Influence of physiological activity substanceson growth and level of triterpenoid saponins and flavonoides Atragene speciosaWeinm. cell cultures .pdf Княжик сибирский (Atragene speciosa Weinm.) - многолетняя лиана флоры Сибири. Необходимость введения этого вида в асептическую культуру in vitro обусловлена возможностью получения физиологически активных веществ (тритерпеновых гликозидов - сапонинов, фенолоспиртов и их гликозидов, флавоноидов) для создания в дальнейшем ноотропного и адаптогенного фитопрепарата. Atragene speciosa Weinm. - вид с азиатским ареалом, природные заросли которого разрежены и занимают небольшие площади, а интродукция, в связи с морфологическими особенностями стебля, затруднена.Важным моментом при культивировании клеточных культур является оптимизация продукционного процесса добавлением в питательную среду физиологически активных соединений, в том числе гормонов. При этом особое внимание уделяется регуляторам роста (жасмоновая кислота, 24-эпибрас-синнолид, гуминовые кислоты и др.).Статья В.Ю. Дорофеева, Р.А. Карначук, И.В. Шиловой «Элементный состав клеток кал-лусной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro», опубликованная в Вестнике Томского государственного университета. Биология. 2008. № 2 (3) (С. 1217), написана по материалам исследований, поддержанных грантом ФЦНТП (Государственный контракт № 02.512.11.2220 от 4 июля 2008 г.).Жизнеспособность культуры устанавливали по стандартной методике путём окрашивания клеток метиленовым синим [3]. Количество клеток считали в камере Фукса-Розенталя [4].Микроскопический анализ крупноагрегированной суспензии проводили после мацерации в смеси 0,2% целлюлазы и 0,2% пектиназы (1:1) в течение 1 ч при 26°С. Для получения изотонического раствора добавляли маннит (90 г/л) и СаС12 (1,480 г/л). Измеряли размеры клеток для определения их объёма [5].Результаты и их обсуждениеПереход к суспензионным культурам вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых процессов, а в ряде случаев увеличивается биосинтетический потенциал культур. Суспензионные культуры сохраняют ряд свойств, характерных для исходного организма. Одним из таких свойств является способность к синтезу вторичных метаболитов [6, 7].Поскольку суспензионная культура клеток этого вида получена впервые, начальным этапом работы была оптимизация условий выращивания, изучение её цитологических и физиологических характеристик, в частности размера клеток, агрегированности, скорости роста суспензии, оптимального времени субкультивирования. По мере увеличения количества пассажей улучшались ростовые характеристики суспензионной культуры, сокращалось время максимального накопления массы клеток, увеличивалась концентрация и повышалась жизнеспособность культуры (табл. 1).Клеточная культура княжика сибирского способна как в каллусе, так и суспензии синтезировать тритерпеновые гликозиды и флавоноиды в условиях in vitro. В каллусной культуре клеток обнаружено содержание тритерпеновых сапонинов (1,19±0,02 г на 100 г сухой массы; для сравнения: в надземной части дикорастущего интактного растения - 1,00±0,01 г).Количество флавоноидов дикорастущего княжика сибирского: в листьях -6,09; в стеблях - 1,64%; в корнях - 0,83%; в надземной части растения в период цветения и плодоношения - 0,26% [8]. Максимальное содержание фла-воноидов (5,15%) в каллусной культуре со 2-го по 6-е субкультивирование сопоставимо с их количеством в листьях интактного растения (6,09%), что позволяет говорить о сохранении способности к накоплению данных соединений в культуре in vitro.Проведены исследования по влиянию ЖК на рост клеток в условиях твёрдой и жидкой питательных сред. Установлено, что ее концентрация 10-9 М приводит к снижению ростовых показателей каллусной культуры (табл. 2). Начиная с 17-х суток проявлялся ингибирующий эффект во всех диапазонах концентраций, что приводило к снижению прироста биомассы каллуса в конце субкультивирования (рис. 1). Жасмоновая кислота (при концентрации 10-6 и 10-9 М) оказывала ингибирующий эффект на клеточную суспензию 5-го и 6-го субкультивирований княжика сибирского (табл. 3).2Ооgю3 огЬгЬ•·контроль•·ЖК 10-7M•ЖК 10-8M•ЖК 10-9M□□81727Возраст культуры, сутРис. 1. Динамика роста клеточной культуры Atragene speciosa Weinm. 70-го субкультивирования с жасмоновой кислотой. * Различия достоверны с контролем при р < 0,05Т а б л и ц а 3Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene speciosa Weinm. на среде с жасмоновой кислотой (среднее значение ± m)В последние годы внимание исследователей привлекает такой регулятор роста, как эпибрассинолид (ЭБ) - класс фитогормонов с широким спектром биологической активности [9]. Существует сравнительно немного данных по исследованию действия ЭБ на культуры тканей растений, причем эффекты, как правило, противоречивы [10-12]. В экспериментах на культуре A. speci-osa было исследовано действие ЭБ в широком диапазоне концентраций. Только в концентрации 10-9 М ЭБ существенно влиял на рост каллуса и суспензионной культуры (табл. 4, 5). Добавление в среду ЖК и ЭБ в концентрации 10-8 М также стимулировало образование высокополярных тритерпеновых сапонинов. В суспензионной культуре княжика сибирского десятого субкультивирования обнаружено восемь высокополярных сапонинов.Т а б л и ц а 4Ростовые характеристики каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. 5-го субкультивирования на среде с 24-эпибрассинолидом (среднее значение ± m)Параметры ростаВарианты выращиванияв колбахв пробиркахКонтроль I ЭБ, 10-9 MКонтроль I ЭБ, 10-9 MИндекс роста Сухая масса, мг2,44±0,023,67±0,213,65±0,032,65±0,37 4,76±0,075,31±0,23 | 3,76±0,21 | 7,53±0,24* Различия достоверны с контролем при р < 0,05.Т а б л и ц а 5Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene speciosa Weinm. на среде с 24-эпибрассинолидом (среднее значение ± m)Концентрация10-9ЭБ, М1,58±0,072,04±0,03 5,22±0,052,56±0,12* 2,44±0,09* 5,84±0,13*6,17±0,11*1,57±0,05 1,63±0,02* 3,87±0,11* 4,35±0,09*,,. 5,71±0,02 .10-6

Скачать электронную версию публикации