. antarcticus выделили адаптированную к холоду амилазу, которая показала устойчивость к инактивации 0,1% неионогенных поверхностно-активных веществ, таких как твин 80, тритон X-100 [72]. Представители рода Psychrobacter Psychrobacter - род грамотрицательных, осмотолерантных, психро-фильных или психротолерантных аэробных бактерий, принадлежащих к семейству Moraxellaceae и классу Gammaproteobacteria. Форма представлена в виде кокков и коккобацилл [31]. E. Juni и G. Heym описали род Psychrobacter для размещения грамотрицательных, кокковых или палочковидных бактерий, обладающих строго окислительным метаболизмом, которым не хватало подвижности [73]. Известно, что бактерии рода Psychro-bacter являются облигатными или факультативными психрофилами и изо-38 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий лированы из широкого спектра мест обитания, включая пищу, клинические образцы, кожу, жабры и кишечник рыб, морскую воду в Антарктике, Антарктический морской лед и отложения Японских впадин [74]. Антарктическая морская бактерия Psychrobacter proteolyticus выделена из желудка антарктического криля (Euphasia superb). P. proteolyticus свойственно выделять адаптированную к холоду внеклеточную металлопротеиназу [75]. Известно, что металлопротеиназы - это цинк-зависимые эндопептидазы, способные разрушать все типы белков внеклеточного матрикса [76]. Соответственно, P. proteolyticus могут применяться в биотехнологии и медицине, так как метапротеиназы играют большую роль в ремоделировании тканей, ангиогенезе, пролиферации, миграции и дифференциации клеток, апоптозе, сдерживании роста опухолей [77]. Psychrobacter namhaensis можно рассматривать в качестве кормовой добавки, так как получены положительные результаты исследования по оценке эффективности в отношении показателей роста и иммунного ответа нильской тиляпии (Oreochromis niloticus) [78]. Представители рода Psychromonas Бактерии рода Psychromonas принадлежат к классу Gammaproteo-bacteria и являются психрофильными, аэротолерантными анаэробами. Клетки представляют собой грамотрицательные неподвижные крупные палочки длиной 6-14 мкм и шириной 1,25-1,5 мкм, встречающиеся поодиночке или парами [79]. На сегодняшний день описаны пятнадцать видов рода Psychromonas [80-81]. Штамм Psychromonas ingrahamii 37Т изолирован из морского льда недалеко от Пойнт-Барроу (Аляска). P. ingrahamii - грамотрицательная бактерия палочковидной формы, восстанавливает неорганические нитраты и является гетеротрофом, использующим многие органические соединения в качестве источников углерода. Показано, что P. ingrahamii растет при температуре ниже точки замерзания (самая низкая температура роста среди всех изученных до сих пор организмов) -12 °С со временем генерации 240 ч [79]. Из психрофильной бактерии P. ingrahamii выделена нуклеаза (PinNuc), обладающая способностью расщеплять различные формы нуклеиновых кислот. Этот фермент содержит шесть цистеиновых остатков, наиболее вероятно, что все они связаны с дисульфидными мостиками [81]. Психрофильная бактерия Psychromonas arctica также выживает при отрицательных температурах, адаптировав несколько защитных механизмов против замерзания, активировав белки холодового шока (Csp). Первые исследования белков холодового шока в основном изучали на Csp мезофиль-ной бактерии Escherichia coli [82], а не на психрофильных бактериях. В дальнейшем предприняли попытки понять молекулярные механизмы психрофильных бактерий, которые позволяют им выдерживать замораживание. Y.H. Jung et al. клонировали ген, кодирующий белок холодового шока CspA(Pa), из P. artica KOPRI 22215 и сверхэкспрессировали его в E. coli, это вызвало морфологическое удлинение и замедление роста кле-39 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology ток. Интересно, что сверхэкспрессия CspA(Pa) в E. coli, резко увеличила холодостойкость хозяина более чем в десять раз, что говорит о том, что этот белок способствует выживанию в полярных условиях [83]. Представители рода Flavobacterium Flavobacterium - это род грамотрицательных, неподвижных и подвижных палочковидных бактерий, который состоит из 130 признанных видов. Представители рода Flavobacterium широко распространены в почве и воде; обнаружены также в сыром мясе, молоке и других пищевых продуктах [31]. Психрофильные формы микроорганизмов рода Flavobacterium в основном являются представителями антарктической флоры, такие как F. gillisiae, F. degerlachei, F. frigoris, F. xinjiangense, F. xanthum, F. om-nivorum, F. frigidarium, F. gelidilacus, F. limicola, F. tegetincola, F. micromat, F. Hibernum, F. psychrophilum, F. fryxellicola и F. psychrolimnae [3, 4, 8, 84]. Flavobacterium limicola имеет диапазон температур роста от 0 до 25 °C, при этом оптимальный рост происходит при 15-20 °C. F. limicola способны гидролизовать казеин, желатин, крахмал, агар, эскулин, мочевину, мочевую кислоту и тирозин, а также лизировать клетки Escherichia coli и Pseudomonas putida. Интересен тот факт, что для F. limicola характерно увеличение секреции протеазы по мере снижения температуры [84]. F. limicola является перспективным источником холодоактивной протеазы, которая в теории может использоваться в специфических биотрансформациях и биоремедиациях окружающей среды [85]. В 2002 г. из фекалий антарктических пингвинов выделен Flavobacterium faecale WV33(T), обладающий агаразной активностью при 16 °C [86]. В ходе скрининга психрофильных микроорганизмов, выделенных из загрязненной нефтью арктической почвы, обнаружили бактериальный штамм, обладающий свойством разлагать дизельное топливо, для которого предложили название Flavobacterium petroe [87]. Из психрофильной бактерии Flavobacterium sp. YS-80-122 выделен новый фермент - і-каррагеназа (CgiF), который проявляет холодоактивные и термоустойчивые свойства. Холодовая адаптация и термоустойчивость делают его отличным кандидатом для промышленного применения в производстве олигосахаридов і-каррагена из полисахаридов морских водорослей [88]. Психрофильные метанотрофные микроорганизмы Метанотрофы - уникальная группа микроорганизмов, способных использовать метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Окисление метана осуществляется ими как в аэробных, так и в анаэробных условиях [89]. Чистые культуры психрофильных и психротолерантных метанотрофов выделены и охарактеризованы как новые роды и виды: Methylobacter psychrophilus, Methylosphaera hansonii, Methylocella palustris, Methylocella silvestris, Methylocella tundrae, Methylocapsa acidiphila и Methylomonas scandinavica [90]. 40 Сидоренко М.Л., Русакова Д.А Разнообразие психрофильных бактерий Систематические исследования метанотрофов психросферы привели к выделению из тундровой почвы первого психрофильного метанотрофа Methylobacter psychrophilus [91]. M. psychrophilus растет при температурах от 3,5 до 20 °С, оптимально при 5-10 °С. Согласно проведенному полному генетическому анализу, штамм M. psychrophilus SPH1T обладает геномным потенциалом для биосинтеза гопаноидов, который необходим для поддержания внутрицитоплазматических мембран [92]. И.Ю. Ошкин с соавт. (Oshkin et al.) выделили из антарктических озер 8 штаммов метанотрофных микроорганизмов, описанных в качестве нового вида Methylosphaera hansonii. Клетки M. hansonii представлены неподвижными крупными кокками, ассимилирующими углерод по рибулозомоно-фосфатному пути. Штаммы M. hansonii являются психрофильными, с оптимальной температурой роста 10-13°C и максимальной 16-21 °С [93]. Также сообщалось о способности M. hansonii к биосинтезу специфических 4,4-диметилированных и 4-метилированных стеролов [94]. Биосферная роль представителей психрофильных метаногенов намного превосходит таковую у термофилов, так как именно холодовые экосистемы являются основными источниками метана, поступающего в атмосферу Земли, однако метаболизм и механизм регуляции активности метанотро-фов холодных экосистем остаются мало изученными [93]. Заключение Обзор литературы свидетельствует о том, что в настоящее время облигатные и факультативные психрофилы (психротрофы) и их холодоактивные ферменты представляют научный интерес во всем мире. Существенная часть исследований носит общее понимание распространения психро-фильных бактерий и локальное изучение ферментативной активности. В данном обзоре мы рассмотрели разнообразие промышленно значимых психрофильных бактерий, структурируя их по родам. Разнообразие психрофильных бактерий широко. Среди них встречаются представители различных родов и видов, которые представлены палочковидными и кокковыми формами, образующие споры и не образующие их, грамотрицательные и грамположительные, строгие аэробы, факультативные и строгие анаэробы. Обнаружены также фаги психрофильных бактерий. Реакция бактерий на снижение температуры имеет общие черты. Однотипность реакции на действие холода самых разных видов и родов бактерий подтверждается данными, приведенными в вышеизложенном материале. Холод индуцирует гены холодового шока, в результате этого происходят значительные изменения в регуляции синтеза белков, подавляется синтез основных белков микробной клетки. Однако синтезируется множество новых белков - белков холодового шока. В настоящее время холодоактивные ферменты имеют огромное значение. Эффективность применения в промышленности таких холодоактивных ферментов, как липаза, амилаза, протеаза, эстераза, фосфатаза, рас-41 Биотехнология и микробиология / Biotechnology & Microbiology смотрена во многих работах. Эти ферменты активно используются в производстве бытовой химии, сельском хозяйстве, фармацевтике и других отраслях народного хозяйства. Скрининг новых микроорганизмов и их холодоактивных ферментов открывает новые и более простые пути для синтетических процессов. Следовательно, это может дать новые решения биотехнологических и экологических проблем.

Скачать электронную версию публикации